摘要
近年来，全球低温极端气候频发，对水稻生产带来严重的影响。低温严重限制了水稻种植区域的扩大。因此，鉴定克隆水稻低温发育相关基因，阐明其分子机理，可为水稻低温分子育种奠定理论基础。本研究从水稻日本晴化学诱变突变体库筛选鉴定到1个低温叶片白化的突变体lta1（Low temperature albinism1）。相比野生型，在20 ℃生长条件下，突变体lta1叶片白化，叶绿素含量显著降低，叶绿体结构发育异常；在30 ℃生长条件下，突变体lta1与野生型生长无显著差异。通过图位克隆将突变基因lta1定位在第3号染色体短臂InDel标记LTA1-3与LTA1-7之间，物理距离为132 kb。基于水稻基因表达数据库，在132 kb区间内有17个候选基因，其中有6个候选基因翻译的蛋白可能定位于叶绿体。实时荧光定量PCR结果表明多数叶绿体编码基因的表达在突变体中受到显著抑制，而多数叶绿素合成相关基因的表达未发生显著变化。本研究结果为进一步克隆LTA1基因与揭示水稻低温下叶绿体发育的机理提供可能。
当前新冠病毒肆虐全球，局部战争时有发生，加剧了全球粮食短缺。水稻是我国最重要的粮食作物之一，保持水稻稳产高产是保障我国粮食安全的重要举
本研究以从粳稻日本晴N-甲基-N-亚硝基脲（MNU，N-Nitroso-N-methylurea）诱变突变体库中获得的低温白化突变体Low temperature albinism 1（lta1）为材料，通过表型观察、叶绿体透射电镜观察、基因定位、基因表达分析等方面，初步完成突变体突变基因精细定位与候选基因测序分析，为进一步克隆LTA1提供了基础。
突变体lta1筛选自粳稻日本晴N-甲基-N-亚硝基脲诱变突变体库，经多代自交，低温白化表型已能够稳定遗传。以突变体lta1为母本，与籼稻南京11杂交获得F1，F1自交获得的F2群体用于基因定位。粳稻日本晴与籼稻南京11种子为江苏太湖地区农业科学研究所作物育种与栽培研究室自行保存。
分别取在室内20 ℃与30 ℃条件下连续生长2周的野生型（日本晴）和突变体lta1叶片0.2 mg，叶绿素含量测定方法参考许子怡
取在室内20 ℃条件下连续生长2周的野生型和突变体叶片，切成1~2 mm小块，置于含有2.5%戊二醛固定液的2.0 mL圆底离心管内，真空泵抽气1~2 h。固定好的样品委托青岛科创质量检测有限公司进行后续样品处理与利用JEM-1200Ex型透射电子显微镜观察拍照。
剪取少量水稻叶片，置于200 μL离心管中，加入30 μL M5 Hiper光速mix直接扩增最佳伴侣（#MF859，北京聚合美生物科技有限公司），96 ℃加热10 min，700 g离心2 min，取上清放于-20 ℃备用。
从lta1/南京11杂交衍生的F2群体中挑选与lta1低温白化表型一致的单株，提取DNA，利用有多态性的覆盖水稻全基因组的SSR标记与InDel标记进行连锁分析。然后，再进一步扩大极端个体数量与加密分子标记进行精细定位。基因定位所用引物见
引物名称 Primer name | 正向引物 Forward primer sequence （5′-3′） | 反向引物 Reverse primer sequence （5′-3′） |
|---|---|---|
| RM7 | TTCGCCATGAAGTCTCTCG | CCTCCCATCATTTCGTTGTT |
| RM5748 | CAGTTGGCAATTGTCACGAG | TCGAACATATCCAAGCCTCC |
| RM14810 | GGAAAGGGAAACCACCAGATAAGC | AACAAGCACACACCCACCTCTCC |
| RM14822 | GTCCTTCTTCGTCTACGCCATGC | CTTCCGCTCCTTGTTCTTCTTGC |
| YSL9 | AATTGCACTATCTTTGTCTA | ACAAGTATTACCTCCATCAT |
| YSL12 | TCACCTGCTAAATTCTCATC | GAGTTAGAAGCTAGAAACCC |
| YSL15 | TCAGATGTTGAAGAAGAAAGGGGTAG | AAGTCCAAGCTGGGGAGGGT |
| LTA1-3 | GCAGAACAGATGGCATAGAGC | TACCCTATGCCAAGGCCAAA |
| LTA1-7 | AGTGATCCATGCCATGTCCT | CCGTGTGACAGGATCTAACCT |
根据Gramene（https：//www.gramene.org/）和RiceXPro（https：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/）数据库获得的基因组序列信息，利用Primer Premier 5软件设计引物扩增野生型和突变体lta1候选基因，委托安徽通用生物股份有限公司进行测序拼接。扩增引物详见http：//doiorg./10.13430/j.cnki.jpgr.20220802002，
取室内20 ℃连续生长2周的野生型与突变体lta1叶片，液氮磨碎。利用康为世纪植物RNA提取试剂盒（#CW0559）提取RNA，反转录成cDNA，放入-20 ℃备用。采用TaKaRa TB Gree
根据Gramene和RiceXPro数据库获得的候选基因产物的氨基酸序列信息，利用亚细胞定位分析软件Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行蛋白定位分析。
lta1（Low temperature albinism 1）是从粳稻日本晴MNU诱变突变体库中筛选鉴定到1个低温白化突变体。在低温20 ℃条件下苗期突变体lta1叶片白化，叶绿素a和叶绿素b含量约为野生型的10%，叶绿素含量显著降低，多数白化苗会枯萎死亡（
图1 苗期突变体lta1的表型鉴定
Fig.1 Phenotype identification of the lta1 mutant at seedling stage
A：在20 ℃生长条件下苗期突变体和野生型的表型；B：在30 ℃生长条件下苗期突变体和野生型的表型；C：在20 ℃生长条件下突变体和野生型的叶绿素含量；D：在30 ℃生长条件下突变体和野生型的叶绿素含量；**代表在P<0.01水平上达到显著差异，下同
A： Phenotypes of the seedlings of the mutant and wild type at 20 ℃； B： Phenotypes of the seedlings of the mutant and wild type at 30 ℃； C： Chlorophyll content of the mutant and wild-type at 20 ℃； D： Chlorophyll contents of the mutant and wild-type at 30 ℃； **Represents a significant difference at P<0.01 level，the same as below
为了探究低温下野生型和突变体叶绿体结构的差异，通过透射电子显微镜观察了低温下野生型和突变体叶片叶绿体形态。如
图2 低温下野生型和突变体叶绿体形态观察
Fig.2 Observation of chloroplast morphology of wild type and the mutant under low temperature condition
A~B：在低温下野生型叶片的叶绿体透射电镜观察；C~D：在低温下突变体叶片的叶绿体透射电镜观察；黑色箭头指示突变体发育异常的叶绿体
A-B： Transmission electron microscope observation of chloroplasts of wild-type leaves under low temperature condition； C-D： Chloroplast observation of the mutant leaves under low temperature condition by transmission electron microscope； Black arrows indicate abnormal developed chloroplasts of the mutant
为了克隆控制突变体lta1低温白化的基因，利用突变体lta1与籼稻南京11杂交再自交形成的F2遗传定位群体进行基因连锁分析。取10个低温白化极端个体进行全基因组分子标记分析，将目标基因初步定位在第3染色体短臂SSR标记RM7与RM5748之间，物理距离为2498 kb（
图3 LTA1的图位克隆
Fig.3 Map-based cloning of LTA1
n表示极端个体数量；黑色箭头代表基因
N represents the number of extreme individuals； The black arrows represent genes
基于水稻基因表达数据库（https：//ricexpro.dna.affrc.go.jp/），精细定位132 kb区间内有17个表达基因（
基因名称 Gene name | 功能 Function | 亚细胞定位 Subcellular localization |
|---|---|---|
| LOC_Os03g19530 | DEAD/DEAH DNA解旋酶 | 细胞核 |
| LOC_Os03g19540 | 表达蛋白 | 叶绿体 |
| LOC_Os03g19550 | 表达蛋白 | 细胞膜 |
| LOC_Os03g19560 | 三角状四肽重复蛋白 | 叶绿体 |
| LOC_Os03g19570 | 表达蛋白 | 细胞核 |
| LOC_Os03g19580 | 表达蛋白 | 细胞 |
| LOC_Os03g19590 | 光敏色素B | 细胞核 |
| LOC_Os03g19600 | 反转录转座子蛋白 | 细胞核 |
| LOC_Os03g19610 | 果胶甲基酯酶 | 细胞壁 |
| LOC_Os03g19650 | 三角状五肽重复蛋白 | 叶绿体 |
| LOC_Os03g19670 | 类GDSL脂肪酶/酰基水解酶 | 细胞外 |
| LOC_Os03g19680 | 烯醇辅酶A水合酶/异构酶家族蛋白 | 叶绿体/过氧化物酶体 |
| LOC_Os03g19690 | 表达蛋白 | 叶绿体 |
| LOC_Os03g19700 | DUF247未知功能蛋白 | 细胞膜 |
| LOC_Os03g19720 | 超敏反应相关的钙结合蛋白 | 细胞膜 |
| LOC_Os03g19730 | 表达蛋白 | 细胞核 |
| LOC_Os03g19760 | 水解酶家族蛋白 | 叶绿体 |
为了探究低温下在野生型和突变体中叶绿体编码基因与叶绿素合成相关基因的表达水平差异，取低温下生长10 d的野生型和突变体叶片进行RNA提取与实时荧光定量PCR。如
图4 叶绿体编码基因表达水平分析
Fig.4 Expression level analysis of chloroplast coding genes
*代表在P<0.05水平差异显著
* indicate a significant difference at the level of P<0.05
图5 叶绿素合成相关基因表达水平分析
Fig.5 Expression level analysis of genes related to chlorophyll biosynthesis
水稻在遇到低温胁迫时，叶绿素合成、叶绿体发育等过程会受到显著抑制。目前，一些与水稻低温叶绿素合成与叶绿体发育相关基因被鉴定克隆，初步阐明了低温下水稻叶绿素合成和叶绿体发育的分子调控网
随着现代生物技术的飞速发展，在水稻、小麦、油菜等作物中都鉴定克隆了叶色相关基因，为研究植物光合作用提供了材
在本研究中，通过突变体与籼稻南京11杂交构建基因定位群体，利用分子标记进行基因定位，最终将目标基因定位在第3号染色体短臂132 kb。通过查阅水稻表达数据库与相关文献，在该区间内含有17个表达基因，均没有被报道参与水稻叶绿体发育的调控，说明LTA1可能是1个新的调控水稻叶绿体发育基因。在17个候选基因中，有2个候选基因编码PPR蛋白，暗示其可能是LTA1，但是基因测序显示在野生型和突变体之间无序列差异。LTA1基因突变影响叶绿体编码基因和叶绿素合成基因HEME的正常表达，导致水稻叶绿体发育和叶绿素合成发生异常。本研究进一步丰富了水稻低温下叶绿体发育的调控网络，为克隆LTA1基因奠定了基础。
参考文献
Wei S， Li X， Lu Z， Zhang H， Ye X， Zhou Y， Li J， Yan Y， Pei H， Duan F， Wang D， Chen S， Wang P， Zhang C， Shang L， Zhou Y， Yan P， Zhao M， Huang J， Bock R， Qian Q， Zhou W. A transcriptional regulator that boosts grain yields and shortens the growth duration of rice. Science， 2022， 377（6604）：eabi8455 [百度学术]
Gong Z， Xiong L， Shi H， Yang S， Herrera-Estrella L R， Xu G， Chao D Y， Li J， Wang P Y， Qin F， Li J， Ding Y， Shi Y， Wang Y， Yang Y， Guo Y， Zhu J K. Plant abiotic stress response and nutrient use efficiency. Science China-Life Sciences， 2020， 63（5）：635-674 [百度学术]
Cui S， Huang F， Wang J， Ma X， Cheng Y， Liu J. A proteomic analysis of cold stress responses in rice seedlings. Proteomics， 2005， 5（12）：3162-3172 [百度学术]
Zhao Y， Han Q， Ding C， Huang Y， Liao J， Chen T， Feng S， Zhou L， Zhang Z， Chen Y， Yuan S， Yuan M. Effect of low temperature on chlorophyll biosynthesis and chloroplast biogenesis of rice seedlings during greening. International Journal of Molecular Sciences， 2020， 21（4）：1390 [百度学术]
杨颜榕， 黄纤纤， 赵亚男， 汤佳玉， 刘喜. 水稻叶色基因克隆与分子机制研究进展.植物遗传资源学报， 2020， 21（4）：794-803 [百度学术]
Yang Y R， Huang Q Q， Zhao Y N， Tang J Y， Liu X. Advances on gene isolation and molecular mechanism of riceleaf color genes. Journal of Plant Genetic Resources， 2020， 21（4）：794-803 [百度学术]
张萍， 柳梦林， 叶胜海， 翟荣荣， 朱国富， 叶靖， 张小明. 水稻叶色突变体研究进展. 分子植物育种， 2021， 19（17）：5712-5719 [百度学术]
Zhang P， Liu M L， Ye S H， Zhai R R， Zhu G F， Ye J， Zhang X M. Research progress of rice leaf color mutants. Molecular Plant Breeding， 2021， 19（17）：5712-5719 [百度学术]
Wang X M， Kong R R， Zhang T， Gao Y Y， Xu J L， Piao Z Z， Lee G， Lin D Z， Dong Y J. A DEAD-box RNA helicase TCD33 that confers chloroplast development in rice at seedling stage under cold stress. Journal of Plant Physiology， 2020， 248：153138 [百度学术]
Liu X， Lan J， Huang Y， Cao P， Zhou C， Ren Y， He N， Liu S， Tian Y， Nguyen T， Jiang L， Wan J M. WSL5， a pentatricopeptide repeat protein， is essential for chloroplast biogenesis in rice under cold stress. Journal of Experimental Botany， 2018， 69（16）：3949-3961 [百度学术]
Jung Y J， Lee H J， Yu J， Bae S， Cho Y G， Kang K K. Transcriptomic and physiological analysis of OsCAO1 knockout lines using the CRISPR/Cas9 system in rice. Plant Cell Reports， 2021， 40（6）：1013-1024 [百度学术]
Lin D， Zhou W， Wang Y， Sun J， Pan X， Dong Y. Rice TSV2 encoding threonyl-tRNA synthetase is needed for early chloroplast development and seedling growth under cold stress. Genes，Genomes，Genetics， 2021， 11（9）：jkab196 [百度学术]
Sun J， Zheng T， Yu J， Wu T， Wang X， Chen G， Tian Y， Zhang H， Wang Y， Terzaghi W， Wang C M， Wan J M. TSV， a putative plastidic oxidoreductase， protects rice chloroplasts from cold stress during development by interacting with plastidic thioredoxin Z. New Phytologist， 2017， 215（1）：240-255 [百度学术]
Cai L， Liu Z， Cai L， Yan X， Hu Y， Hao B， Xu Z， Tian Y， Liu X， Liu L， Jiang L， Zhou S， Wan J. Nuclear encoded elongation factor EF-Tu is required for chloroplast development in rice grown under low-temperature conditions. Journal of Genetics and Genomics， 2022，49（5）：502-505 [百度学术]
Wu L， Wu J， Liu Y， Gong X， Xu J， Lin D， Dong Y J. The rice pentatricopeptide repeat gene TCD10 is needed for chloroplast development under cold stress. Rice， 2016， 9（1）：67 [百度学术]
Liu X Y， Zhang X， Cao R， Jiao G， Hu S， Shao G， Sheng Z， Xie L， Tang S， Wei X， Hu P S. CDE4 encodes a pentatricopeptide repeat protein involved in chloroplast RNA splicing and affects chloroplast development under low-temperature conditions in rice. Journal of Integrative Plant Biology， 2021， 63（10）：1724-1739 [百度学术]
许子怡， 程行， 沈奇， 赵亚男， 汤佳玉， 刘喜. 水稻黄绿叶突变体ygl3的鉴定与基因功能分析.中国农业科学， 2021， 54（15）： 3149-3157 [百度学术]
Xu Z Y， Cheng H， Shen Q， Zhao Y N， Tang J Y， Liu X. Identification and gene functional analysis of yellow green leaf mutant ygl3 in rice. Scientia Agricultura Sinica， 2021，54（15）：3149-3157 [百度学术]
张天雨， 周春雷， 刘喜， 孙爱伶， 曹鹏辉， Thanhliem NGUYEN， 田云录， 翟虎渠， 江玲. 一个水稻温敏黄化突变体的表型分析和基因定位.作物学报， 2017， 43（10）：1426-1433 [百度学术]
Zhang T Y， Zhou C L， Liu X， Sun A L， Cao P H， Thanhliem N， Tian Y L， Zhai H Q， Jiang L. Phenotypes and gene mapping of a thermo-sensitive yellow leaf mutant of rice. Acta Agronomica Sinica， 2017， 43（10）： 1426-1433 [百度学术]
Liu X， Cao P H， Huang Q Q， Yang Y R， Tao D D. Disruption of a rice chloroplast-targeted gene OsHMBPP causes a seedling-lethal albino phenotype. Rice， 2020， 13（1）：51 [百度学术]
唐辉武， 张兰， 蔡培荣， 黄潇溢， 秦银娇， 吴梓鹏， 朱嘉慧， 王丽敏. 水稻白化转绿叶色突变体研究进展. 广东农业科学， 2021， 48（8）：9-18 [百度学术]
Tang H W， Zhang L， Cai P R， Huang X Y， Qin Y J， Wu Z P， Zhu J H， Wang L M. Research progress of rice green-revertible albino mutants. Guangdong Agricultural Sciences， 2021， 48（8）：9-18 [百度学术]
Żur I， Gajecka M， Dubas E， Krzewska M， Szarejko I. Albino plant formation in androgenic cultures： An old problem and new facts. Methods in Molecular Biology， 2021， 2288：3-23 [百度学术]
刘艳霞， 林冬枝， 董彦君. 水稻温敏感叶色突变体研究进展. 中国水稻科学， 2015， 29（4）： 439-446 [百度学术]
Liu Y X， Lin D Z， Dong Y J. Research advances in thermosensitive leaf coloration mutants in rice. Chinese Journal of Rice Science， 2015， 29（4）：439-446 [百度学术]
Yu Y， Zhou Z， Pu H， Wang B， Zhang Y， Yang B， Zhao T， Xu D. OsSIG2A is required for chloroplast development in rice （Oryza sativa L.） at low temperature by regulating plastid genes expression. Functional Plant Biology， 2019，46（8）：766-776 [百度学术]
Cui X， Wang Y， Wu J， Han X， Gu X， Lu T， Zhang Z. The RNA editing factor DUA1 is crucial to chloroplast development at low temperature in rice. New Phytologist， 2019， 221（2）：834-849 [百度学术]
Lin D， Zhang L， Mei J， Chen J， Piao Z， Lee G， Dong Y. Mutation of the rice TCM12 gene encoding 2，3-bisphosphoglycerate-independent phosphoglycerate mutase affects chlorophyll synthesis， photosynthesis and chloroplast development at seedling stage at low temperatures. Plant Biology， 2019， 21（4）：585-594 [百度学术]