胡麻亚麻酸亚油酸相关<bold>KASP</bold>标记的开发

穆艳鑫; 伊六喜; 高凤云; 赵小庆; 周宇; 贾霄云; 何江峰; 苏少锋; 斯钦巴特尔; MU Yan-xin; YI Liu-xi; GAO Feng-yun; ZHAO Xiao-qing; ZHOU Yu; JIA Xiao-yun; HE Jiang-feng; SU Shao-feng; SIQIN Bateer

网刊加载中。。。

使用Chrome浏览器效果最佳，继续浏览，你可能不会看到最佳的展示效果，

确定继续浏览么?

复制成功，请在其他浏览器进行阅读

胡麻亚麻酸亚油酸相关KASP标记的开发 PDF

- ORCID：
穆艳鑫 ^1,2
✉
- ORCID：
伊六喜 ⁴
- ORCID：
高凤云 ³
- ORCID：
赵小庆 ¹
- ORCID：
周宇 ³
- ORCID：
贾霄云 ³
- ORCID：
何江峰 ¹
- ORCID：
苏少锋 ¹
- ORCID：
斯钦巴特尔 ¹
✉

1. 内蒙古自治区农牧业科学院生物技术研究所，呼和浩特 010013； 2. 内蒙古大学生命科学学院，呼和浩特 010070； 3. 内蒙古自治区农牧业科学院特色作物研究所，呼和浩特 010013； 4. 内蒙古农业大学农学院，呼和浩特 010019

最近更新：2023-01-12

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20220727002

目录contents

摘要

胡麻是北方地区特有的、富含不饱和脂肪酸的油料作物。培育高亚麻酸品种、高亚油酸品种是胡麻品质育种的主要目标。分子标记辅助选择能提高胡麻育种效率，缩短育种年限。本研究进行了胡麻资源材料自然群体多年多点脂肪酸检测数据的统计分析和基因分型、群体构建、亚麻酸、亚油酸相关SNP位点的KASP基因分型及其验证等研究，取得了以下几个方面的结果：（1）检测246份胡麻种质资源材料多年多点5种脂肪酸成分，并对其进行了统计分析。相关性分析结果显示，亚麻酸与其他成分之间呈极显著负相关，尤其是亚麻酸和亚油酸之间负相关性最高；（2）对5种脂肪酸表型数据进行统计分析，确定了亚麻酸、亚油酸相关SNP标记分型群体：包括49份高亚麻酸（≥54%）材料、36份低亚油酸（≤13.5%）材料，及8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）高亚油酸低亚麻酸材料；（3）验证并确定了7个SNP位点：g6-6229142、g10-19305239、g9-18961021与亚麻酸显著关联；g6-19208888、g9-14900088、g15-22369840和g2-7680441与亚油酸显著关联；（4）对确定的7个SNP位点进行了高通量测序，结果与KASP基因分型结果完全一致，证明KASP基因分型体系的有效性及准确性。

关键词

胡麻; 脂肪酸; SNP标记; KASP基因分型; SNP验证

胡麻（Linum usitatissimum L.，2n=2x=30），属油用亚麻，亚麻科（Linaceae）亚麻属一年生草本植物，具有较强耐旱耐寒耐贫瘠特点，其生长周期短，适应性强，主要生长于我国西北和华北干旱半干旱地区^［

1］。油用胡麻籽含油率为45%~55%，其中亚油酸和α-亚麻酸总含量可高达60%以上^{［参考文献 2-3}2-3］。亚油酸和α-亚麻酸作为长链多不饱和脂肪酸，对人体具有多重保健功能，是构成人体脑细胞和组织细胞的重要成分，是一种人体必需脂肪酸，与视力、脑发育和行为发育密切相关^{［参考文献 4

百度学术}4］；此外亚麻酸在降血脂血糖、抗氧化、抗菌消炎、抗癌、防治心血管疾病、抗糖尿病及脑部、视网膜发育等都起着关键作用^{［参考文献 5

百度学术}5］。因此培育高亚麻酸品种和高亚油酸品种是胡麻育种的主要目标之一。

目前胡麻育种仍然以常规育种技术为主，育种周期长，效率低。而采用分子标记辅助选择技术对目标基因进行鉴定，更为准确、简便，而且不受环境影响，效率较高。单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism），是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸（A、T、C、G）的替换而引起的多态性，SNP具有密度高、多态性丰富、易于实现自动化检测和分析、遗传稳定、易于基因分型等优点，作为第3代的遗传标记，SNP在作物遗传图谱构建、基于连锁不平衡的关联图谱、基因定位、品种纯度鉴定、遗传多样性和物种亲缘关系研究、分子标记辅助育种中具有巨大潜力^［

6-7］。竞争性等位基因特异性PCR（KASP，kompetitive allele specific PCR）是目前SNP 基因分型的主要方法之一^{［参考文献 8

百度学术}8］，只需合成2个不同颜色的荧光基团和双链通用探针，无需针对每个SNP位点分别设计荧光探针，具有高通量、便捷、低成本的特点^{［参考文献 9

百度学术}9］。该技术在植物基因作图、基因分型、遗传多样性以及植物分子标记辅助育种等方面具有广泛的应用前景。陈思平^{［参考文献 10

百度学术}10］通过国际水稻基因组数据库获得565个SNP位点并利用481个水稻种质资源对与产量及品质相关的目标性状SNP位点进行KASP基因分型验证，获得了37个与粒型、粒重显著相关的标记。Cheon等^{［参考文献 11

百度学术}11］在韩国温带粳稻品种中开发了基于SNP的1225个多态性KASP标记，平均分布在水稻基因组中，标记密度为每Mb 3.3个KASP标记。所开发的KASP标记将为温带粳稻的QTL/基因定位和分子标记辅助选择提供依据。CerealsDB（www.cerealsdb.uk.net）是一个包含一系列小麦（Triticum aestivum L.）基因组数据集的在线数据库，该数据库当前包含超过100，000个推定的品种SNP，通过KASP进行分型验证，其中数千个已通过实验验证^{［参考文献 12

百度学术}12］。Wilkinson等^{［参考文献 13

百度学术}13］在六倍体面包小麦中开发和验证了1114个SNP标记，并且在CerealsDB数据库中报道了在23个小麦品种中的KASP基因分型结果。利用这些被验证了的SNP标记，在Avalon×Cadenza的双单倍体作图群体中绘制生成了连锁图。Rasheed等^{［参考文献 14

百度学术}14］开发并验证了152对与小麦适应性、产量、胁迫等经济性状相关的KASP标记，结果显示这些标记与栽培品种、双亲群体相关表型显著相关，同时验证了KASP检测的速度比基于凝胶PCR标记高45倍，KASP标记的开发有助于小麦育种计划中最大限度地提高遗传收益。张维军等^{［参考文献 15

百度学术}15］利用4个粒重相关指标和4个粒重相关基因的KASP标记，对209份小麦种质资源进行基因背景分析，阐明了7种优异单倍型组合对籽粒表型性状的综合效应，为分子标记辅助育种提供支撑。纯度是玉米种子质量的重要指标之一，杂交种的纯度高低是影响田间产量、品质以及农民收益的关键因素之一。王蕊等^{［参考文献 16

百度学术}16］基于12套玉米杂交种样本及335份标准SNP指纹，从384个SNP基础位点中筛选获得了60个侯选位点，确定了20个引物作为玉米杂交种纯度鉴定的核心引物，能够有效鉴定99.7%的供试样品纯度。玉米自交系中存在大量SNP位点的变异，这些变异的SNP位点能够起到划分玉米杂种优势群，构建连锁群，及确定种质遗传资源背景的作用。陆海燕等^{［参考文献 17

百度学术}17］利用205份不同来源的玉米自交系全基因组重测序数据，过滤出1，660，336个SNP位点，开发出700个KASP分子标记，其中202个KASP标记得以验证。经济作物中基于KASP技术的基因分型多为抗病基因。Zhao等^{［参考文献 18

百度学术}18］结合全基因组关联研究、QTL-seq和转录组测序在棉花VW抗性120个SNP中，确定了8个黄萎病抗性候选基因，10个KASP标记在不同的棉花品系中成功验证可用于标记辅助育种以增加VW抗性。在番茄中针对Ty-1、Mi-1、Tm-22、Sw-5和Frl 5个抗病基因建立了KASP技术分型体系并与普通PCR结果比对一致，加速了番茄抗病性基因的鉴定^{［参考文献 19

百度学术}19］。胞囊线虫（SCN，soybeen cyst nematode）病是大豆主要病害之一，世界各地大豆产区均有发生。练云等^{［参考文献 20

百度学术}20］利用SCN抗性主效位点rhg1和Rhg4的7套KASP标记，对487份大豆材料进行分析，筛选出了20份含有抗性位点并且农艺性状优异的材料，为培育抗病大豆新品种奠定了基础。孟君仁等^{［参考文献 21

百度学术}21］通过与现有桃种质资源的基因组序列进行比对，对桃果实外观、抗性、肉质等5对性状30份材料进行基因分型验证，获得与目标性状紧密连锁的KASP标记，以加速品种培育，缩短育种年限。KASP分子标记辅助育种在马铃薯^{［参考文献 22

百度学术}22］、苹果^{［参考文献 23

百度学术}23］、辣椒^{［参考文献 24

百度学术}24］、向日葵^{［参考文献 25

百度学术}25］等经济作物中也进行了相关的育种研究。

在前期研究中利用胡麻F₂群体绘制了高密度遗传连锁图谱并进行了QTL定位，获得亚麻酸、亚油酸相关的QTL分别为4个和5个，共计63个SNP位点。经过GWAS分析得到亚麻酸、亚油酸相关SNP位点9个，共计72个位点^［

28-29］。本研究针对这些SNP位点，采用KASP基因分型技术，进行基因分型和验证，同时建立稳定、有效的SNP位点检测与基因分型的KASP-SNP分型技术体系。本研究的实施及完成将从分子层面进行胡麻种质资源的鉴定和亚麻酸、亚油酸相关分子标记的开发，可为提高胡麻品质育种效率提供理论和技术支持。

1 材料与方法

1.1 试验材料

收集胡麻种质资源材料246份，其中国内材料126份，国外材料120份（表1）。将供试种质资源材料连续2年（2019-2020年）种植于内蒙古呼和浩特市（40°46′N，111°39′E）、乌兰察布市察哈尔右翼前旗（41°13′N，113°10′E）、锡林郭勒盟太仆寺旗（42°21′N，115°19′E）和新疆伊犁州（43°55′N，81°05′E）4个不同地区。每份材料种植3行，行距20 cm，行长1.5 m，重复2次。常规的田间管理方法进行管理，成熟后收集种子，提取脂肪酸成分。

表1 参试材料名称和来源

Table1 The name and origin of the accessions studied

编号 No	名称 name	来源 origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin
1	坝亚15号	中国河北	26	H919	中国内蒙古	52	东乡白	中国甘肃	77	雁农1号	中国山西
2	宁亚21	中国宁夏	27	H920	中国内蒙古	53	Drane	法国	78	PALE	美国
3	轮选2号	中国内蒙古	28	NO 841	乌拉圭	54	坝亚1号	中国河北	79	OTTAWA	美国
4	晋亚2号	中国山西	29	H922	中国内蒙古	55	静宁选2号	中国宁夏	80	宁亚17号	中国宁夏
5	定西17	中国甘肃	30	伊亚4号	中国新疆	56	天水线	中国甘肃	81	KENY C.1.709	波兰
6	天水市老胡麻	中国甘肃	31	内亚六号	中国内蒙古	57	CALAR	奥地利	82	临泽白	中国甘肃
7	黄胡麻	加拿大	32	PI177451	土耳其	58	张亚1号	中国河北	83	天亚5号	中国甘肃
8	CH-89	中国内蒙古	33	BLANC	加拿大	59	CHAURRAOLA	匈牙利	84	JWS	非洲
9	线胡麻	中国甘肃	34	PI1181058	土耳其	60	MOROCCD	摩洛哥	85	KOREAN	阿富汗
10	同亚9号	中国山西	35	山丹白	中国甘肃	61	陇杂1号	中国甘肃	86	RTEN TINE	美国
11	BGOLDXREDWING44X3	美国	36	礼县低角	中国甘肃	62	清亚1号	中国甘肃	87	LINA GROSSES	法国
12	坝亚7号	中国河北	37	坝810	中国河北	63	CRISTA FIBER	加拿大	88	皋兰白	中国甘肃
13	同亚8号	中国山西	38	尧甸白胡麻	中国甘肃	64	东乡红2号	中国甘肃	89	民勤胡麻	中国甘肃
14	TY58	巴基斯坦	39	天亚6号	中国甘肃	65	VIRING	法国	90	宁亚19号	中国宁夏
15	西礼白	中国甘肃	40	坝亚11号	中国河北	66	定亚9号	中国甘肃	91	内亚油一号	中国内蒙古
编号 No	名称 name	来源 origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin
16	TY21	巴基斯坦	41	陇亚8号	中国甘肃	67	沙县	中国山西	92	陇亚4号	中国甘肃
17	坝亚13号	中国河北	42	15F-565 （808）	加拿大	68	内蒙红	中国内蒙古	93	DEHISLINTL CREPIIN	俄罗斯
18	同亚11号	中国山西	43	89-21	西德	69	天水渭南	中国甘肃	94	AC EMERSON	加拿大
19	灵台五星	中国甘肃	44	宁亚14	中国宁夏	70	礼县	中国甘肃	95	崇礼小	中国河北
20	伊亚3	中国新疆	45	MIMI B15	美国	71	天亚1号	中国甘肃	96	晋亚4号	中国山西
21	张亚2	中国河北	47	宁亚6号	中国宁夏	72	MACBETH	加拿大	97	VIMY	加拿大
22	晋亚8	中国山西	48	尚义详	中国河北	73	雁杂10号	中国山西	98	陇亚10号	中国甘肃
23	康东1	中国甘肃	49	宁亚15号	中国宁夏	74	定西红	中国甘肃	99	轮选3号	中国内蒙古
24	定亚15	中国甘肃	50	宁亚2号	中国宁夏	75	12号	中国黑龙江	100	晋亚7号	中国山西
25	PALE（BLVE）	美国	51	库车	中国新疆	76	临汾白胡麻	中国甘肃	101	坝选3号	中国河北
102	莎车早熟红	中国新疆	128	陇亚11号	中国甘肃	155	CFRESBR95	荷兰	190	I191	伊朗
103	平罗红	中国宁夏	129	15-566	加拿大	156	CFRESBR91	荷兰	191	I184	伊朗
104	NO 547	摩洛哥	130	轮选1号	中国内蒙古	157	CFRESBR105	荷兰	192	I157	伊朗
105	定亚5号	中国甘肃	131	陇亚6号	中国甘肃	158	CFRESBR96	荷兰	193	I185	伊朗
106	晋亚1号	中国山西	132	LILA	波兰	159	CFRESBR107	荷兰	194	I187	伊朗
107	晋亚11号	中国山西	133	SUMPERSKYZDR	波兰	160	CFRESBR94	荷兰	195	I159	伊朗
108	莎车亚麻	中国新疆	134	天亚9号	中国甘肃	161	CFRESBR111	荷兰	196	ARGENTINA589	阿根廷
109	集宁2号	中国内蒙古	135	坝亚6号	中国河北	163	CFRESBR99	荷兰	197	ARGENTINA592	阿根廷
110	粒高杆	中国内蒙古	136	定亚18号	中国甘肃	165	CFRESBR1077	荷兰	198	ARGENTINA597	阿根廷
111	坝68-1-542	中国河北	137	庆阳老	中国甘肃	166	CFRESBR1076	荷兰	199	ARGENTINA594	阿根廷
112	雁北7532-4	中国山西	138	匈牙利3号	匈牙利	168	CFRESBR1091	荷兰	200	ARGENTINA591	阿根廷
113	陇亚1J号	中国甘肃	139	新18号	中国新疆	169	CFRESBR21101	荷兰	201	ARGENTINA595	阿根廷
114	陇亚13J号	中国甘肃	140	15-510	俄罗斯	171	CFRESBR1089	荷兰	202	ARGENTINA600	阿根廷
116	华德小胡麻	中国内蒙古	141	宁亚11号	中国宁夏	172	CFRESBR1095	荷兰	205	PAKISTAN160	巴基斯坦
117	喀拉沁	中国内蒙古	142	宁亚7号	中国宁夏	173	Hungry 140	匈牙利	206	PAKISTAN169	巴基斯坦
118	乌拉特3号	中国内蒙古	143	庆阳	中国甘肃	174	Hungry 138	匈牙利	209	PAKISTAN181	巴基斯坦
119	集宁1号	中国内蒙古	144	NORTHDK510	美国	175	Hungry 145	匈牙利	210	PAKISTAN170	巴基斯坦
120	伊尖44-53	中国新疆	146	NORTHDK507	美国	176	Hungry 137	匈牙利	212	PAKISTAN165	巴基斯坦
121	克山1号	中国内蒙古	147	NORTHDK514	美国	177	Hungry 146	匈牙利	213	FRANCE313	法国
122	May-11	加拿大	149	NORTHDK518	美国	178	Hungry 141	匈牙利	215	FRANCE316	法国
编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin	编号No	名称 Name	来源 Origin	编号 No	名称 Name	来源 Origin
123	晋亚5号	中国山西	236	乌19号	中国内蒙古	248	安西红胡麻	中国甘肃	261	CDC ARRAS	加拿大
124	化德小胡麻	中国内蒙古	150	NORTHDK505	美国	249	灵台五星	中国甘肃	262	NOR MAN	加拿大
125	2号	罗马尼亚	151	NORTHDK509	美国	179	Hungry 147	匈牙利	263	CDC BETHIMC	加拿大
126	多伦大胡麻	中国内蒙古	152	CFRESBR108	荷兰	180	Hungry 150	匈牙利	216	FRANCE314	法国
127	内亚7号	中国内蒙古	153	CFRESBR115	荷兰	184	Hungry 240	匈牙利	218	FRANCE319	法国
223	MONTN19	美国	154	CFRESBR106	荷兰	185	Hungry 248	匈牙利	220	FRANCE295	法国
224	MONTN16	美国	237	临河17号	中国内蒙古	186	Hungry 247	匈牙利	221	FRANCE291	法国
225	RUSSI6	俄罗斯	238	乌25号	中国内蒙古	250	AC Lightning	加拿大	222	MONTN7	美国
226	RuSSI5	俄罗斯	239	乌402号	中国内蒙古	251	AC EMERSON	加拿大	264	静宁红胡麻	中国宁夏
227	INDI69	印度	240	大粒6号	中国河北	253	AC Linora	加拿大	265	10446146	阿根廷
228	INDI68	印度	241	乌17号	中国内蒙古	254	CI637PI91037	俄罗斯	266	晋亚6号	中国山西
229	EGYPT66	埃及	242	乌13号	中国内蒙古	255	AC MCBETH	加拿大	267	G7	中国新疆
230	EGYPT65	埃及	243	乌44号	中国内蒙古	256	AC HNLEY	加拿大	268	临夏白	中国甘肃
232	EGYPT62	埃及	244	乌53号	中国内蒙古	257	AC MCDUFF	加拿大	269	R43	中国内蒙古
233	MINNESOT8	美国	245	乌33号	中国内蒙古	258	CI2824	俄罗斯	270	坝亚12号	中国河北
234	MINNESOT9	美国	246	乌41号	中国内蒙古	259	CI2786	新西兰
235	MINNESOT61	美国	247	乌19号	中国内蒙古	260	CI1499PI194000	美国

1.2 试验方法

1.2.1 胡麻种子脂肪酸成分提取及检测

采用超声波辅助正己烷浸出法提取胡麻种子脂肪酸，用气相色谱技术检测棕榈酸、硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸，按面积归一化法以峰值面积计算5种脂肪酸成分相对含量。每个环境2个重复的脂肪酸检测数据求计算平均值，作为一个环境的表型数据。最后，用SPSS 22软件，对每个资源材料8个环境的数据进行统计分析，包括最大值、最小值、平均值、标准差、变异系数以及性状之间的Pearson相关性分析^［

26-27］。

1.2.2 胡麻基因组DNA提取

采集新鲜嫩叶，用高通量组织研磨仪（Qiagen，德国）进行组织研磨，按照LabServ Plant DNA Kit核酸试剂盒和磁珠法核酸提取仪（Thermo Fisher，美国）操作说明进行基因组DNA高通量提取。采用Nanodrop和琼脂糖凝胶电泳方法检测其浓度和纯度，置于-80 ℃保存备用。

1.2.3 KASP引物设计在前期研究中，通过QTL定位和GWAS分析得到了72个亚麻酸和亚油酸相关SNP位点^［

28-29］。获取相关SNP位点前后100 bp的序列，进行KASP引物的设计^{［参考文献 30

百度学术}30］。58个SNP位点均成功设计出引物，其中亚油酸相关的34个，亚麻酸相关的24个（表2）。每套引物包括3条引物：两条竞争性引物和一条通用引物，两条竞争性引物3′末端碱基为SNP位点变异碱基，5′端分别加上FAM（5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′）和HEX（5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′）荧光序列标签。将引物干粉稀释至100 μmol/μL，按照12（FAM引物）∶12（HEX引物）∶30（通用引物）∶46（ddH₂O）比例制备引物混合物。

表2 亚麻酸和亚油酸相关位点KASP引物序列

Table 2 KASP primer sequence of linoleic acid and linolenic acid related sites

引物名称 Primer name	FAM 引物（5′-3′） FAM primer （5′-3′）	HEX 引物（5′-3′） HEX primer （5′-3′）	通用引物（5′-3′） Common primer （5′-3′）	FAM等位位点 FAM allele	HEX等位位点 HEX allele	方向 Direction	备注 Remarks
g1_22713315	CTTGTTTACTTTTTTGG	CTTGTTTACTTTTTTGC	TGAATTTAGTGGATGCT	G	C	F	亚麻酸相关位点KASP 引物
g2_5264478	AGCTAGTAGTGGTGGATGT	AGCTAGTAGTGGTGGATGC	GAAGGCCAGAGAGAGTCGTCGG	T	C	F
g2_5787845	GTATGGAGGGTTTTCTGGC	GTATGGAGGGTTTTCTGGA	GCCACCATTCCCCATCGCT	C	A	F
g3_12036686	AAATTACCATGCTTCAGGTTTGTCAATTA	AAATTACCATGCTTCAGGTTTGTCAATTG	TGCAACAGAATGGATAAGATGC	A	G	F
g3_12036697	AACCACAACCCTACTACAAA	AACCACAACCCTACTACAAG	TAGGATACTGTGTTGGAGCTTGAATTTCAG	T	C	R
g3_12037614	GTCCTATTCGACTATATCAGGC	TCCTATTCGACTATATCAGGT	TCCAAGGCCCGAGTCATGCA	C	T	F
g3_807938	CTTCTTCTTCCTCATTGTGATCC	CTTCTTCTTCCTCATTGTGATCA	TCATGGTAATCACGATTATAATGACGCGATT	C	A	F
g3_807940	CTTCTTCTTCCTCATTGTGATCCTC	CTTCTTCTTCCTCATTGTGATCCTT	GTAATCACGATTATAATGACGCGATTAAGGGT	C	T	F
g6_6229142	AATGTAGATTTAGTTCCTAAAATTG	AATGTAGATTTAGTTCCTAAAATTT	GATCCTATAAGTTTATTTAAGCCTAACGTC	G	T	F
g9_17724430	AACCTAGTGAAGTTTCTAC	AACCTAGTGAAGTTTCTAT	TGTTACAGAATCGATTTGGGACATC	C	T	F
g9_18455369	AAAAGATGTAGTTGCACAATT	AAAAGATGTAGTTGCACAATC	CACACACAATTTATACTATTCAT	A	G	R
g9_18627795	CGATAATACATTTATTCC	CGATAATACATTTATTCT	TCATCTATCCTGAGATATTGTGA	C	T	F
g9_18910454	ACTGATGCTAAACTACATGATCAAAA	ACTGATGCTAAACTACATGATCAAAG	AGTGTTGAGTACTGTTCTGGT	A	G	F
g9_18953067	TCTTGAATTTTGAGTTTACTTC	TCTTGAATTTTGAGTTTACTTA	CTATATATATAACGGGGAATCTA	C	A	F
g9_18954449	CTTTAATGTTAAAAATTATATTC	CTTTAATGTTAAAAATTATATTA	TAAATCATAGGCGTACTAT	C	A	F
g9_18956680	GTTTTAAGTTTGCCAATAGAAGATT	GTTTTAAGTTTGCCAATAGAAGATC	GACATGGTTGTTCGAAAGGTAATG	A	G	R
g9_18961021	CTTTCTTTCTCAAATCCTACAGCACAA	CTTTCTTTCTCAAATCCTACAGCACAC	GAAATGGTGTTGATCAAACGAC	T	G	R
g9_19101453	TAAGGCCTAAATTCATAATCAAG	TAAGGCCTAAATTCATAATCAAA	TTGTGTTTAATCAATCTGATGTG	G	A	F
g10_19294584	AAGTACTGGAAAGTTTTTC	GGAAGTACTGGAAAGTTTTTA	TTGATGACAGGATCTGTGCTGGTTTGAATAT	C	A	F
g10_19295213	TTGATATGGATTTAAGGACC	TTGATATGGATTTAAGGACT	CTGGTATTCAGATTCGGCTCATT	G	A	R
g10_19298475	TGATTATAGTGGTGTCATATG	TGATTATAGTGGTGTCATATA	GAGCTAAATGGTACAGATGTCATGGA	G	A	F
g10_19298563	ACATTAAAAGTCCAA	GACATTAAAAGTCCAG	TGACATCTGTACCATTTAGCTC	T	C	R
g10_19298605	TTGTTCTACTATCCTGCAAC	TTGTTCTACTATCCTGCAAT	GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATTC	C	T	F
g10_19305239	ATTTTCTCTAAGGTCTCAAAGTT	ATTTTCTCTAAGGTCTCAAAGTC	ACTAGAGTCGATTTTCTCTAAGGTCTCAAAGT	A	G	R
g2-7680441	CTGAGCGACCTCCAGGGGTTCTTCACC	CTGAGCGACCTCCAGGGGTTCTTCACT	GCGAAGAAGCAGCTCGATTTCGAC	G	A	R	亚油酸相关位点KASP引物
g6_14807619	ATAATTAAACTCTGAATGTGCAGC	ATAATTAAACTCTGAATGTGCAGT	GGAAGAGAGAGAAATAAGATAAGTAGG	G	A	R	亚油酸相关位点KASP引物
g6_14817525	CTATCGGTACTAAAATCAGTAAC	CTATCGGTACTAAAATCAGTAAT	TAGTGGTGGYTGGGACTAGGTAGCTATG	C	T	F
g6_14817586	CATGGTTTCGATAGTTCTATGGTTCG	CATGGTTTCGATAGTTCTATGGTTCA	ATCATAGCTACCTAGTCCCA	C	T	R
g6_14817602	TCGCTACTCACATGGTTTCG	GTCGCTACTCACATGGTTTCT	TCAGTAACATCATAGCTACCTAGTCCCAAC	C	A	R
g6_14817782	TCCACTATATATATGGTTAGGAA	TCCACTATATATATGGTTAGGAT	TCGCATACACACATCAAGCTAAGTCTAAG	T	A	R
g6_14817808	CTTCCTAACCATATATATAGTGGATCAC	CTTCCTAACCATATATATAGTGGATCAT	GATAGTCCTTGTGGTGTTCTTGCAGT	C	T	F
g6_14817812	AGCTCATGATTGATTGTGCAGTGG	AGCTCATGATTGATTGTGCAGTGT	CAACACATATCGCATACACACATC	C	A	R
g6-19208888	ACGGGTTACTGTTGTTCT	GCTAAAGGGAGTTCATAAGA	TCTTATGAACTCCCTTTAGC	C	T	F
g6_25701813	TCATAATATCATTTATTAAT	TCATAATATCATTTATTAAC	CAATTGCACATCATATCACTAACT	T	C	F
g9_22580423	ATGTACATTTGTAATTTTTTT	ATGTACATTTGTAATTTTTTA	CCGGATGTTTAATTTGTTTTCATTCCC	T	A	F
g9_22867151	CTTCATCTATTTCCTTAG	CTTCATCTATTTCCTTAA	CGTCTTGATTGTTGCTTGCGTCTAG	C	T	R
g9_22870988	AAGTGGAATGCATATATAGGTGGA	AAGTGGAATGCATATATAGGTGGT	ATTCGTCCCATCATCAGACC	A	T	F
g9_18053455	AGGGATTCAGAGTCGTCCTGGGT	AGGGATTCAGAGTCGTCCTGGGA	CTTACTATCCAAGAAGCAAGCTG	T	A	F
g9_18336172	ATCATACATCAAAAATTCGGG	ATCATACATCAAAAATTCGGA	CATGCGATATAACATTCATTGG	G	A	F
g9-14900088	AGTGAAAGGACTGGAATAC	AGTGAAAGGACTGGAATAA	AGTTGAGGGTAGTTGGTG	C	A	F
g10_19305845	AATTCCTTTGTGAAAA	AATTCCTTTGTGAAAC	CGTACCGCGCCTTATGCACATTCCACATCCTCCAAAATGC	A	C	F
g10_20397204	TTTACTACTATTACATAACAATGATTAA	TTTACTACTATTACATAACAATGATTAT	CAATGGAGTTTTTGACAGTTGCAGAGGC	A	T	F
g11_15965129	GGCTTTTCAGTCGTTCTTTTTC	GCTTTTCAGTCGTTCTTTTTG	GGGACTATGTAATGTTTATGGGAG	C	G	F
g11_18501275	ACGGCCTCATTTGAGTTACTAGGTA	TCATTTGAGTTACTAGGTG	TGGTATTGGAATTGAGAGTTTGG	A	G	F
g11_18642313	ACAACCATATCCCCACA	ACAACCATATCCCCACT	ATGCACACTAGTGAGCCGCTCGCAG	T	A	R
g12_12041745	CAAATACAAAAATAGAAATTTCA	CAAATACAAAAATAGAAATTTCT	CTGATTCATCAAGCTATAAAAAATAAGA	A	T	F
g13_23649585	AGCAACTCTCTCAATTAGAAT	AGCAACTCTCTCAATTAGAAC	CACGTGGAGAAGAAAGCTC	T	C	F
g13_23667211	GTCCCATCATTCCTCTGTTTTT	GTCCCATCATTCCTCTGTTTTC	TAAGGCTCGTAGAAGTCAACTC	A	G	R
g13_25323287	CATTATCAAAACCATCCCTAT	CATTATCAAAACCATCCCTAC	GCCAGAGTCAATGTTTATCTCAGTA	A	G	R
g13_25336617	GTATAGTCCATCTCCTCTTA	GTATAGTCCATCTCCTCTTG	GGAAGTATGCCAAGGATTAG	A	G	F
g13_25343930	GTGTTTATGGTTCTGGACTTT	GTGTTTATGGTTCTGGACTTA	GCACATTTATCATTCATTGCAATAC	A	T	R
g13_25345695	AATAGTCCAAACACTAGCTTAT	AATAGTCCAAACACTAGCTTAG	GATTTAGTATCCATCCTAGG	T	G	F
g13_25345705	CACTAGCTTATCATAACTACA	CACTAGCTTATCATAACTACG	TGATTTAGTATCCATCCTAGGT	A	G	F
g13_29116425	ATCCTGTCCCCTTTCTTTATT	ATCCTGTCCCCTTTCTTTATG	CCATATCGTGGTGTTATCGTG	T	G	F
g15_2018584	AACAAAAAAATCTAAAATATTAC	AACAAAAAAATCTAAAATATTAT	TAGGTTGTGACGCAGAAATTATA	G	A	R
g15_2018606	ATGTTTCTCTCTAGTTCGCATTATTGA	ATGTTTCTCTCTAGTTCGCATTATTGG	TGACGATATGCCTATAAGTAGTAA	T	C	R
g15_2050725	CTTCCCAACATTAGTGACC	CTTCCCAACATTAGTGACF	CGTCTTTCGTGGTACAGTTG	C	T	F
g15-22369840	CATTGTTGGGTGAAGAACCCCTGG	CATTGTTGGGTGAAGAACCCCTGA	TACCAGAAAGATCATGTGAAATTACC	G	A	F

方向F表示FAM引物或HEX引物为正向引物；方向R表示FAM引物或HEX引物为反向引物

Deriction F means FAM primers or HEX primers are forward primers； Deriction R means FAM primers or HEX primers are reverse primers

1.2.4 KASP-SNP扩增与基因分型

96孔板的KASP基本反应体系为10 μL：2 μL DNA模板（30 ng/μL），5 μL KASP master mix（LGC，KBS 1016-016），0.14 μL引物混合物，2.86 μL ddH₂O。使用LightCycler480 Instrument II（Roche，瑞士）进行PCR扩增。PCR循环分3步：94 ℃预变性15 min，循环1次；94 ℃变性20 s，61～55 ℃复性/延伸60 s（-0.6 ℃/循环），循环10次；94 ℃变性20 s，55 ℃复性/延伸60 s，循环26次^［

30］。

利用LightCycler480 software1.5.1（Roche，瑞士）进行SNP分型：纯合基因型在KASP反应过程中产生单一的荧光，即FAM（蓝色）荧光聚集在X轴或HEX（绿色）荧光聚集在Y轴；杂合基因型将产生一半的FAM荧光和一半HEX荧光即混合红色荧光。

运用EXCEL2010记录样品基因分型颜色，统计分析KASP基因分型蓝色、绿色、红色3种颜色在高低亚麻酸表型、高低亚油酸表型中的分布情况。

1.2.5 相关SNP位点高通量测序

为了验证KASP基因分型结果的准确性，对KASP基因分型筛选得到的3个亚麻酸和4个亚油酸相关SNP位点进行高通量测序。获取这些SNP位点前后300 bp，在NCBI数据库中进行了blastx对比分析，发现g6-6229142、g10-19305239、g9-18961021、g6-19208888、g9-14900088这5个位点未发现显著相似性，针对这5个位点分别设计引物（表3）。而g15_22369840和g2-7680441位点序列分别与fatty acid desaturase 3a（FAD3a）和fatty acid desaturase 3b（FAD3b）同源性最高。将FAD3a基因和FAD3b基因序列分别分成14和12个片段设计引物。每个引物5'端连接8个碱基的标签序列（表4）。将来自同一个资源材料的PCR产物混合，在Illumina平台上进行高通量测序（PE250）。将测序数据与KASP基因分型结果进行比对。

表3 用于SNP位点高通量测序的引物序列

Table 3 Primers used in high throughput sequencing of SNP sites

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence		引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence
	引物序列（5′-3′） Primer sequence			上游引物Forward primer	下游引物Reverse primer
	上游引物Forwardr primer	下游引物Reverse primer		上游引物Forward primer	下游引物Reverse primer
g6-6229142	ACACAGAATCTCTAAACGAAAGCGAG	GAGCTGAAGAGTTGAAGGAGATAGCAA	g9-14900088	AGATGTACAGTGAAAGGACTGGAATAC	CCGACAACAGTTGAGGGTAGTTGGTG
g6-19208888	CGACACACACGGGTTACTGTTGTTCT	GCTCGGTATCTTATGAACTCCCTTTAGC	g10-19305239	TCTTCACAGGGCGTGATTTGATTAGA	TGGAACAACCAAGACAGTAACAGGAAT
g9-18961021	ACACGACCTCACGATGCTGACTCTTT	ACAGATTCCAACTGGAGCAGAAGAAT

下划线部分为标签序列，下同

Underlined were tag sequences，the same as below

表4 用于FAD3a基因和FAD3b基因的分段PCR扩增的引物序列

Table 4 Primers for PCR amplification of FAD3a gene and FAD3b gene fragments

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence		备注 Remarks	引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence		备注 Remarks
引物名称 Primer name	上游引物 Upper primer	下游引物 Down primer	备注 Remarks	引物名称 Primer name	上游引物 Upper primer	下游引物 Down primer	备注 Remarks
fad3a_286	ACAGCAGAGCACGACCAAACTATGAGC	ATCCTGTAGAACAAAGACTGCCCAGAAC	用于FAD3a基因的分段PCR扩增的引物	fad3b_185	CCGAAGTAGCAGGACCAAACTATGAGC	GGAGAACATGAGCAACCCAGTAAAGAGG	用于FAD3b基因的分段PCR 扩增的引物
fad3a_474	GCCACATATCAGCTACGTCCTGAGAGA	CACTTCGAGAGGATTGAGGAATGGAGT		fad3b_445	GTGTTCTAGGCCTCTTTACTGGGTTGCT	TGGCTTCAGTCTTGTGGCTAATTCT
fad3a_714	ACTATGCAGCTTCTCAGACAGTTGGTTGT	AGAGTCAACATCTTTCTCCACATTGCCG		fad3b_723	TCCGTCTATTCAGCTGAAGAATCCA	TGAAGAGATGGGAGAGGAATGGTGAAC
fad3a_888	AGATCGCACACAAGACCCATCACCAGA	CGCATACACGAGTCAACCAAACCAGGT		fad3b_971	CCTAATCCACCAGCACTAAGTTCATGA	CCATCCTCCTAGATATTTCTGTTGAT
fad3a_1160	CAATGGAAAAGTAGGAACTAATGACA	CGAACTTAGAATTACCCGATTTCAGT		fad3b_1201	TAGGATGAGATTACGGAATATGTATCA	ATTGGCTCGAATATCCATCGGGGTAAGA
fad3a_1324	AGCAGGAATCGGAATATGTATCAACAGA	CAACCACAAAATGCATGACAGTAGTGT		fad3b_1441	GAGTTAGCATCTAGAATGGGTCCA	GAACAGGCGACGCGGAAAACGACACCT
fad3a_1574	CTGGCATAGTATCTAGTGGAATTATTGGA	CCGTGAGAACCGTTGACCTGTATATTATCA		fad3b_1694	CGGATTGCGTCACTAGTTTAATGTACA	AGGCTAACTTGAGGACCGGAGCGAAG
fad3a_1796	CAAGGAGCGAACTGGACACATATGAC	GAATCTGATGGTCGAGAATTAGGCGGT		fad3b_1987	AATCCGTCTTACTCCTCTGCTACTCATCG	GTCGTAGATTTACCGCTTCCACAAGGT
fad3a_1982	CATACCAACTCCAAACCGCACCAAA	GATAGACAGGACTTCTCCTCCACTGTT		fad3b_2245	CACCTTACCCTCAAATGCCACACTATCAC	AGCACCTCTCCTCAACGCAGGTCAAAG
fad3a_2157	TTCACGCAGAATCGGTATACCTCGTCA	GATGAATCCTGCTCGTACCCGTGGTGGTGA		fad3b_2513	ATAGCGACCAAGAAGTTTCTCGATCA	CCTCTATCCAAATGTGTGTACTAAGTAT
fad3a_2389	GCGAGTAATCATCTACGGCTTCCTTCC	CTCAATGACAAGACCTCCTTACCGCTT		fad3b_2743	AGCCATGCCTATACTAAGTGCTGTAC	ATCATTCCCAAGTACCCAAACAAGTG
fad3a_2652	TGGTGGTAGAAGCGGTAAGGAGGTCT	CGACTGGACGGCTAGGGTGATCATGT		fad3b_3011	TATCAGCAACAGAGAGCCGAAGAAATCA	GCTAACGAGGACAAGATAAACAGCCTGC
fad3a_2855	AGTCACTAGAAAATGTCCTGAGCAGT	CAGCGTTAAATCATGTCTTGTCTCTGA
fad3a_3167	AATGTTGCTTTCAGAGACAAGACATGA	AAGAGATCCAATATCATCAGCTAGA

2 结果与分析

2.1 脂肪酸成分数据统计分析及基因分型材料选择

在不同的种植环境和不同的年份中，每个种质资源材料的亚麻酸、亚油酸含量有所不同，其平均值、标准差和变异系数等统计分析结果详见 http：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20220727002，附表 1。在246份资源材料中，8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）材料的亚油酸含量高于亚麻酸含量，为高亚油酸低亚麻酸材料，亚油酸含量平均值分别在51.2%和61.5%，变异系数分别为12.7%和6.5%。其余的244份材料，其亚麻酸含量均比亚油酸含量高，亚麻酸平均含量在46.4%~62.8%之间，变异系数为3.6%~38.8%之间。对于亚麻酸和亚油酸含量而言，有些资源材料受环境条件影响较大，而有些资源材料受环境影响较小，后者可作为KASP验证研究的试验材料。

5种脂肪酸成分之间的相关性分析结果显示，亚麻酸与其他成分之间呈极显著负相关，尤其是亚麻酸和亚油酸之间负相关性最高；亚油酸与硬脂酸和油酸之间呈显著和极显著负相关；棕榈酸、硬脂酸和油酸之间呈极显著正相关（表5）。

表5 胡麻脂肪酸成分之间的相关性

Table 5 Correlation between fatty acid components of flax

脂肪酸 Fatty acid	棕榈酸 Palmatic acid	硬脂酸 Stearic acid	油酸 Oleic acid	亚油酸 Linoleic acid	亚麻酸 Linolenic acid
棕榈酸 Palmatic acid	1	0.539^**	0.177^**	0.097	-0.354^**
硬脂酸 Stearic acid		1	0.436^**	-0.130^*	-0.300^**
油酸 Oleic acid			1	-0.281^**	-0.330^**
亚油酸 Linoleic acid				1	-0.794^**
亚麻酸 Linolenic acid					1

^**表示P＜0.01水平上显著相关，^*表示P＜0.05水平上显著相关

^**significantly correlated at P＜0.01 level， ^* significantly correlated at P＜0.05 level

根据亚麻酸和亚油酸含量，挑选出高、低亚麻酸资源材料和高、低亚油酸资源材料，作为用于亚麻酸和亚油酸相关SNP标记的基因分型与验证的群体。8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）材料为高亚油酸低亚麻酸类型。至少在6个环境条件下亚麻酸含量高于54%的资源材料为高亚麻酸类型，共选出49份材料。至少在6个环境条件下亚油酸含量低于13.5%的为低亚油酸类型，共筛选出36份材料。在49份高亚麻酸材料和36份高亚油酸材料中10份材料为重合，即高亚麻酸、低亚油酸类型（图1）。

图1 用于SNP KASP基因分型的资源材料亚麻酸、亚油酸含量百分比

Fig.1 Percentage of linolinic acid and linoleic acid in the varieties used in SNP KASP genotyping

资源材料编号同表1

Number of accessions is identical to table 1

2.2 胡麻脂肪酸KASP基因分型及其验证

利用设计好的KASP引物，在高、低亚麻酸和高、低亚油酸群体材料中，针对58个相关SNP位点进行了基因分型检测。根据分型结果，显示2种或3种颜色的为有效引物，显示单一颜色或灰色的为无效引物。在24个亚麻酸相关SNP位点中，13个位点显示出多态性，其中3个位点（g6-6229142、g10-19305239和g9-18961021）显示的颜色（基因型）在高亚麻酸材料和低亚麻酸材料之间有明显差异，说明这些SNP位点与亚麻酸显著相关；34个亚油酸相关SNP位点的基因分型结果显示，22个显示出多态性，其中4个位点（g6-19208888、g9-14900088，以及g15-22369840和g2-7680441）显示的颜色（基因型）在高亚油酸材料和低亚油酸材料之间有明显差异，说明这些SNP位点与亚油酸显著关联。总体上，表型和推导的SNP基因型之间符合率大于等于96%。在基因分型群体中，7个显著关联位点的荧光颜色、推导的基因型详情见表6。

表6 KASP标记分型结果表

Table 6 KASP genotyping results

SNP位点 SNP Loci	表型 Phenotype	荧光颜色 Fluorescence color	推导的基因型Deduced genotype	资源材料 Accessions	表型与基因分型符合率（%） Consistency rate between phenotype and genotype
g6_6229142	高亚麻酸	红色	G/T	所有49份高亚麻酸材料	100
g6_6229142	低亚麻酸	蓝色	G/G	8、254	100
g10_19305239	高亚麻酸	红色	G/A	238、260	96
	高亚麻酸	蓝色	A/A	其余47份高亚麻酸材料	96
	低亚麻酸	绿色	G/G	8、254	100
g9_18961021	高亚麻酸	红色	G/T	260	96
		绿色	G/G	147
		蓝色	T/T	其余47份高亚麻酸材料
	低亚麻酸	绿色	G/G	8、254	100
g6_19208888	高亚油酸	红色	C/T	8、254	100
	低亚油酸	红色	C/T	184	97
		蓝色	C/C	58
		绿色	T/T	其余34份低亚麻酸材料
g9-14900088	高亚油酸	红色	C/A	8、254	100
	低亚油酸	蓝色	C/C	269	97
	低亚油酸	绿色	A/A	其余35份低亚麻酸材料	97
g15-22369840	高亚油酸	绿色	TT	8、254	100
g15-22369840	低亚油酸	蓝色	CC	所有36份低亚油酸材料	100
g2-7680441	高亚油酸	绿色	AA	8、254	100
g2-7680441	低亚油酸	蓝色	GG	所有36份低亚油酸材料	100

2.3 高通量测序分析SNP位点多样性及验证KASP分型结果

为了验证KASP基因分型结果的准确性，针对筛选得到的7个位点g6-6229142、g10-19305239、g9-18961021、g6-19208888、g9-14900088、g15-22369840和g2-7680441，对用于基因分型的77份材料进行了高通量测序，测序结果与KASP基因分型结果完全一致（图2）。

图2 亚麻酸和亚油酸相关SNP位点的高通量测序结果

Fig.2 High-throughput sequencing results of high linolenic acid and linoleic acid related SNP loci

蓝色：参考序列基因型或与参考序列相同的基因型；绿色：突变型纯合基因型；红色：杂合性基因型

blue： Reference genotype or genotype similar to reference genotype；green： Homozygous mutant genotype； red： Heterozygous genotype

胡麻脂肪酸脱氢酶FAD3a和FAD3b基因分别位于15号和2号染色体上，是一对旁系同源基因（Paralogous Gene），功能相似，均参与由亚油酸转换成亚麻酸的生物化学过程。g15-22369840 SNP位点位于FAD3a基因第5个外显子。在8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）材料中该位点的碱基由C变成T，遗传密码子由CGA变成TGA，氨基酸由精氨酸（R）变成终止密码子。g2-7680441 SNP位点位于FAD3b基因的第1个外显子。在8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）材料中该位点的碱基由G变成A，遗传密码由TGG变成TGA，氨基酸由色氨酸（W）变成终止密码子（图2）。所有的低亚油酸材料中，2个位点未发生变异。而在8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）材料中，g15-22369840和g2-7680441位点同时发生无义突变，FAD3a基因和FAD3b基因编码过程提前终止，FAD3a和FAD3b两个酶的活性大大降低，因此亚油酸的含量高，亚麻酸的含量低。

3 讨论

高通量基因特异性分子标记的开发与利用可有效提升分子标记辅助品质育种效率。随着下一代测序技术的发展，越来越多的SNP标记应用到农作物分子标记辅助选择过程中。胡麻中SNP标记用于遗传多样性分析、遗传图谱构建和QTL定位、全基因组关联分析等方面^［

31］。通过KASP基因分型技术，针对选定的品质性状相关SNP位点，进行高通量、低成本、快速简便验证，可筛选出实用型KASP标记。KASP技术在多种农作物的分子标记辅助选择育种中得到了广泛的应用^{［参考文献 32

百度学术}32］，但其在胡麻中的应用鲜有报道。

3.1 高品质胡麻种质资源为高效育种提供种质基础

胡麻品种选育以优质、高产、抗逆性强为主要目标。本研究收集国内外胡麻种质资源材料246份，通过多年多点（共8个环境）脂肪酸检测数据，筛选出2个高亚油酸、低亚麻酸类型的材料，49份高亚麻酸类型材料和36份低亚油酸类型材料。这些种质资源材料在不同的环境下表型（脂肪酸含量）稳定，形成了本研究的基因分型群体，保证了数据分析结果的可靠性。高亚麻酸、高亚油酸等专用品种的培育是胡麻品质育种的主要目标，这些种质资源材料可以作为胡麻品质育种的候选亲本进行研究。

3.2 只有少数的SNP位点得到验证

在58个亚麻酸、亚油酸相关的SNP位点中，只有7个SNP位点得到了验证，验证率仅为12%。其原因可能有2个：（1）部分SNP位点在设计KASP引物时被淘汰。有些SNP位点距离近，选择相邻SNP位点的其中1个进行引物设计；有些SNP位点周围的碱基序列不适合设计KASP引物。（2）在前期工作中使用的群体比较小（F₂群体100个个体^［

28］，GWAS分析136份材料^{［参考文献 30

百度学术}30］）、参考基因组组装质量不高（scaffold水平），表型数据也可能存在一定的误差，因此前期获得的SNP位点的假阳性较高。

3.3 SNP位点区域的遗传背景需要进一步的深入研究

本研究通过KASP分型技术验证了7个与胡麻亚麻酸和亚油酸相关的SNP标记，并将其转化为KASP标记。通过高通量测序发现，g15_22369840和g2_7680441分别位于脂肪酸脱氢酶基因FAD3a和FAD3b的外显子当中。在8号（CH-89）和254号（CI637PI91037）2个高亚油酸材料中，该2个位点同时发生了无义突变，影响了酶的活性，因此将其作为功能性分子标记利用。而其他5个SNP位点区域的遗传背景尚不清楚，SNP位点与目标基因之间的距离、与目标性状的关系需要进一步的深入研究，才能成为可用于胡麻分子标记辅助选择过程中的真正的实用性分子标记。

本研究利用筛选构建的自然群体中58个与亚麻酸、亚油酸相关的SNP位，运用KASP基因分型技术成功验证了7个SNP标记，并通过高通量测序验证了KASP基因分型体系有效性及准确性，可用于胡麻分子标记辅助选择过程中。如何将这些SNP标记用于胡麻品质育种过程中，需要在育种实践中进一步深入研究。除此之外，只有7个SNP标记还远远不够，需要挖掘更多的实用性标记。

参考文献

胡晓军.亚麻产业技术发展现状与对策.山西农业科学，2010，38（7）：8-10 [百度学术]

Hu X J. Current situation and measures of technology development in flax industry. Journal of Shanxi Agricultural Sciences， 2010， 38（7）： 8-10 [百度学术]

邓乾春，禹晓，黄庆德，黄凤洪，钮琰星，郭萍梅，刘昌盛.亚麻籽油的营养特性研究进展.天然产物研究与开发，2010，22（4）：715-721 [百度学术]

Deng Q C， Yu X， Huang Q D， Huang F H， Niu Y X， Guo P M， Liu C S. Research prograss on nutritional characteristics of linseed oil. Natural Product Research and Development， 2010， 22（4）： 715-721 [百度学术]

中国居民膳食指南（2016）. 国家卫生计生委疾控局发布. 中国妇幼健康研究， 2016，27（5）： 670 [百度学术]

“Dietary guideline for Chinese residents （2016）”. Released by Disease Control Bureau of the National Health and Family Planning Commission. Chinese Journal of Woman and Child Health Research， 2016， 27（5）： 670 [百度学术]

柏薇薇.α-亚麻酸的功效.食品界，2017（10）： 99 [百度学术]

Bai W W. Fuction of α-linolenic acid. Food Industry， 2017（10）： 99 [百度学术]

廖振林，李倩滢，陈俊杰，杜李宇，王洁，方祥.亚麻籽油组分的功能活性研究进展. 现代食品科技，2021， 37（11）： 379 -389 [百度学术]

Liao Z L， Li Q Y， Chen J J， Du L Y， Wang J， Fang X. Research progress on the functional activity of flaxseed oil components. Modern Food Science and Technology， 2021， 37（11）： 379-389 [百度学术]

邓艳，魏东霞，朱兴全.单核苷酸多态性及其检测方法.中国畜牧兽医， 2005（5）：32-36 [百度学术]

Deng Y， Wei D X， Zhu X Q. Single nucleotide polymorphism and its detection measures. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine， 2005（5）： 32-36 [百度学术]

谭建萍，李映萍，余江勇，杨雪，金生英，谭本智. 分子标记在作物遗传育种中的应用. 绿色科技， 2015（10）： 65-67 [百度学术]

Tan J P， Li Y P， Yu J Y， Yang X， Jin S Y， Tan B Z. Applications of molecular markers in crop genetics and breeding. Journal of Green Science and Technology， 2015（10）： 65-67 [百度学术]

Semagn K， Babu R， Hearne S， Olsen M. Single nucleotide polymorphism genotyping using kompetitive allele specific PCR （KASP）： Overview of the technology and its application in crop improvement. Molecular Breeding， 2014， 33（1）：1-14 [百度学术]

Rasheed A， Hao Y F， Xia X C， Khan A， Xu Y B， Rajeev K， Varshney， He Z H. Crop breeding chips and genotyping platforms： Progress， challenges and perspectives. Molecular Plant， 2017， 10（8）： 1047-1064 [百度学术]

陈思平. 基于KASP的水稻基因组SNP标记开发及其育种应用.广州：华南农业大学，2017 [百度学术]

Chen S P. Development of rice SNP marker based KASP technology and its application in breeding. Guangzhou： South China Agricultural University， 2017 [百度学术]

Cheon K S， Jeong Y M， Oh H， Oh J， Kang D Y， Kim N， Lee E， Baek J， Kim S L， Choi I， Yoon I S， Kim K H， Won Y J， Cho Y I， Han J H， Ji H. Development of 454 new kompetitive allele-specific PCR （KASP） markers for temperate japonica rice varieties. Plants （Basel）， 2020，9（11）：1531 [百度学术]

Wilkinson P A， Winfield M O， Barker G L， Allen A M， Burridge A， Coghill J A， Edwards K J. Cereals DB 2.0：An integrated resource for plant breeders and scientists. BMC Bioinformatics， 2012， 13（1）：219 [百度学术]

Wilkinson P A， Allen A M， Tyrrell S， Wingen L U， Bian X D， Winfield M O， Buriidge A， Shaw D S， Zaucha J， Griffiths S， Davey R P， Edwards K J， Baeker G L. CerealsDB—new tools for the analysis of the wheat genome： Update 2020. Database （Oxford）， 2020， DOI：10.1093/database/baaa060 [百度学术]

Rasheed A， Wen W， Gao F M， Zhai S N， Jin H， Liu J D， Guo Q， Zhang Y J， Dreidigacher S， Xia X C， He Z H. Development and validation of KASP assays for genes underpinning key economic traits in bread wheat. Theoretical & Applied Genetics， 2016， 129（10）：1843-1860 [百度学术]

张维军，赵俊杰，何进尚，郝晨阳，王小亮，亢玲，张富国，张学勇，陈东升. 宁夏小麦种质资源粒重基因KASP标记检测及验证，植物遗传资源学报，2022，23（2）： 493-504 [百度学术]

Zhang W J， Zhao J J， He J S， Hao C Y， Wang X L， Kang L， Zhang F G， Zhang X Y， Chen D S. Detection and validation of grain weight related genes using KASP assays in Ningxia wheat germplasm. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23（2）： 493-504 [百度学术]

王蕊，施龙建，田红丽，易红梅，杨扬，葛建镕，范亚明，任洁，王璐，陆大雷，赵久然，王凤格.玉米杂交种纯度鉴定SNP核心引物的确定及高通量检测方案的建立.作物学报，2021，47（4）：770-779 [百度学术]

Wang R， Shi L J， Tian H L， Yi H M， Yang Y， Ge J R， Fan Y M， Ren J， Wang L， Lu D L， Zhao J R， Wang F G. Identification of SNP core primers and establishment of high throughput detection scheme for purity identification in maize hybrids. Acta Agronomica Sinica， 2021， 47（4）： 770-779 [百度学术]

陆海燕，周玲，林峰，王蕊，王凤格，赵涵. 基于高通量测序开发玉米高效KASP分子标记. 作物学报， 2019， 45（6）：872-878 [百度学术]

Lu H Y， Zhou L， Lin F， Wang R， Wang F G， Zhao H. Development of efficient KASP molecular markers based on high throughput sequencing in maize. Acta Agronomica Sinica， 2019， 45（6）： 872-878 [百度学术]

Zhao Y， Chen W， Cui Y， Sang X， Lu J， Jing H， Wang W， Zhao P， Wang H. Detection of candidate genes and development of KASP markers for verticillium wilt resistance by combining genome-wide association study， QTL-seq and transcriptome sequencing in cotton. Theoretical and Applied Genetics， 2021， 134（4）：1063-1081 [百度学术]

王鹏，田哲娟，康忱，李亚栋，王洪乐，杨超沙，邙光伟，康亮，范庆杰，吴志明.番茄5个抗病基因KASP分型技术体系的建立与应用.园艺学报， 2021，48（11）：2211-2226 [百度学术]

Wang P， Tian Z J， Kang C， Li Y D， Wang H L， Yang C S， Mang G W， Kang L， Fan Q J， Wu Z M. Establishment and application of a tomato KASP genotyping system based on five disease resistance genes. Acta Horticulturae Sinica， 2021，48（11）： 2211-2226 [百度学术]

练云，李海朝，李金英，周扬，王仕伟，张辉，雷晨芳，吴永康，张景鹏，卢为国. 利用KASP标记筛选含rhg1和Rhg4位点的大豆抗病资源.植物遗传资源学报，2021，22（2）：399-406 [百度学术]

Lian Y， Li H C， Li J Y， Zhou Y， Wang S W， Zhang H， Lei C F， Wu Y K， Zhang J P， Lu W G. Marker-assisted screening of soybean cyst nematode germplasms harboring resistance loci rhg1 and Rhg4. Journal of Plant Genetic Resources， 2021， 22（2）： 399-406 [百度学术]

孟君仁，曾文芳，邓丽，潘磊，陆振华，崔国超，王志强，牛良. 桃若干重要性状的KASP分子标记开发与应用. 中国农业科学， 2021， 54（15）：3295-3307 [百度学术]

Meng J R， Zeng W F， Deng L， Pan L， Lu Z H， Cui G C， Wang Z Q， Niu L. Development and application of KASP molecular markers of some important traits for peach. Scientia Agricultura Sinica， 2021， 54（15）： 3295-3307 [百度学术]

Kaiser N R， Jansky S， Coombs J J， Collin P， Alsagkany M， Douches D S. Assessing the contribution of sli to self-compatibility in North American diploid potato germplasm using KASP markers. American Journal of Potato Research， 2021， 98： 104-113 [百度学术]

Winfield M， Burridge A， Ordidge M， Harper H， Wilkinfield P， Thorogood D， Copas L. Development of a minimal KASP marker panel for distinguishing genotypes in apple collections. PLoS ONE， 2020， 15（11）： e0242940 [百度学术]

Holdsworth W L， Mazourek M. Development of user-friendly markers for the pvr1 and Bs3 disease resistance genes in pepper. Molecular Breeding， 2015， DOI： https：//doi.org/10.1007/s11032-015-0260-2 [百度学术]

Gascuel Q， Bordat A， Sallet E， Pouilly N， Carrere S， Roux F， Vincourt P， Godiard L. Effector polymorphisms of the sunflower downy mildew pathogen Plasmopara halstedii and their use to identify pathotypes from field isolates. PLoS ONE， 2016， 11（2）： e048513 [百度学术]

孙逸敏. 利用SPSS软件分析变量间的相关性. 新疆教育学院学报，2007，23（2）：120-123 [百度学术]

Sun Y M. Using SPSS software to analyze the correlation between variables. Journal of Xinjiang Education Institute， 2007， 23（2）： 120-123 [百度学术]

杜家菊，陈志伟. 使用SPSS线性回归实现通经分析的方法. 生物学通报，2010， 45（2）： 4-6 [百度学术]

Du J J， Chen Z W. A method to accomplish pass analysis by using SPSS linear regression. Bulletin of Biology， 2010， 45（2）： 4-6 [百度学术]

高凤云，斯钦巴特尔，张辉，伊六喜，侯建华，周宇.亚麻主要农艺与品质相关性状QTL定位. 西北植物学报，2018， 38（3）：465-477 [百度学术]

Gao F Y， SIQIN B T， Zhang H， Yi L X， Hou J H， Zhou Y. QTL Locations of main agronomic and quality traits in flax. Acta Botanica Boreali-Occidentalia Sinica， 2018， 38（3）：465-477 [百度学术]

伊六喜，胡麻产量和品质相关性状的全基因组关联分析.呼和浩特：内蒙古农业大学，2018 [百度学术]

Yi L X. Genome-wide association analysis of yield and quality related traits in flax. Hohhot： Inner Mongolia Agricultural University， 2018 [百度学术]

Uzma M， Essam D， Shoaib U R， Zhang X Y. Kompetitive allele specific PCR （KASP）： A singleplex genotyping platform [百度学术]

and its application. Journal of Agricultural Science， 2019，11（1）： 11-20 [百度学术]

姜慧，潘根，常丽，黄思齐，唐慧娟，李德芳，赵立宁，李建军，伍叶娜，陈安国.亚麻分子标记辅助育种研究进展. 植物遗传资源学报，2021，22（4）：910-920 [百度学术]

Jiang H，Pan G，Chang L，Huang S Q，Tang H J，Li D F，Zhao L N，Li J J，Wu Y N，Chen A G. Advances in molecular marker assisted breeding of flax. Journal of Plant Genetic Resources， 2021，22（4）：910-920 [百度学术]

杨青青，唐家琪，张昌泉，高继平，刘巧泉.KASP 标记技术在主要农作物中的应用及展望.生物技术通报，2022， 38（4）： 58-71 [百度学术]

YANG Q Q， TANG J Q， ZHANG C Q， GAO J P， LIU Q Q. Application and prospect of KASP marker technology in main crops. Biotechnology Bulletin， 2022， 38（4）： 58-71 [百度学术]

请使用 Firefox、Chrome、IE10、IE11、360极速模式、搜狗极速模式、QQ极速模式等浏览器，其他浏览器不建议使用!