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利用转基因技术和基因编辑技术改良小麦进展  PDF

  • 于美 ✉
  • 唐华丽
  • 叶兴国 ✉
中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081

最近更新：2023-01-12

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20220809001

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摘要

小麦籽粒营养丰富，其面粉可制作成多种食品，是全球超过三分之一人口的主食。随着病虫害加重、环境恶化（干旱、高温、盐碱）等生物和非生物逆境的影响，全球小麦安全生产受到的威胁越来越大。为保障全球粮食安全供给和人民生活对优质产品的需要，提高小麦产量和改进小麦品质仍将是重要的育种目标，要求不断创新育种技术和种质资源。近10年来，转基因和基因编辑等生物技术发展迅速，逐步在小麦改良中发挥重要作用。建立了小麦高效遗传转化体系和基因编辑体系，利用农杆菌转化模式基因型的转化效率50%以上，利用CRISPR/Cas9编辑部分基因的编辑效率40%~70%，利用再生相关基因基本克服了转基因和基因编辑研究中基因型的依赖性。通过转基因和基因编辑改良了小麦抗病性、抗逆性、特性品质、产量潜力和生长发育等多个性状，创制了抗白粉病、条锈病、赤霉病、花叶病毒病、穗发芽，以及耐旱、耐盐、低醇溶蛋白、高谷蛋白、高千粒重和雄性不育系、单倍体诱导系等小麦新材料，丰富了小麦种质资源。本研究旨在综述小麦转基因和基因编辑的最新研究进展，并探讨目前研究中存在的问题和可能的解决途径。

小麦是一种适应性强、分布广泛的粮食作物，籽粒中含有淀粉、蛋白质、脂肪、矿物质、钙、铁、硫胺素、核黄素、烟酸及维生素A等多种物质，营养价值较高，其独特的面筋特性可以用来制作多种面食，是全球35%~40%人口的主食。同时，小麦还是最重要的贸易和国际援助产品。但在以种植小麦为主的温带地区，病虫害流行和灾害性天气频发等生物和非生物胁迫因素造成每年数百万吨小麦产量的损失，需要利用新型生物技术培育抗病性和抗逆性强的优质、高产小麦品种［

1］。转基因和基因编辑分别是近30年和近10年来发展起来的生物育种技术，利用转基因技术培育了具有抗除草剂、抗虫等性状的转基因玉米、大豆、棉花和油菜新品种，自1996年以来在全球大面积种植，产生了巨大的经济效益和社会效益［2］；培育的黄金大米转基因水稻，富含维生素，营养价值高，对于解决非洲、亚洲一些国家和地区人口的饥饿问题将具有重要的应用价值。利用基因编辑技术培育的抗褐化苹果和马铃薯等品种已在部分国家获得了田间种植许可，显示出良好的商业化前景［3］。小麦作为一种六倍体作物，基因组庞大，DNA重复序列和基因拷贝数较多，组织培养再生性能较差，导致转基因研究和基因编辑研究落后于二倍体农作物。进入21世纪后，逐步建立了小麦高效遗传转化体系和基因编辑体系，转化效率和编辑效率显著提高，减弱了基因型的依赖性，对很多控制重要性状的基因进行了遗传修饰，创制了一批具有潜在育种价值和研究价值的新材料。

1 小麦遗传转化技术体系建立

1.1 小麦遗传转化主要方式

自20世纪末期开始，人们尝试利用多种转化方法和多种外植体转化小麦。转化方法主要包括基因枪、农杆菌、花粉管通道、超声波、离子束注入、激光微束穿刺和聚乙二醇（PEG，polyethylene glycol）等方法，其中，1993年Vasil等［

4］首次利用基因枪转化小麦幼胚获得了转基因植株，1997年Cheng等［5］首次利用农杆菌转化小麦幼胚获得转基因植株，这2例报道是小麦转基因技术研究的经典事件。虽然利用花粉管通道、离子束注入、激光微束穿刺、农杆菌植株水平侵染或籽粒水平侵染等方法也获得了转基因植株，但对转基因植株检测的证据不够充足，试验的可重复性比较差，已经被逐步放弃。已成功利用基因枪和农杆菌转化小麦的外植体包括幼胚、成熟胚、花药愈伤组织和幼穗等，幼胚的再生能力最强，适宜的取样时期比较容易掌握，因此，目前的转基因小麦研究广泛采用幼胚作为受体组织。与幼胚相比，小麦成熟胚取材方便，转化操作不受种植条件和生长时期的限制，所以，利用农杆菌或基因枪转化小麦成熟胚一直受到研究者们的关注，并获得了转基因植株［6］。

总体而言，农杆菌介导法相比基因枪介导法具有一些独特的优势，如操作简单、成本较低、目标基因基因整合的拷贝数较少、T-DNA插入位点能够明确、生物安全性较高等。而基因枪介导法可以转化细胞器，并能够将RNA、蛋白质、纳米颗粒、染料和DNA复合物输送到细胞中。两种转化方法都存在基因型的依赖性，但农杆菌转化对基因型的依赖性更强，因为不同小麦品种具有不同的再生能力和对农杆菌感染的反应能力［

7］。在优化农杆菌和基因枪转化体系的同时，筛选出多个相对容易转化的小麦基因型，如Bobwhite、Veery、新春9号、CB037、科农199等［8-10］。近10年来，小麦转基因研究绝大部分利用农杆菌转化方法进行，转化效率3%~20%，基因枪主要用于亚细胞定位和瞬间表达等研究。例如，Hayta等［11］基于Fielder建立和优化了农杆菌转化小麦幼胚可重复性的转化体系，转化效率达25%，认为健康生长的供体植株（生长期间不施用农药）、适宜发育时期的幼胚、离心预处理、Gelzan凝固剂类型、较长的共培养时间（3 d）、hpt筛选标记、actin启动子等是提高转化效率的主要因素。

1.2 PureWheat高效转化技术和应用

进入21世纪后，日本烟草公司利用春小麦品种Fielder幼胚建立了农杆菌介导的PureWheat高效转化体系［

12］，即利用农杆菌转化经离心处理的小麦幼胚（大小2.5~3.0 mm，室温下侵染5~10 min），依次经过共培养（23 ℃，黑暗）、恢复培养（25 ℃，黑暗）、筛选培养（培养基中添加5~10 mg/L草丁磷或25~40 mg/L潮霉素，25 ℃，黑暗）、分化培养（培养基中添加5 mg/L草丁磷或25 mg/L潮霉素，25 ℃，光照）和壮苗培养（培养基中添加5 mg/L草丁磷或25 mg/L潮霉素，25 ℃，光照），获得小麦转基因植株，转化效率50.0%~90.0%。保证母体植株在温和的环境条件下生长，采用较大体积且完整无伤口的幼胚，侵染前对幼胚进行离心处理，共培养后及时切除幼胚的胚轴，愈伤组织诱导阶段变化培养基中生长素组合和浓度等，这些因素是利用PureWheat技术获得转基因小麦植株的关键环节［12］。

利用PureWheat技术，Richardson等［

10］转化了源自澳大利亚、美国、加拿大和墨西哥的几个普通小麦品种和硬粒小麦品种，普通小麦品种Gladius、Westonia和Fielder转化效率25.0%~32.0%，Janz、Pastor、Sunstate、Bobwhite26、Frame、Gascoigne和Sunvale转化效率0~9.0%；硬粒小麦品种Stewart和Kronos转化效率26.0%~51.0%。通过对PureWheat技术的引进和细微改进，本实验室转化Fielder和CB037的转化效率分别达53.0%和37.7%，并成功转化了另外15个商业小麦品种，转化效率2.7%~37.7%，显著拓展了基因型的范围［9］。由于利用PureWheat技术可以大幅度提高Fielder、Gladius等模式易转化小麦基因型的转化效率，能够大量获得候选转基因植株，所以共培养后在不添加筛选剂的培养基上诱导愈伤组织和再生植株，就可以获得无筛选标记的转基因植株［10］。

1.3 利用再生相关基因克服基因型依赖性

在模式植物中的研究表明，植物生长发育调节因子SERK（Somatic embryogenesis receptor-like kinase）、WUS （Wuschel）、LEC1（Leafy cotyledon1）、NiR（Nitrite reductase）和AGP（Arabinogalactan-protein）等可以促进体细胞胚胎发生和再生芽分化，提高植株再生效率［

13］。尤其是利用玉米来源的转录因子基因BBM（Baby boom）和WUS2（Wuschel2），不但显著提高了玉米的转化效率，而且显著提高了水稻、甘蔗和高粱等植物的转化效率［14-15］。但是，BBM和WUS2在细胞中的表达影响愈伤组织分化和根系生长，T-DNA整合完成后需要利用诱导型启动子介导的特殊处理和Cre/LoxP系统及时从愈伤组织的基因组中移除BBM和WUS2基因，操作过程比较复杂。相对于模式植物，小麦属于再生比较困难的物种，再生和转化的基因型依赖性比较强，绝大多数优良品种不易获得转基因植株，需要利用再生基因提高转化效率。

生长调节因子（GRF，growth regulation factor）蛋白具有两个高度保守的结构域QLQ和WRC，分别介导蛋白质间以及与DNA的相互作用，GRF在植物体内可与辅助因子（GIF，GRF-interacting factor）互作。Debernardi等［

16］在小麦中鉴定到了与水稻GRF4同源的蛋白，同时选择与拟南芥和水稻GIF1亲缘关系最近的1个GIF1，构建GRF4-GIF1融合基因表达载体转化不同硬粒小麦品种，转化效率9%~96%（平均65%），并加快了转化后的植株再生进程，使硬粒小麦的转化时间从91 d缩短到56 d。进一步发现，利用GRF4和GIF1显著增加了再生植株的数量，转化后的幼胚组织在只添加细胞分裂素、不添加筛选剂的培养基上培养就可以获得无筛选标记转基因植株［16］。另外发现，过表达GRF4-GIF1嵌合蛋白不仅能够显著提高硬粒小麦的转化效率，还提高了柑橘、葡萄和水稻等植物的转化效率［16］。

中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室经过多年探索，在小麦中鉴定到了1个与植株再生相关的转录因子基因TaWOX5（Wuschel related homeobox 5），通过将该基因与PureWheat技术结合用于小麦转化，几乎提高了所有参试小麦品种的转化效率，不但显著提高了Fielder、CB037和科农199等易再生小麦基因型的转化效率，而且提高了济麦22、郑麦7698、苏麦3号和中国春等多个难再生小麦推广品种或重要种质资源的转化效率，尤其成功转化了宁春4号、矮抗58、西农979等难转化的明星小麦品种，转化效率提高了2~10倍。TaWOX5基因的应用基本克服了小麦未成熟胚转化中基因型依赖性的问题［

17］。另外发现，TaWOX5对小麦愈伤组织分化和再生植株根系生长没有明显影响，其宽叶表型有利于转基因植株的直观识别，以及无筛选标记转基因植株的快速鉴定［17］。共表达TaWOX5和可视化标记时的瞬间转化效率与稳定转化效率一致，表明在利用TaWOX5时小麦的转化效率主要取决于农杆菌侵染效率［17］。进一步发现，利用TaWOX5基因也能提高黑麦、硬粒小麦、六倍体小黑麦和玉米的转化效率，首次获得了栽培一粒小麦转基因植株，并建立了栽培一粒小麦的转化体系［17］。

2 小麦基因编辑技术体系建立

随着基因组测序技术的发展，克隆植物基因已经变得容易，利用基因编辑技术可实现对重要基因的精准调控，明确其功能并创造有应用价值的种质资源。基因编辑技术经历了3个发展阶段，包括锌指核酸酶（ZFNs，zinc finger nucleases）、类转录激活因子效应物核酸酶（TALENs，transcription-like activator effector nucleases）和CRISPR/Cas9（Clustered regularly interspaced short palindromic repeats CRISPR associated nuclease 9），编辑效率不断提高，脱靶率逐步降低，可操作性逐步简化。

2.1 ZFN编辑技术

ZFN是第一代基因编辑技术，由1个锌指蛋白的DNA结合域和1个核酸内切酶FOKⅠ的裂解区域融合而成。DNA复合结构域由多个锌指蛋白串联而成，每个锌指蛋白可以识别3个连续的碱基。多个锌指蛋白串联后，可以识别9~18 bp的特定核苷酸序列。ForkⅠ核酸酶仅在二聚体状态下有活性，在切割双链DNA产生双链断裂（DSB，double strand break）时需要在靶点的两侧设计1个ZFN。当两个ZFN结合时，ForkⅠ可以形成二聚体，以切断靶点的DNA序列［

18］。目前，该技术已成功应用于玉米、水稻、大豆、油菜、拟南芥和烟草等。在小麦中，Ran等［19］首次应用ZFN介导的非同源末端连接（NHEJ，non-homologous end joining）定向编辑小麦中的乙酰羟基酸合酶编码序列，通过特定单个氨基酸的改变赋予了小麦对咪唑啉酮除草剂的抗性。ZFN载体的设计和构建难度大、耗时长、成本高，该技术在作物基因编辑中的应用受到限制。

2.2 TALEN编辑技术

TALENs是第二代基因编辑技术，在结构上类似于ZFN，由FokI核酸酶域和1个可定制的DNA结合域融合而成［

20-21］。可定制的DNA结合域是TALEs衍生物，包含高度保守的重复序列，一系列33~35个高度保守的氨基酸重复序列帮助TALEs与DNA结合。TALEN的N端和C端拥有额外的TALE衍生结构域，用于介导DNA附着。FokI核酸酶对目标DNA序列进行切割，然后细胞通过NHEJ方式对切割后的DNA进行修复，导致DSB区域内核苷酸的插入或缺失，最终以移码突变的形式结束［21］。与ZFN相比，TALEN的载体设计相对灵活，构建相对简单，精准性较高，脱靶率相对较低，但利用TALEN不能同时编辑多个基因。Wang等［22］利用TALEN技术首次在小麦中诱导了3个TaMLO同源基因的突变，赋予了编辑植株对白粉病的遗传广谱抗性。

2.3 CRISPR/Cas9编辑技术

CRISPR/Cas9是第三代基因编辑技术，由高度保守的重复序列和完全不同的间隔序列交替排列组成，Cas9蛋白和单链引导RNA（sgRNA）结合形成嵌合蛋白体，在sgRNA的协助下Cas9蛋白能够识别相对简单的前间隔序列临近基序（PAM，protospacer adjacent motif）5'-NGG-3'，并对与sgRNA互补的双链DNA进行切割，断裂的DNA链再通过非同源末端连接或同源重组的方式进行修复，从而实现对目的基因的编辑。进一步在CRISPR/Cas9的基础上开发了新的基因编辑技术，如Cpf1 （CRISPR from prevotella and francisella 1），代替Cas9的功能。CRISPR/Cas9系统的载体构建比较简单，编辑效率高，可同时对植物中的多个基因进行编辑，并且脱靶率较低，因此是小麦中应用最成功的编辑技术。例如，首次开发的CRISPR/Cas9系统在小麦原生质体中验证了序列特异性sgRNAs［

23］，利用农杆菌介导的CRISPR/Cas9系统侵染小麦幼胚材料，分别对3个基因（Pinb、Waxy和DA1）进行编辑，突变效率6.8%~54.2%，未检测到脱靶突变［24］。

2.4 小麦基因编辑体系比较和优化

中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室对小麦中CRISPR的编辑体系进行了优化，比较了3种启动子（OsU6、TaU3和TaU6）调控目标基因sgRNA、3种CRISPR体系（SpCas9、Cpf1和xCas9）和不同靶点数对目标基因的编辑效率，发现OsU6、TaU3和TaU6编辑效率分别为21.6%、61.6%和36.0%；单靶点的编辑效率为45.7%~64.6%，双靶点的编辑效率为70.1%，并在两个靶点间出现了DNA片段删除现象，删除效率为37.2%；虽然利用CRISPR/Cpf1和CRISPR/xCas9可以获得编辑植株，但与CRISPR/SpCas9系统相比，它们对靶标基因的编辑效率非常低，只有3.1%和1.5%。表明在利用CRISPR/SpCas9编辑系统的前提下，设计TaU3启动子靶向目标基因的多个串联sgRNA，可以显著提高对小麦中目标基因的编辑效率［

25］。

在另外的研究中，比较了Cas9与两个Cpf1基因AsCpf1和LbCpf1在小麦中的编辑效率，发现LbCpf1比AsCpf1和Cas9对靶基因TAPDS的编辑效率更高，Cas9比AsCpf1和LbCpf1诱导的脱靶突变更多，认为CRISPR/LbCpf1是小麦等多倍体植物有效的基因组编辑工具［

26］。

3 利用转基因技术改良小麦

3.1 抗病性改良

白粉病、锈病、赤霉病、黄矮病（BYDV，barley yellow dwarf virus）、黄化叶病毒病（WYMV，wheat yellow mosaic virus）、全蚀病和纹枯病等是小麦生长期间的主要病害，在小麦产区经常发生，减产严重。如白粉病每年在中国的发病面积60万公顷左右，普通年份减产10%~20%，流行年份减产40%以上。白粉病和赤霉病不仅降低小麦籽粒产量，还降低营养品质和加工品质。小麦中相应的抗病资源逐趋枯竭或缺乏抗源，需要利用转基因技术和基因编辑技术创制抗病新种质，提高小麦的抗病性。将多聚半乳糖醛酸酶抑制剂蛋白酶（PGIP，polygalacturonase-inhibiting protein）编码基因转入小麦，增强了转基因小麦对根腐病的抗性［

27］。将小麦梭条花叶病毒复制酶基因Nia发卡结构和Nib8反向序列的RNAi载体转入小麦，转基因植株对该病毒病表现免疫［28-29］。vsiRNA1在WYMV侵染前期高表达，并抑制Nib8基因表达，将vsiRNA1基因转入小麦获得的转基因株系（L12与L17）对WYMV表现高抗，表明vsiRNA1参与了小麦对WYMV的抗病性［30］。

在小麦中表达来自簇毛麦的ERF1-V基因增强了小麦对白粉病的抗性［

31］，过表达小麦自身的TaJAZ1基因通过促进活性氧的积累提高了小麦白粉病的抗性［32］，转大麦chi26基因的小麦植株同时抗锈病和白粉病［33］，过表达Yr10的转基因小麦植株表现出对条锈病的抗性［34］。将蒺藜苜蓿质外体靶向抗真菌防御素MtDEF4.2的嵌合基因转入小麦，发现MtDEF4.2表达不影响小麦根系与有益菌真菌的共生关系，对叶锈病表现抗性［35］。目前，已鉴定的秆锈病全生育期抗性基因Sr22、Sr35、Sr45和Sr50，以及成株期抗性基因Sr55，它们的抗病性比较稳定、持久，但是只能提供部分抗病性，在病原菌流行严重的期间不足以保护小麦正常生长，将这5个抗秆锈病基因聚合转入小麦，发现转基因小麦对锈菌具有广谱抗性［36］。最近，Wang等［37］从小麦与条锈菌互作入手，利用BSMV-VIGS技术对小麦与条锈菌互作中的差异表达激酶基因进行抗锈性分析，鉴定到编码胞质类受体激酶基因TaPsIPK1负调控小麦抗锈性。进一步创制了TaPsIPK1RNAi及过表达转基因小麦材料，发现RNAi稳定沉默降低小麦感病性，过表达则增强小麦对条锈菌的感病性。

将TaPIMP1、TaERF1和TaSTT3b-2B等抗病相关基因转入小麦，创制了抗纹枯病的转基因小麦新种质［

38-40］。将FsTRI101、RsAFP2等基因转入小麦，获得的转基因小麦对赤霉病表现一定抗性［41-42］。在中度感赤霉病的品种中过表达HisR的1个等位基因，转基因植株获得了对赤霉病较高的抗性［43］。将从二倍体长偃麦草中克隆的抗赤霉病基因Fhb7（编码谷胱甘肽S-转移酶，GST）转入感病小麦，转基因植株抗赤霉病和冠腐病，验证了Fhb7的功能，认为二倍体长偃麦草中的Fhb7 基因源自真菌的水平转移［44］。

3.2 抗逆性改良

随着全球气温升高和工业化发展的加快，干旱和盐碱等非生物胁迫对小麦生产的危害越来越重，利用转基因技术和基因编辑技术改良小麦抗逆性已成为趋势。将来自大豆的GmDREB基因转入小麦，转基因小麦对水分胁迫表现较强耐性。先后将拟南芥中的AtDREB1A基因和玉米中的ZmPEPC的基因转入小麦，转基因小麦耐旱性明显高于受体对照［

45-46］。分别过表达小麦TaDREB3基因、TaNAC48基因、TaNRX1基因、TaWRKY46基因和TaWRKY2基因的转基因植株在严重水分胁迫下的存活率和抗旱性比野生型高，籽粒产量增加［47-51］。另外，在小麦中表达大豆的GmDREB1基因，转基因植株中参与褪黑素生物合成途径的3种酶的表达上调，证明表达GmDREB1促进了小麦褪黑素的合成，提高了小麦的抗旱性［52］。

由于细菌中的冷激蛋白（CSPs，cold shock proteins）能增强细菌对不良环境的适应能力，将密码子改造的大肠杆菌SeCspA和SeCspB基因转入小麦，转基因植株在干旱胁迫下丙二醛（MDA）含量、失水率和相对Na+含量降低，叶绿素含量和脯氨酸含量增加，抗旱性增强［

53］。分别将GhDREB、W16、TaERF3等抗旱相关基因在小麦中过表达，培育了抗旱性或耐盐性提高的转基因小麦新材料［54］。将青稞中的甜菜碱醛脱氢酶基因HvBADH1转入小麦，转基因株系耐盐性显著提高［55］。表达从簇毛麦中克隆的ERF1-V基因，不但可以提高小麦对白粉病的抗性，而且同时提高了小麦对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性［31］。在拟南芥中发现，Na+/H+逆向转运基因AtNHX1通过增加Na+积累和保持K+/Na+平衡提高耐盐性，因此将AtNHX1转入小麦，转基因小麦对盐胁迫表现出较高的耐受性［56］。脱落酸胁迫成熟蛋白（ASR，abscisic acid-/stress-/ripening-induced protein）被证明赋予植物对非生物胁迫的耐受性，在小麦中过表达TaASR1-D，转基因株系对氧化、渗透、干旱和高盐胁迫的抗性增强［57］。过表达TaERFVII对小麦植株的发育和产量没有负面影响，提高了小麦的耐涝性［58］。

将从抗逆性强的大豆品种中克隆的转录因子基因GmTDN1转入小麦，不但显著提高了小麦的抗旱性，同时提高了小麦的氮肥利用效率；将GmTDN1基因导入两个小麦品种后，在节水和缺氮条件下分别比对照增产13.0%和24.5%［

59］。Liu等［60］发现，过表达小麦TaMPK3基因显著降低了小麦在苗期干旱胁迫条件下的存活率，在成株期干旱胁迫条件下粒宽和粒重降低，表明其耐旱性和对脱落酸的敏感性降低；干扰TaMPK3基因的表达在一定条件下可以提高小麦的耐旱性，认为该基因可能在小麦干旱胁迫响应与正常生长信号之间起到平衡作用［60］。另外，通过全基因组关联分析从小麦中克隆了编码1个DREB转录因子的抗旱基因TaDTG6-B，其编码区中26 bp的插入/缺失（InDel574）与小麦苗期抗旱性显著关联。进一步发现，过表达TaDTG6-BIn574基因的小麦植株其抗旱性没有改善；过表达TaDTG6-BDel574基因显著增强抗旱性，沉默后明显降低抗旱性。表明TaDTG6-BDel574基因在调控小麦抗旱性方面具有重要作用［61］。

3.3 产量和生长发育相关性状改良

小麦产量主要由单位面积穗数、穗粒数和千粒重决定，利用转基因技术和基因编辑技术改良小麦产量性状具有较大潜力。将小麦TaBT1基因的RNAi载体转入小麦，发现单株有效分蘖、小穗数和穗粒数没有显著减少，粒长减少了0.7%~1.6%，粒宽减少了8.1%~23.3%［

62］。在另一项负调控籽粒大小基因TaDA1的研究中，过表达导致粒长减少了1.7%~5.6%，粒宽减少了3.4%~5.1%，千粒重减少了2.9~4.5 g；而RNAi载体的转入使得粒长增加了2.5%~3.5%，粒宽增加了4.0%~6.8%，千粒重增加了3.6~5.9 g［63］。过表达小麦TaD27基因后引起单株分蘖数减少，但通过RNAi抑制TaD27基因后单株分蘖数增加［64］。过表达小麦TaNAC2-5A基因的转基因植株根系发达，吸收硝酸盐能力增强，产量性状提高。过表达小麦TaNFYA-B1、TaNF-YB4和TaGS2基因显著增加了单株穗数、千粒重和籽粒产量［36］。另外，将玉米中参与光合作用的转录因子基因Dof1和ZmPEPC转入小麦，转基因植株叶片的光合性能增强，生物量、穗长和根长增加，籽粒产量增加［65］。将水稻中的OsPHR2转入小麦，与野生型相比，转基因株系对磷的吸收效率提高，产量增加［66］。将小麦TaTOC1s基因的RNAi载体和小麦miR408的小RNA载体转入小麦，发现转基因植株抽穗期提前［67］。Xie等［68］在冬小麦中过表达春化相关基因TaVrt2和TaVrn1，转基因植株在无春化或不完全春化的低温条件下可以正常抽穗，在春化条件下抽穗期比野生型提前。

2021年以来，利用转基因技术改良小麦产量性状相继取得了突破性进展。通过图位克隆方法定位到1个控制小麦小穗数的主效基因TaCol-B5（该基因编码一个CONSTANS-like家族蛋白），发现TaCol-B5不同等位基因编码蛋白质存在氨基酸位点突变，与蛋白激酶TaK4反应时蛋白磷酸化水平有差异，其显性等位变异存在于二粒小麦中，在小麦种质中非常稀少；进一步在扬麦18中过表达TaCol-B5，发现转基因株系单株有效分蘖数和株高增加，籽粒产量比野生型增加11.9%~19.8%［

69］。Wang等［70］在短柄草中发现了一个小穗数、穗粒数和每株粒数增加的突变体bdduo1-1，确认该性状由转录因子AP2/ERF基因编码，敲除该基因的短柄草的突变体与bdduo1-1表型相似。进一步敲除小麦品种Fielder中AP2/ERF的同源基因DUO-B1，转基因株系表现出多排小穗，生育期和分蘖数与野生型相比没有差异，但单株粒重、结实率和收获指数增加，单位面积产量增加约10%。Wei等［71］对玉米和水稻中共有的与光合作用过程密切相关的118个转录因子基因逐一进行分析，鉴定到1个同时受光和低氮调控的转录因子OsDREB1C，在两个水稻品种日本晴、秀水134中过表达OsDREB1C的转基因植株比野生型对照氮素利用效率提高25.8%~56.6%，抽穗期提早2~19 d，增产30.1%~68.3%；同时，将该基因转入小麦品种Fielder中，转基因小麦比野生型对照早熟3~6 d，增产17.2%~22.6%。

3.4 品质相关性状改良

随着人们生活水平的提高，培育优质专用小麦品种的问题越来越突出，而传统育种方法改良小麦品质的目标性不够强，需要利用转基因技术和基因编辑技术予以辅助。研究表明，通过转基因技术在小麦中过表达1Ax1、ama1、SBEIIa和SBEIIb等一些与面粉加工和营养品质相关的目标基因，转基因小麦株系面包品质提高，支链淀粉含量增加。将从小伞山羊草中鉴定的低分子量谷蛋白亚基新基因LMW-N13转入小麦，转基因株系与非转基因株系相比淀粉粒大，蛋白质基质连续紧密，面团加工特性得到改善［

72］。通过转基因介导的RNAi技术沉默小麦中的TaBT1基因，A型淀粉颗粒减少了27.3%~45.5%，B型淀粉颗粒增加了0.7~1.1倍［62］。将来自高大山羊草的高分子量麦谷蛋白亚基编码基因1Slx2.3*转入小麦，转基因小麦籽粒中的谷蛋白含量增加，面包体积增大［73］。

将从硬粒小麦中克隆的籽粒硬度基因Pinb-D1x转入小麦，改善了籽粒硬度和面粉加工特性［

74］。为了丰富小麦籽粒中的类胡萝卜素含量，将源自细菌的八氢番茄红素合成酶基因CrtB和类胡萝卜素去饱和酶基因CrtI在小麦中共表达，转基因小麦籽粒中的总类胡萝卜素含量增加了8倍，β-胡萝卜素含量增加了65倍，维生素A原含量增加了76倍［75］。在小麦中共表达来自大豆和番茄的叶酸合成相关基因Gm8gGCHI和LeADCS，转基因株系与野生型相比籽粒中的叶酸含量增加了5.6倍［76］。

4 利用基因编辑技术改良小麦

4.1 提高抗病性

研究发现，小麦TaHRC基因编码组氨酸钙结合蛋白，导致小麦对赤霉病的易感性，通过基因编辑随机删除包含TaHRC基因起始密码子的序列，突变体对赤霉病表现一定抗性［

43］。在感赤霉病的小麦品种中沉默HisS基因的1个等位基因，感病品种获得了对赤霉病的抗性 ［77］。在小麦中敲除WFhb1-1基因后导致赤霉病严重发生，认为该基因是1个重要的抗赤霉病基因资源，具有潜在的应用价值［78］。通过基因编辑技术敲除小麦基因TaPDIL5-1，该基因是大麦黄花叶病感病因子基因HvPDIL5-1的直系同源基因，三敲突变体aabbdd1~ aabbdd4对小麦黄花叶病表现较好抗性，证实TaPDIL5-1作为感病宿主因子参与小麦WYMV感染，且突变体与野生型在株高、抽穗期、穗长、穗数、穗粒数和千粒重等主要农艺性状方面没有显著差异［79］。在小麦中瞬时表达CRISPR/Cas9-DNA，发现TaNAC2基因通过调节枝条分支提高小麦对条锈菌的耐受性［80］，编辑TaLPX-1基因提高了小麦抗禾谷镰刀菌的能力［81］。最近的研究发现，同时敲除小麦A、B、D基因组上的TaPsIPK1基因，突变体对中国主要条锈菌流行小种CYR32、CYR33和CYR34表现广谱抗性［37］。

在大麦、拟南芥和番茄等植物中，通过使Mildew resistance locus（MLO）基因产生缺失突变，突变体植株对白粉病菌产生了持久抗性。通过编辑小麦1A、1B和1D染色体上3个TaMLO基因，获得了6种纯合突变类型（Tamlo-aa、Tamlo-bb、Tamlo-dd、Tamlo-aabb、Tamlo-aadd和Tamlo-aabbdd），3个基因同时编辑的Tamlo-aabbdd突变体对白粉病具有较强抗性，其他5类突变体和野生型对照感染白粉病［

22］。进一步从100多个突变体中发现了一个突变体Tamlo-R32，其在TaMLO-B附近有304 kb的大片段DNA删除，在对白粉菌表现抗性的同时，对生长发育和产量没有影响［82］。Zhang等［83］利用基因编辑技术敲除小麦另一个内源基因TaEDR1，突变体同样获得了对白粉病的抗性，证明TaEDR1也是一个负调控白粉病侵染的基因。

4.2 提高抗逆性

小麦TaHAG1基因编码1个定位于细胞核中的组蛋白乙酰转移酶［

84］，其表达水平与小麦的耐盐性和耐热性呈显著正相关［85］。分别通过转基因和基因编辑获得该基因过表达、RNAi和CRISPR敲除株系，与野生型对照相比，过表达株系在高盐、高温胁迫下千粒重和粒宽显著提高，耐盐性和耐热性显著增强［85］。而RNAi和CRISPR株系耐盐性和耐热性显著降低，在苗期正常条件下转基因株系和突变体株系与野生型有相似的表型，表明TaHAG1在提高小麦耐盐性和耐热性的同时对其他农艺性状没有负效应［85］。

编辑小麦中的乙酰乳酸合成酶编码基因TaALS-P174，ALS突变体对烟嘧磺隆除草剂具有良好的抗性；编辑乙酰辅酶A羧化酶编码基因TaACCase-A1992，突变体对精喹禾灵除草剂表现一定耐受性［

86］。另外，这些突变体同时对磺酰脲类、咪唑啉酮类和芳氧基苯氧基丙酸类除草剂具有耐受性。二硝基苯胺是一种广泛使用的高效低毒除草剂，然而，小麦中耐二硝基苯胺的品种很少，限制了二硝基苯胺在小麦生产中的应用。利用腺嘌呤碱基编辑器（Whie ABE）编辑位于1A、1B、1D、4A和4D染色体上的微管蛋白等位基因，蛋氨酸到苏氨酸的突变赋予了小麦突变体对二硝基苯胺的抗性［87］。

小麦成熟期穗发芽严重影响小麦产量和品质，目前推广小麦品种抗穗发芽能力普遍较弱，通过常规育种途径培育抗穗发芽小麦品种的成效不显著，需要利用基因编辑技术解决小麦穗发芽问题。研究表明，小麦中编码丙氨酸转氨酶的TaQsd1基因是控制籽粒休眠的关键基因，利用基因编辑技术敲除小麦第4同源群上3个拷贝的TaQsd1基因获得了TaQsd1-aaBbdd、TaQsd1-AABbDd和TaQsd1-AABBDd突变类型，进一步利用突变体TaQsd1-aaBbdd与野生型杂交获得了TaQsd1位点的8种基因型［

88］。对突变体的鉴定发现，TaQsd1-AABBDD、TaQsd1-aaBBDD、TaQsd1-AAbbDD、TaQsd1-AABBdd、TaQsd1-aabbDD、TaQsd1-aaBBdd、TaQsd1-AAbbdd和TaQsd1-aabbdd在表型上没有明显差异，在适宜条件下TaQsd1-aabbdd基因型与其他7种基因型和野生型相比，萌发时间延迟，萌发率降低［88］。

4.3 改良产量性状

目前，虽然在小麦中已经定位到多个与每穗小穗数相关的QTL，但克隆到的小穗数控制基因还相对较少，FT-D1基因是其中之一。利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦品系CB037中的FT-D1，筛选到3个无转基因载体整合的FT-D1纯合突变体，抽穗期均比野生型CB037晚2~3 d，每穗小穗数显著高于CB037［

89］。研究表明，小麦中的TaGW7基因编码TONNEAU1-recruiting motif （TRM）蛋白，影响粒形和粒重。通过编辑小麦B和D基因组中的TaGW7，发现两个基因组中的TaGW7同时突变或任何一个单独突变都会导致粒宽和粒重增加，但粒长减少［90］。另外，利用基因编辑技术靶向突变小麦中的TaARE1基因，产生了一系列具有部分或全部敲除TaARE1等位基因的突变系，在氮素缺乏的条件下与野生型对照相比均表现为耐受性增强，衰老延缓，籽粒产量提高，其中的AABBdd和aabbDD突变系尤其明显，无生长缺陷的表型［91］。敲除小麦中参与磷的吸收和转运的TaPHO2s基因，在低磷营养条件下突变体与野生型对照相比磷吸收和籽粒产量显著提高［92］。

4.4 改良品质性状

植酸（PA，phytic acid）是一种重要的抗营养剂，存在于谷物中降低人体对铁和锌的吸收利用度，其中肌醇五磷酸激酶1（IPK1，inositol pentaphosphate kinase 1）编码基因是PA生物合成的关键基因。利用CRISPR/Cas9技术靶向突变小麦中的TaIPK1基因，突变体籽粒中的植酸含量降低，铁和锌的积累水平提高［

93］。小麦ODORANT1通常结合在储藏蛋白合成相关基因的启动子区，抑制启动子的活性，进而抑制储藏蛋白的合成，利用基因编辑技术敲除小麦中的ODORANT1基因，小麦籽粒中储藏蛋白的总含量升高11.4%~19.4% ［94］。在敲除小麦TaNAC019基因的研究中，发现突变体中大部分贮藏蛋白基因以及部分淀粉合成相关基因表达下降，导致面筋和淀粉含量降低，认为该基因调控谷蛋白和淀粉的积累，在小麦产量和加工品质相关性状形成中具有关键作用［95］。

面粉中的谷蛋白富含脯氨酸和谷氨酰胺，容易产生不易消化的多肽，引发面筋过敏反应，肾病或糖尿病人摄入过多会加重肾脏负担。其中，α-和ω-醇溶蛋白及高分子量麦谷蛋白亚基（HMW-GS，high molecular weight glutenin subnit）是依赖运动诱发性过敏症最主要的原因。因此，降低小麦中醇溶蛋白的含量，培育低面筋含量小麦品种作为易感人群的专用面粉，对于降低乳糜泻、哮喘病和依赖运动诱发性过敏症的发病率具有重要价值。在α-醇溶蛋白基因高度保守的乳糜泻过敏肽区域选取两个特异的sgRNA，利用CRISPR/Cas9技术对小麦中α-醇溶蛋白基因进行编辑，获得了低面筋小麦突变体；在其中的1个突变体中，35个α-醇溶蛋白基因发生了突变，大大减少了小麦籽粒中的过敏原，免疫反应性降低了85%［

96］。同时发现，这些低面筋的基因编辑材料中没有转基因成分存在，经过安全性评价后有望用于生产低面筋食品［96］。在随后一项编辑小麦醇溶蛋白编码基因的研究中，突变体籽粒中醇溶蛋白含量也大幅地降低［97］。同样，利用CRISPR/Cas9技术编辑硬粒小麦中淀粉酶/胰蛋白酶抑制剂编码基因，降低了硬粒小麦中过敏原蛋白［98］。另外，面团在烘焙过程中，其中的天冬酰胺会转化为丙烯酰胺，后者是一种可能的致癌物。利用基因编辑技术敲除小麦天冬酰胺合成酶基因TaASN2，突变体籽粒中天冬酰胺大量降低，可望开发出极低天冬酰胺的专用小麦品种［99］。

4.5 修饰生长发育特性

目前小麦杂种优势还没有得到充分利用，杂交种品种还比较缺乏，主要原因之一是缺乏优良而稳定的不育系。利用CRISPR/Cas9系统敲除不同小麦品种中A和D基因组上的TaMs1基因（B基因组上的TaMs1为不完整序列的假基因），获得了双等位基因移码编辑植株，突变体完全雄性不育，获得了无转基因成分存在的雄性不育系［

100］。通过敲除小麦育性相关基因TaMs45，3个同源基因同时编辑的纯合突变体在正常生长条件下表现为花粉败育，表明CRISPR/Cas9技术可用于快速创制具有商业化小麦品种遗传背景的雄性不育系［101］。需要指出的是，太谷核不育小麦和矮败小麦是我国特有的种质资源，其不育性由位于小麦4DS染色体上的显性基因TaMs2控制，杂交后代中总是分离出一半可育株和一半不育株。虽然利用矮败小麦和太谷核不育小麦进行轮回选择育种，已经培育了多个优良小麦品种。但是，小麦新品种只能从轮回选择群体衍生的优良可育材料中选择，优良不育材料由于育性分离不能直接用于育种选择。根据TaMs2基因序列设计编辑靶点，以矮败小麦与其他小麦授粉后的杂种幼胚为受体材料，利用CRISPR/Cas9体系编辑TaMs2基因，表现矮秆的突变体携带Rht10基因，小花中含有完整花药，花粉粒具有活性，可以正常结实，表明利用基因编辑技术可以彻底恢复矮败小麦的育性［102］。

传统诱导小麦单倍体主要通过花药培养、小孢子培养和远缘杂交介导的染色体消除等技术，但这些方法依赖于基因型和离体培养等条件，存在诱导效率低、操作复杂等缺点，限制了单倍体技术在小麦育种中的应用。而在玉米遗传资源中鉴定到了可以诱导玉米产生单倍体的材料Stock6，发现其诱导产生单倍体籽粒的性状由磷脂酶编码基因MTL/ZmPLA1/NLD控制，进一步利用CRISPR/Cas9技术敲除MTL/ZmPLA1/NLD基因，突变体表现出与诱导系相同的功能。通过设计特异性靶向小麦TaPLA（TaMTL/TaNLD）基因的sgRNA序列，利用CRISPR/Cas9技术敲除小麦4A和4D染色体上共两个拷贝的TaPLA基因，获得了单倍体诱导系，单倍体诱导率为2%~3%［

103］。中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室利用优化的CRISPR/SpCas9体系和双靶点策略，对小麦TaMTL进行编辑，获得了大量编辑植株，发现了碱基缺失和大片段删除等突变，并发现了两个靶点间序列删除后存在反向插入现象，大片段删除效率达40.2%，编辑效率57.5%，部分突变体中同时编辑了3个拷贝的TaMTL基因，单倍体诱导率高达18.9%（图1A、B）。另外，首次在突变体中发现了无胚型及胚和胚乳双无型籽粒（图1C），为探究TaMTL基因沉默导致胚胎和胚乳的败育机理提供了材料［25］。参与植物着丝粒复合蛋白募集和稳定的组蛋白CENTROMERIC HISTONE3（CENH3）的编码基因也与单倍体诱导有关。鉴定发现，小麦中存在CENH3的同源基因TaCenH3α和TaCenH3β，其中TaCenH3α在子房和花粉中的表达高于TaCenH3β；通过基因编辑技术敲除TaCENH3α基因，获得了可以诱导单倍体的突变体，单倍体诱导率7%~8%［104］。上述突变体材料可诱导小麦杂交后代产生单倍体，将加速优良基因型纯合，加快小麦育种进程，提高小麦单倍体育种效率。

图1  小麦TaMTL基因编辑突变体诱导单倍体植株鉴定

Fig.1  Identification of haploid plants in the TaMTL gene editing mutants of wheat

A：TaMTL-aabbdd突变体自交群体植株表型，红色标记的为单倍体植株，表现为不育；B：单倍体植株染色体观察，含有21条染色体；C：TaMTL-aabbdd突变体自交群体籽粒表型，左侧一粒为正常籽粒，右侧2粒为无胚籽粒

A： Plant phenotype in the self-crossing offspring of TaMTL-aabbdd mutant， in which the plants labeled in red are haploid plants showing sterility； B： Chromosome observation of the haploid plants with 21 chromosomes； C： Grain phenotype in the self-crossing offspring of TaMTL-aabbdd mutants， in which the grain on the left is normal type， and the two grains on the right are embryoless type

5 问题和展望

与传统的杂交育种和诱变育种等方法相比，转基因育种和基因编辑育种目标性强、精准性高，可以进行人工设计和操作，可以有效弥补传统育种方法存在的缺陷，但转基因和基因编辑都依赖于植物组织培养和植株再生，存在着强烈的基因型依赖性。虽然利用再生相关基因可以有效解决小麦基因型依赖性问题，但基于小麦幼胚的转化效率与母体植株和幼胚生理状态的关系很大，生长期间的温度条件、光照条件、病虫危害和农药施用等均影响受体材料的生理状态，进而影响了小麦遗传转化效率。中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室通过杂交、回交和分子标记辅助选择，将抗白粉病基因Pm21和PmV导入了易转化材料Fielder，培育了新的抗白粉病模式基因型，主要农艺性状与Fielder相似或有所改进，再生效率和转化效率比Fielder提高，生长期间不用施用化学药剂防治白粉病［

105］。单子叶植物成熟胚的生理状态均匀一致，转化操作不受生长季节的限制，是比较理想的转化材料。利用BBM和WUS2辅助农杆菌转化玉米成熟胚、幼叶等组织，转化效率15%~20%［14］。之前的研究表明，利用小麦成熟胚能够获得转基因植株，但转化效率较低［6］，在利用BBM、WUS2、GRF、GIF和TaWOX5等多个再生基因辅助的基础上，挖掘和利用更多再生相关基因，可提高小麦成熟胚转化效率。

利用转基因技术和基因编辑技术创制的作物新品种用于产业化的主要限制是安全性问题，培育无筛选标记转基因植物非常必要。在众多获得无筛选标记转基因植株的技术中，共转化法效率最高，应用最为广泛。中国农业科学院作物科学研究所转基因中心小麦实验室通过构建双T-DNA载体，利用农杆菌转化幼胚，经筛选培养和分子检测，获得共转化目标基因和标记基因的T0转基因植株，在自交后的T1植株中鉴定到只含有目标基因而不含有筛选标记基因的转基因植株，无筛选标记转基因植株出现频率为5.2%。此外，利用转化效率较高的PureWheat技术将不含筛选标记的表达载体转化小麦模式基因型，在培养基中不添加筛选剂的情况下可以大量获得再生植株，其中2%左右的植株为转基因植株（无筛选标记）［

10］。利用再生相关基因GRF-GIF进一步促进了农杆菌转化后的植株再生，可以获得不含筛选标记的转基因植株，载体上不用构建筛选标记，转化后的愈伤组织诱导和分化培养基中不需要添加筛选剂［16］。

基因编辑技术可以不涉及外源DNA序列的整合，在经过遗传转化操作获得的转基因植株后代中很容易鉴定到不含外源DNA序列的基因编辑植株，在本质上等同于传统育种方法获得的遗传变异，理论上比转基因技术培育的作物品种具有更高的生物安全性。然而，基因编辑也利用了转基因技术，其产业化应用也需要较为严格的安全性评价。早期的研究表明，小麦与玉米杂交能够诱导小麦孤雌发育，进而产生小麦单倍体（玉米染色体在合子发育前期由于复制和分离与小麦染色体不同步而自然消除），染色体加倍后可以获得正常结实的小麦双倍体植株［

106］。基于上述发现，将小麦GRASSY TILLER1 （TaGT1）基因的sgRNA和Cas9基因构建表达载体转化玉米，获得玉米转基因植株，然后利用转基因玉米作为花粉供体与小麦杂交，实现了对小麦TaGT1基因的编辑，突变体中不含有来自玉米的外源DNA［107］。在随后的一项研究中，Budhagatapalli等［108］根据小麦BRASSINOSTEROID INSENSITIVE 1 （BRI1）基因和SEMI-DWARF 1 （SD1）序列设计编辑靶点，将构建的Cas9/gRNA 表达载体转入玉米，获得了5个Cas9和gRNA 表达水平较高的转基因玉米植株；进一步用转基因玉米与小麦杂交，在174个小麦单倍体植株中检测到了15株靶向编辑突变体，编辑效率3.6%~50.0%，突变体中同样不含有外源DNA。利用小麦与玉米杂交技术编辑小麦内源基因的过程中没有利用转基因技术，不牵扯到生物安全性评价问题，获得的小麦品种在产业化应用方面具有广阔前景。

随着小麦转基因、基因编辑技术的不断发展和完善，已经能够高效获得小麦转基因植株和基因编辑植株，基本克服了基因型的依赖性，可以定点敲除小麦基因组中的不利基因或负调控基因，实现目标性状的精准改良，将大大提高小麦定向遗传改良的效率。今后的研究重点应该围绕小麦生产和小麦育种中需要迫切解决的重大问题，明确控制拟改良性状的关键基因、作用方式和DNA序列，进而利用转基因技术或基因编辑技术进行解决，培育目标性状显著改良且对产量和品质没有负影响的遗传修饰品种。

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