高粱缺氮特异诱导基因<bold>SbMYB-like</bold>克隆及功能分析

朱振兴; 李丹; 陆晓春; ZHU Zhen-xing; LI Dan; LU Xiao-chun

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摘要

高粱是全球重要的五大粮食作物之一，具有耐瘠薄、耐旱等特性。氮元素是保障作物稳产、高产的三大重要养分元素之一。氮信号途径相关基因研究在高粱中基本不清楚，挖掘缺氮诱导基因，有助于解析高粱氮素吸收、利用相关分子通路。本研究克隆了先前在高粱BTX623苗期缺氮、缺磷及缺钾表达谱中筛选出的1个地上部分特异受缺氮诱导的MYB-related转录因子家族成员SbMYB-like基因Sb03g030330，该基因编码蛋白预测定位于细胞核。高粱中组织表达qRT-PCR分析表明SbMYB-like基因在根、茎、花中表达较低，主要在叶片中表达。进化树分析表明该基因与玉米、二穗短柄草中同源基因亲缘关系相对较近。通过qRT-PCR在二穗短柄草中验证了该基因同源基因地上部分受缺氮诱导的特性。在高粱BTX623品种中分离并克隆了SbMYB-like基因，构建超表达载体，转化拟南芥获得了超表达株系。通过缺氮和缺磷处理，测定野生型和超表达纯系植株主根长度和开花时间，结果表明该基因在促进根系伸长和开花方面有重要的作用，但此促进作用并不依赖于外源氮素水平。本研究为高粱缺氮响应分子途径解析提供了基础数据。

关键词

MYB-related; 转录因子; 缺氮; 开花; 根伸长; 高粱

氮是构成生物体的必需元素之一，植物通过根系吸收和同化无机氮源，将无机氮转化成氨基酸，继而合成各种蛋白质，参与植物的生长和发育。氮肥是大多数非豆科作物主要的投入之一，约占世界肥料消耗量的60%^［

1］。中国粮食产量尽管已经连续数年增产，然而在氮肥消耗上已经约占世界氮肥消费量的30%^{［参考文献 2

百度学术}2］。不合理的氮肥使用，特别是过量施用，既不经济也不环保。一般作物当季氮肥利用率约40%^{［参考文献 3

百度学术}3］，大部分未被作物利用的肥料进入自然环境中，造成很多环境问题，诸如水体富营养化、加剧温室效应、臭氧层破坏、加剧雾霾等。

通常土壤中的氮素分布不均匀，植物在应对这种易变的养分环境时已经进化出一系列的氮缺乏响应措施^［

4］。如水稻在缺氮的条件下，抑制地上部分生长，促使根系伸长，增强根系吸收土壤中养分的能力^{［参考文献 5

百度学术}5］。通常情况下，在水稻、拟南芥中以及其他一些植物中缺氮可以促进植物开花，而过量的氮肥会造成植物的贪青晚熟^{［参考文献 6-7}6-7］。培育氮养分高效利用作物是减少氮肥使用的重要途径，挖掘氮素缺乏响应相关基因，对解析氮素养分高效利用分子机理，培育节氮作物有重要作用。

MYB转录因子是植物中非常庞大的1个转录因子家族，作用广泛，参与抗旱、次生代谢等调控过程^［

8-9］。这个家族成员都包含MYB结构域，通常这些结构域会有1~4个不等的重复，根据MYB重复数量不同分为1个重复1R-MYB、2个重复2R（R2R3）-MYBs、3个重复3R（R1R2R3）-MYBs以及4个重复4R-MYBs^{［参考文献 10

百度学术}10］。其中1个重复1R-MYB也称为MYB-related转录因子，如AtmybL2基因最初是从拟南芥cDNA文库中分离出来的，这个MYB-like基因主要在叶片中表达，编码的氨基酸包含1个保守MYB的N端DNA结合域和1个独特的富含脯氨酸的C端^{［参考文献 11

百度学术}11］。MYB-related转录因子在植物中分布广泛，拟南芥中有97个成员、水稻中有106个，而高粱中有129个^{［参考文献 12

百度学术}12］。MYB-related转录因子成员参与了开花、果实发育、低氮磷响应、节律调控、以及一些次生代谢物苯丙烷类衍生物的代谢调控^{［参考文献 13-14}13-14］。在开花调控上，小麦中MYB-related家族成员TaMYB72，在水稻中超表达促进了水稻开花^{［参考文献 15

百度学术}15］；FE是1个韧皮部特异表达的MYB_related基因，也发现参与开花时间的调控^{［参考文献 16

百度学术}16］。植物低磷响应分子调控网络的核心基因PHR1是1个MYB-related转录因子^{［参考文献 17

百度学术}17］。受低氮诱导的MYB-related转录因子AtNsr1，其T-DNA插入突变体中硝态氮转运体AtNRT2.5的表达也被改变^{［参考文献 14

百度学术}14］。AtMYBD是1个花青素生物合成的正调控因子，调控依赖于生物钟节律^{［参考文献 13

百度学术}13］。

高粱是全球五大谷物类作物之一，具有耐瘠薄、耐旱等特性，一般种植在一些半干旱、瘠薄的边际土地上^［

18］。高粱基因组较小，是C4植物研究的模式植物，挖掘高粱低氮诱导基因，有助于解析高粱缺氮诱导的分子机制。本研究克隆了高粱低氮特异诱导转录因子SbMYB-like基因，通过在拟南芥超表达转化，初步分析了该基因的功能，表明该基因在促进根系生长和开花方面发挥着重要作用。本研究将为深入挖掘高粱氮素高效利用基因、培育养分高效利用作物提供基础数据。

1 材料和方法

1.1 试验材料及生长条件

试验材料：高粱参考基因组测序品种BTX623，拟南芥Columbia（Col-0）野生型，以及二穗短柄草参考基因组测序品种Bd21。

高粱种植步骤如下：挑选大小一致、饱满、无霉点、色泽好的高粱种子于5%次氯酸钠溶液中，摇床上震荡消毒10 min，然后用自来水冲洗数遍后，转入培养皿内并加入少量水（刚好没过），放置于37 ℃培养箱内，过夜，待种子露白后，播于漂浮在营养液中的纱网板上，营养液改良自木村氏培养液配方（表1），用NaOH调pH至5.8。高粱缺氮处理：对照组营养液详见表1，缺氮处理时将（NH4）₂SO₄、KNO₃、Ca（NO₃）₂·4H₂O替换成相应浓度的K₂SO₄和CaCl₂；对照组正常种植14 d，每7 d换营养液一次，试验组正常种植7 d（营养液见表1），然后缺氮处理种植7 d。放置于室内温室中白天30 ℃，12 h光照，光强约800 µmol/m²/s；晚上22 ℃，12 h黑暗。

表1 高粱营养液配方

Table 1 Component of sorghum nutrition solution

元素 Element	母液浓度（mol/L） Concentration of stock solution	终浓度（mmol/L） Final use concentration	母液组合 Group of stock solution
MgSO₄·7H₂O	0.547	0.5470	I
（NH4）₂SO₄	0.365	0.3650	I
KH₂PO₄	0.182	0.1820	II
KNO₃	0.183	0.1830	III
Ca（NO₃）₂·4H₂O	0.366	0.3660	III
MnCl₂·4H₂O	0.005	0.0005	IV
H₃BO₃	0.03	0.0030
（NH₄）₆Mo₇O₂₄·4H₂O	0.001	0.0001
ZnSO₄·7H₂O	0.004	0.0004
CuSO₄·5H₂O	0.002	0.0002
NaFe-EDTA·3H₂O	0.100	0.0400	V
MES	0.500	2.0000	VI

拟南芥Col野生型种子置于2.0 mL灭菌的离心管中，5%次氯酸钠溶液中消毒10 min，然后用灭菌的蒸馏水清洗5~6遍，吸干水分后放置在超净台上晾干，然后播种于1/2MS培养基中。先4 ℃冰箱放置48 h，然后放置于25 ℃恒温光照培养箱（日本松下/三洋MLR-352H-PC植物培养箱）培养。表型生长试验置于室内恒温23 ℃，16 h光照/8 h黑暗的温室中。拟南芥低氮、低磷实验：对照处理的培养基配方如表1所示；低氮处理时，（NH4）₂SO₄、KNO₃、Ca（NO₃）₂·4H₂O加入量仅为对照组的1/10，补充相应浓度的MgSO₄·7H₂O、KCl以及CaCl₂；低磷处理时，KH₂PO₄加入量仅为对照组的1/10，补充相应浓度的KCl。所有的培养液最后加入植物用凝胶8 g/L，灭菌待用。拟南芥沙培实验：沙子用反渗透水洗6~8遍，至基本无混浊；然后将洗净的沙子进行灭菌，沙子烘干后转入封底小钵，进行拟南芥种植；对照及低氮处理营养液如拟南芥低氮实验配制，但不加植物凝胶。每小钵苗从移栽到开花，相应营养液灌溉总量在300 mL左右，浇水使用反渗透纯净水。

二穗短柄草种子消毒同上，然后放置灭菌水中置于4 ℃冰箱放置36~48 h，然后置于25 ℃培养箱催芽，种植于底部开孔的96孔PCR板中，正常种植7 d（营养液见表1），缺氮处理种植7 d。缺氮处理时，（NH4）₂SO₄、 KNO₃、Ca（NO₃）₂·4H₂O替换成相应浓度的K₂SO₄和CaCl₂。对照组正常种植7 d（营养液见表1）后，更换营养液继续种植7 d。缺氮处理、对照组均放置于25 ℃恒温光照培养箱。文章所涉及的表型图片使用智能手机（小米note3）进行拍摄，拟南芥根长采用Image J软件（https：//imagej.nih.gov/ij/）测量。

1.2 RNA提取、第一链cDNA合成及PCR扩增

高粱及二穗短柄草缺氮处理的样品到指定时间后进行取样，高粱缺氮样品用于SbMYB-like基因克隆，而二穗短柄草缺氮样品用来进行SbMYB-like同源基因表达特性分析。取完样品后，快速浸入液氮，于-80 ℃超低温冰箱存放。待用时将样品取出，放入液氮充分预冷的植物样品研磨仪25 mL钢罐中研磨（Tissuelyser-64，上海净信实业发展有限公司），然后用Trizol试剂（上海英俊生物有限公司）提取总RNA。微分光光度计Nanodrop2000c（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）测定浓度和质量，要求280 nm/260 nm，260 nm/230 nm在1.8~2.0之间，同时进行1.2%琼脂糖电泳检测RNA条带，要求条带清晰、无拖尾，28S条带亮度大概是18S条带2倍最优。采用基因组DNA去除试剂盒TURBO DNA-free™ 试剂盒（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）按照说明进行总RNA的基因组污染去除。取2.5 µg总RNA，利用SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit（With gDNA Remover）（武汉赛维尔生物科技有限公司）先进行基因组污染处理，然后按照说明进行逆转录得到cDNA，置于-80 ℃待用。由于该基因预测无内含子，所以总RNA进行了严格的基因组污染去除。

1.3 基因克隆、载体构建、组织表达实时荧光定量PCR分析以及拟南芥转基因筛选

引物利用Oligo7.0软件（www.oligo.net）设计，由南京金斯瑞生物科技有限公司合成ePAGE级别引物，本研究所用引物详见表2。高保真Taq酶（PrimeSTAR^® HS DNA Polymerase，宝日医生物技术（北京）有限公司）进行PCR扩增得到目标条带后，凝胶回收（北京天根生物科技有限公司），然后利用pEASY^®-Blunt Zero Cloning Kit（北京全式金生物技术股份有限公司）进行T载体连接，挑取单克隆，菌液PCR确定阳性后，挑选3~6个单克隆测序（江苏金唯智生物科技有限公司），获取该基因转录本。利用KpnI/BamHI快切酶（赛默飞世尔科技（中国）有限公司）双酶切构建到35S1300gai载体上（以pCambia1300为基础改的载体）。基因表达实时定量分析采用SYBR方法进行。使用SYBR Premix Ex TaqTM试剂（宝日医生物技术（北京）有限公司），罗氏LightCycler480II荧光定量PCR仪，10 µL体系，3个生物学重复以及3个技术重复进行试验。PCR扩增程序如下：95 ℃ 1 min；94 ℃ 10 s，58 ℃ 10 s，72 ℃ 12 s，设定45个循环，相对表达水平采用2^{Δ（-ΔCp）}法计算。在计算高粱SbMYB-like基因在拟南芥超表达植株的表达量时，因SbMYB-like属于外源基因，对照Cp值自定义为32进行计算。拟南芥基因转化采用农杆菌浸花法，获得T₀代种子；播种于含有潮霉素的MS培养基中进行筛选，获得阳性苗自交获得T₁代种子；播种于含有潮霉素的MS培养基中进行筛选，然后计算分离比例，将符合3∶1分离的植株种植至少20株每株系，独立收种获得相应的T₂代种子；最终在T₃株系中鉴定到纯系。

表2 本研究所用所有引物

Table 2 All primers used in the study

引物名称 Name of primers	正向序列（5'-3'） Forward sequence（5'-3'）	反向序列（5'-3'） Reverse sequence（5'-3'）	用途 Purpose
SbMYB	ATGTCTGGGTCCAGGAACTCTT	TTAGTTCCAAGCTCCCTGTGTG	基因克隆引物
Bradi2g45770-qRT	TTTGCACTGAATGTAACCTCC	TCCGATCCTAAATTGTTGTCGAA	定量PCR引物
Bradi2g45780-qRT	AAGCATACCGATATATTGTGA	AAGGCGGATTTAATTTAGCAA	定量PCR引物
BdUBC18 qRT-PCR	GTCACCCGCAATGACTGTAAGTTC	TTGTCTTGCGGACGTTGCTTTG	二穗短柄草中看家基因定量PCR引物
UBC.qPCR	CTGCGACTCAGGGAATCTTCTAA	TTGTGCCATTGAATTGAACCC	拟南芥中看家基因定量PCR引物
SbActin	ATGGCTGACGCCGAGGATATCCA	GAGCCACACGGAGCTCGTTGTAG	高粱中看家基因定量PCR引物
Sb03g030330KpnI/BamHI	AAGGTACCATGTCTGGGTCCAGGAACTCTTC	AAGGATCCTTAGTTCCAAGCTCCCTGTGTGT	基因载体构建引物
Sb03g030330 94qRT	CGCCGCCATTATGAGATCCT	AGTTCCAAGCTCCCTGTGTG	定量PCR引物

1.4 保守结构域预测、亚细胞定位预测、序列联配和进化树分析

保守结构域采用在线程序CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）预测。基因亚细胞定位使用Euk-mPLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2）。拟南芥（https：//www.arabidopsis.org/）、水稻（https：//rice.plantbiology.msu.edu/）、玉米（https：//www.maizegdb.org/）、高粱、谷子以及二穗短柄草中（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/pz/portal.html）同源基因采用BLASTP搜索。所有的入选基因编码的氨基酸序列用ClustalX1.83软件（www.clustal.org）进行序列联配，通过MEGA7.0软件（https：//www.megasoftware.net）采用邻结法（NJ）进行进化树构建，设置bootstrap为1000次。

2 结果与分析

2.1 基因克隆及序列生物信息学分析

以BTX623品种在苗期缺氮条件下，地上部分总RNA合成的第一链cDNA为模板，按照网上预测的转录本参考序列（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/pz/portal.html）设计引物进行PCR扩增（表2），获得目标条带后，测序确认SbMYB-like基因序列。该基因没有内含子，仅有1个外显子，编码含87个氨基酸的蛋白质。通过NCBI保守结构域搜索分析，显示出该基因编码了1个SANT/Myb-like DNA-binding domain，该结构域在第16位氨基酸到第60位氨基酸之间（图1）。另外利用亚细胞定位预测软件Euk-mPLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/euk-multi-2），预测该基因编码蛋白定位于细胞核。

图1 SbMYB-like基因编码蛋白保守结构域分析

Fig.1 Conserved domain analysis of SbMYB-like

2.2 SbMYB-like基因表达特性分析

高粱组织表达实时荧光定量PCR分析表明，该SbMYB-like转录因子主要在叶片中表达，而在根中、茎秆几乎无表达，仅在穗中略有表达，与表达谱中主要在地上部分表达^［

19］也是一致的（图2）。

图2 SbMYB-like基因组织表达qRT-PCR分析

Fig.2 qRT-PCR analysis of SbMYB-like tissue expression

2.3 SbMYB-like基因系统进化分析

将SbMYB-like编码蛋白序列在各物种包括高粱、水稻、拟南芥、玉米、二穗短柄草等参考基因组数据库中进行BLASTP检索，找出其蛋白序列相似度最高的基因共计11个，进行序列联配和进化树的构建。蛋白序列联配的结果显示，各序列在SANT/Myb-like domain上保守性总体比较高，在其他区域差别相对较大，特别是靠近N端区域（图3A）。结合序列联配比对和进化树信息，与SbMYB-like编码蛋白最为相近的是玉米GRMZM2G049378以及GRMZM2G121753，其次是与二穗短柄草中的Bradi2g45770/Bradi2g45780亲缘关系也较近，与谷子、水稻、拟南芥的中基因距离相对较远，特别是拟南芥中的基因。

图3 SbMYB-like与同源基因编码蛋白序列联配及进化树分析

Fig.3 Protein sequence alignment of SbMYB-like and other homologs， and phylogenetic tree analysis

A：SbMYB-like（Sb03g030330）与其他10个同源基因编码蛋白序列联配，分别是来自于高粱的Sb09g028790，玉米的GRMZM2G049378和GRMZM2G121753，二穗短柄草的Bradi2g45770和Bradi2g45780，谷子的Seita.5G260200和Seita.5G259700，水稻的LOC_Os07g26150和LOC_Os01g47370，拟南芥的AT1G75250；红线标注的是SANT/Myb-like DNA-binding结构域；B：SbMYB-like与其他10个同源基因编码蛋白进化树构建

A： Protein sequence of SbMYB-like （Sb03g030330） aligns with other 10 homologs， namely Sb09g028790 from sorghum， GRMZM2G049378 and GRMZM2G121753 from maize， Bradi2g45770 and Bradi2g45780 from Brachypodium P. Beauv.， Seita.5G260200 and Seita.5G259700 from foxtail millet， LOC_Os07g26150 and LOC_Os01g47370 from rice， AT1G75250 from Arabidopsis Heynh.； red line indicates SANT/Myb-like DNA-binding domain； B： Phylogenetic tree construct of proteins encoded by SbMYB-like and other 10 homologs

2.4 SbMYB-like其他物种中同源基因受缺氮诱导特性分析

为了验证该基因功能保守性，在二穗短柄草中进行SbMYB-like同源基因受缺氮诱导情况分析。野生型二穗短柄草缺氮处理7 d，缺氮下的植株已表现出叶片失绿、发黄，特别是较老的叶片，表明二穗短柄草已出现缺氮症状（图4A）。取地上部分进行基因表达实时荧光定量分析，结果表明二穗短柄草中这两个同源基因也受缺氮强烈诱导，特别是Bradi2g45780（图4B）。说明SbMYB-like在二穗短柄草中可能具有同样功能。

图4 SbMYB-like在二穗短柄草中同源基因受缺氮诱导情况分析

Fig.4 Expression of SbMYB-like homologs in Brachypodium P. Beauv. under nitrogen deficiency conditions

A：二穗短柄草缺氮处理7 d地上部表型。CK：对照；-N：缺氮处理；B：二穗短柄草中两个同源基因受缺氮诱导情况qRT-PCR分析

A： Shoots phenotype of Brachypodium P. Beauv. under nitrogen deficiency conditions for seven days. CK： Control； -N： Nitrogen deficiency；B： qRT-PCR analysis of two homologs under nitrogen deficiency conditions in Brachypodium P. Beauv.

2.5 SbMYB-like拟南芥超表达植株中基因表达分析

SbMYB-like拟南芥转基因植株T₂代利用抗性筛选鉴定，保留符合单基因遗传规律的株系，最终在T₃抗性基因筛选鉴定得到8个纯系，对这8个株系进行了SbMYB-like基因表达实时荧光定量分析。结果表明相较于空载体转基因对照，这8个株系的SbMYB-like基因表达水平范围为200~6000倍（图5），不同株系SbMYB-like基因表达水平的变异相对丰富。通过纯系鉴定，获得了8个SbMYB-like不同表达量的单基因插入纯系。

图5 SbMYB-like拟南芥超表达株系基因表达分析

Fig.5 Expression of SbMYB-like in overexpression Arabidopsis Heynh. plants

WT（EV）代表空载体转基因对照，OEs代表不同超表达株系

WT（EV） represents empty vector transgenic control， OEs represents different overexpression lines

2.6 SbMYB-like拟南芥超表达植株根系低氮、低磷表型分析

因该基因受缺氮和缺磷诱导，特别是缺氮，不论是植株地上部分还是根系都受缺氮诱导。根系是植物吸收养分的重要器官，氮素对根系构型有重要的调控作用。为探索该基因是否参与氮素对根系调控，挑选了5个代表不同表达量的单基因超表达株系（OE6-2、OE30-3、OE19-2、OE28-2以及OE23-14）进行低氮、低磷处理，观察根系低氮、低磷的反应。结果显示株系OE6-2和OE30-3主根不论是在正常条件下或是低氮诱导情况下，或是在低磷主根生长抑制条件下，都显示出主根长度显著长于野生型植株，而其他株系主根较野生型根系长度并无显著差异（图6A~D）。为了确认主根的伸长或抑制是否依赖于外界氮素和磷素的供应，对低氮、低磷诱导主根伸长的比例也进行了统计，结果显示不论低氮还是低磷条件下，对根系伸长或是抑制的比例较野生型无显著变化（图6E）。结果表明SbMYB-like在拟南芥中超表达，可以促进根系伸长，但不依赖于外源氮或磷源水平。

图6 SbMYB-like拟南芥超表达株系根系低氮、低磷条件下表型分析

Fig.6 Performance analysis of the roots of SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpression lines under low nitrogen and low phosphate conditions

A~C：Col野生型及5个SbMYB-like拟南芥超表达株系在正常条件下（A）、低氮条件下（B）和低磷条件下（C）根系表型；D：Col野生型及5个SbMYB-like拟南芥超表达株系在不同处理条件下主根长度统计；+N+P：氮磷充足，1/10N：氮素浓度为充足水平下的1/10，1/10P：磷素浓度为充足水平下的1/10； E：Col野生型及5个SbMYB-like拟南芥超表达株系主根在缺氮或缺磷条件下诱导或抑制的比例统计。Bar=2 cm

A-C： Root phenotypes of Col and five SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpressing lines under normal （A）， low nitrogen （B） and low phosphate conditions （C）； D： Primary root lengths of Col and five SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpression lines under different treatment conditions； +N+P： The sources of N and P were sufficient， 1/10N： Concentration of sources of N is 1/10 of that of sufficient condition， 1/10P： Concentration of sources of P is 1/10 of that of sufficient condition； E： Ratio of primary roots induced or inhibited under nitrogen or phosphorus deficiency conditions of Col and five SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpression lines. Bar=2 cm

2.7 SbMYB-like拟南芥超表达植株对开花的影响

氮素对植物开花有重要影响，通常情况下，在拟南芥及水稻中缺氮促进开花，而氮过于丰富则延迟开花^［

6-7］。为了验证SbMYB-like基因是否对开花有影响，选取了两个SbMYB-like表达有显著差异的拟南芥超表达株系，OE30-3代表高丰度表达株系，OE28-2代表低丰度表达株系进行试验。利用沙培，采用底部无小孔的小钵进行营养液供应栽培。一组进行正常氮养分供应，一组采用1/10氮进行处理，每组每个株系8个重复共计16株苗。结果显示在正常条件下，两个超表达株系均提前开花，抽薹时期的莲座叶数目显著少于野生型植株；而在低氮条件下，两个超表达株系仍较野生型提前开花，其中超表达株系OE30-3与野生型的莲座叶差异达到极显著（图7）。结果表明SbMYB-like基因在拟南芥中超表达能够促进开花。

图7 SbMYB-like拟南芥超表达株系在不同氮水平下开花时间分析

Fig.7 Analysis of flowering time of SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpression lines under different nitrogen levels

A：野生型及两个SbMYB-like拟南芥超表达株系在氮充足和低氮条件下开花时表型；+N：氮充足条件，1/10N：氮素浓度为充足水平下的1/10；B：野生型及两个SbMYB-like拟南芥超表达株系在氮充足和低氮水平下开花时莲座叶数目统计；T检测，*在P<0.05水平上差异显著，**在P<0.01水平上差异显著

A： Growth performance of WT and two SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpressing lines at flowering period under nitrogen sufficient and low nitrogen conditions； +N： nitrogen sufficient conditions， 1/10N： Concentration of sources of N is 1/10 of that of sufficient condition； B： Number of rosette leaves of WT and two SbMYB-like Arabidopsis Heynh. overexpressing lines at flowering stage under different treatments. Student's t-test，* significant difference at the P<0.05 level， ** significant difference at the P<0.01 level

3 讨论

氮肥是保障农作物高产稳产的重要因素之一，挖掘氮缺乏诱导基因有助于解析氮高效的分子机理。本研究克隆了高粱受缺氮特异诱导的SbMYB-like基因，并进行了其他物种中同源基因缺氮诱导特性分析，在拟南芥中进行超表达转化，对转基因纯系进行了根系表型和开花时间的观察。

从前期高粱苗期氮缺乏（-N）、磷缺乏（-P）以及钾缺乏（-K）表达谱研究中，本课题组筛选出一些NPK缺乏特异诱导基因。其中1个SbMYB-like转录因子，该基因不论是在地上部分还是根系中都受缺氮特异诱导，特别是地上部分强烈受缺氮诱导，缺磷地上部分略有诱导，而缺钾几乎不受影响^［

19］。本研究克隆了该基因，实时荧光定量分析SbMYB-like基因组织表达，表明该基因主要在叶片中表达（图2），而且受缺氮特异诱导。同属一个转录因子家族的拟南芥AtmybL2基因，也是主要在叶片中表达^{［参考文献 11

百度学术}11］，表明该基因可能主要在叶片中起作用。SbMYB-like基因在玉米和二穗短柄草中的同源基因都有两个，而高粱SbMYB-like与玉米中的两个基因最相近（图3），与高粱中其他MYB基因相似性并不高，有可能该基因功能在高粱中与玉米、二穗短柄草中有所分化，而且是1∶2的进化关系。与拟南芥中编码蛋白相似度最高的基因是AT1G75250，从蛋白序列联配和进化树来看，AT1G75250编码蛋白在C端比SbMYB-like多出一段，很可能该基因在拟南芥中并无同源基因。玉米中已发表的数据表明，与高粱SbMYB-like同源的基因GRMZM2G049378以及GRMZM2G121753在叶片中也受缺氮强烈诱导。不论是在玉米品种B73还是A188中，在缺氮20 d和30 d的叶片中都受缺氮诱导，而且30 d更强烈^{［参考文献 20

百度学术}20］。玉米和二穗短柄草中的两个同源基因都受缺氮强烈诱导，表明SbMYB-like基因功能可能在单子叶植物中功能比较保守，与双子叶中的基因功能可能有很大不同。

高粱SbMYB-like基因在拟南芥中进行超表达转化，转基因纯系根系表型分析表明该基因能够促进根系伸长，但是该基因对根系的促进作用并不依赖外界氮素或是磷素水平（图6）。而且只有两个株系OE6-2和OE30-3对根系有促进作用，其他株系较野生型无显著差异。而株系OE6-2和OE30-3中SbMYB-like基因表达水平是8个超表达株系中最高的两个（图5），分别为6000倍、3000倍，可能该基因对根系的促进伸长作用需要基因表达量达到一定阈值才能发挥作用。尽管本研究发现SbMYB-like基因在促进拟南芥主根伸长上，并不依赖外界氮素水平（图6）。然而氮对植物侧根、根毛的生长发育也至关重要^［

21］，SbMYB-like有可能参与了氮依赖的侧根和根毛的伸长调控，因此下一步有必要研究SbMYB-like基因在侧根或是根毛中的调控作用。另外生长素是调控植物根系生长发育的核心激素^{［参考文献 22

百度学术}22］，高粱SbMYB-like基因促进根系的伸长可能通过生长素信号途径。将来利用转录组分析、生长素测定、生长素标记基因等，鉴定与生长素信号途径相关基因，解析该基因参与根系调控的分子途径。通常情况下，氮素水平对植物开花有重要影响^{［参考文献 6-7}6-7］。如小麦MYB-related家族成员TaMYB72转化水稻，发现对水稻开花有促进作用^{［参考文献 15

百度学术}15］。拟南芥中MYB-related基因FE，也发现参与了开花时间的调控^{［参考文献 16

百度学术}16］。本研究表明SbMYB-like基因在拟南芥中也能促进开花，与基因的表达量也呈现一致对应关系，且这一促进作用并不是氮素水平依赖性的。考虑到MYB-related基因家族成员众多，TaMYB72和FE基因是否受缺氮诱导，SbMYB-like调控开花的分子机制是否与TaMYB72和FE一致或是不同，有待进一步深入研究。尽管SbMYB-like基因受缺氮强烈诱导，在拟南芥中超表达株系的表型不论是促进根系伸长或是促进开花，结果都表明这些作用与外界供应氮素水平无关。高粱SbMYB-like与拟南芥中基因编码蛋白序列相似度低，拟南芥中很可能没有该基因的同源基因，而在玉米和二穗短柄草中有高度相似的基因（图3），可能该基因功能在单子叶和双子叶植物中存在不同。因此高粱SbMYB-like在拟南芥中异源表达，对根伸长以及开花的促进不依赖于外界氮素水平也是可能的。下一步需要在高粱、玉米等作物中进行该基因功能验证，才有可能解析该基因参与高粱缺氮诱导的响应分子机制。MYB-related家族成员作用广泛，如参与次生代谢途径、节律等其他途径的调控^{［参考文献 8-9}8-9， 11， 13］，该基因对根系和开花的促进可能属于间接作用，将来通过RNA-seq、Chip-seq等技术手段进一步挖掘该基因调控网络有助于阐明该基因功能。此外因SbMYB-like基因主要在叶片中表达，下一步研究重点要集中在地上部分的观察上，包括叶片发育、植株产量等生长参数的研究。该基因能促进根系伸长，未来可能有助于培育根系发达的作物，改良根系构型，提高养分吸收效率，培育养分高效作物。

4 结论

本研究克隆了前期在高粱苗期缺氮、缺磷以及缺钾表达谱中鉴定到的1个受缺氮特异诱导的转录因子SbMYB-like基因，该基因在玉米和二穗短柄草中的同源基因也同样受缺氮强烈诱导，在拟南芥中超表达SbMYB-like基因，显著促进了拟南芥主根伸长以及植株开花，该促进作用并不依赖外界氮素水平，表明该基因是植株根系伸长及开花的重要调控基因，但有关该基因参与高粱缺氮响应分子机制有待进一步深入研究。

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