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黄秋葵果实质地变化的生化和转录组联合分析  PDF

  • 张国芹 ✉
  • 牟建梅 ✉
  • 陈虎根
苏州市农业科学院，江苏苏州 215106

最近更新：2023-01-12

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20220822002

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摘要

黄秋葵果实发育过程质地易木质化变硬，严重影响商品价值。为探究黄秋葵果实质地变硬的机制，选择易老化变硬的Z06和不易老化的苏优葵3号两个品种在其果实3个发育时期进行生化指标的测定及转录组测序。结果发现，品种间或不同发育时期果实质地的差异主要是由于木质素积累导致的木质化，纤维素和原果胶同时也起到积极的作用。转录组学分析表明，相同品种在不同果实发育时期的差异表达基因（DEGs，differentially expressed genes）主要在苯丙烷生物合成和次级代谢产物的生物合成途径显著富集；而相同时期两品种间的差异表达基因除了与苯丙烷生物合成途径有关，光合作用和光合作用天线蛋白途径也起重要作用。在果实成熟质地变硬阶段，苯丙氨酸酶（PAL，phenylalanineammonialyase）基因是影响木质素积累的关键基因；蔗糖合成酶3（SUS3，sucrose synthase）基因对纤维素的积累贡献最大，而β-葡萄糖苷酶（BGLU，β‍-D-glucosidase）基因的下调表达也是促进纤维积累的重要因素；半乳糖醛酸转移酶6（GAUT6，galacturonosyltransferase）基因和SUS6基因对原果胶的积累贡献较大，但大部分果胶酯酶（PME，pectinesterase）基因和聚半乳糖醛酸酶（PG，polygalacturonase）基因对原果胶的积累均呈负贡献。木质素合成相关基因PAL6、PAL5、PAL1及肉桂酰辅酶A还原酶2（CCR2，cinnamoyl-CoA reductase）基因、细胞色素P450亚酶84A1（CYP84A1，cytochrome P450）基因、CYP73A12，以及光合途径相关基因放氧增强蛋白2（PSBP2，oxygen-evolving-complex）基因和叶绿素a/b结合蛋白2（CAB1R，chlorophyll a/b binding protein）基因是影响品种质地差异的重要基因。

黄秋葵（Abelmoschus esculentus （L.） Moench）起源于非洲，在热带及亚热带地区广泛种植。据FAO（https：//www.fao.org/faostat）统计，2010年以来，黄秋葵在世界的栽培面积增长迅速，截止到2020年，世界总栽培面积提升了131.5%。因其美味的口感、丰富的营养、较高的医药价值使其深受人们喜爱［

1］。但黄秋葵的果实收获期较短，结果后5~7 d果实质地变硬，发生木质化，严重影响黄秋葵的商品价值。

植物组织的质地受细胞形态、膨压以及细胞壁结构影响［

2］，而细胞壁强度决定组织硬度。木质素、纤维素、果胶等是细胞壁的重要组分，其形态及连接决定了果肉细胞的细胞壁机械性能［3］，已有大量研究表明这些细胞壁组分含量与果实质地呈显著正相关［4-5］。木质素积累是果实木质化的主要原因［6-7］，而木质素的合成受苯丙烷代谢途径的相关酶调控。Liu等［8］发现木质素合成途径中的EjPAL2、肉桂醇脱氢酶1（EjCAD1，cinnamyl-alcohol dehydrogenase）基因、EjCAD3、4-香豆酰-CoA连接酶（4CL，4-coumaryl-CoA ligase）基因、咖啡酸-O-甲基转移酶（COMT，caffeic acid O-methyltransferase）基因等响应枇杷采后木质化过程。刘恋等［9］同样发现木质素合成相关基因的上调表达是柑橘果皮硬度、韧性及木质素含量较高的重要原因。纤维素也是影响组织机械强度的重要因素，Ren等［10］研究表明，黄秋葵果实衰老主要由于纤维素的积累导致细胞壁增厚，但也有研究表明果实质地的硬化不受纤维素含量影响［11］，因此，纤维素与黄秋葵果实质地的关系有待进一步探究。果胶对细胞壁生物力学起重要作用，其直接促进细胞壁中纤维素微纤维的交联［12］，果胶结构的变化（溶解、去酯化和解聚）导致细胞壁松动和解体，是果实成熟软化的重要原因［13］。

本研究以果实成熟阶段质地变化进程显著不同的两个黄秋葵品种苏优葵3号和Z06为试验材料，通过测定果实质地变化过程细胞壁组分的变化，联合转录组测序，明确黄秋葵果实质地变硬的主要原因，分析黄秋葵果实质地变化的生理与分子机制，探明影响黄秋葵果实质地的关键基因，进而为黄秋葵栽培模式创新提供理论依据，同时为其育种提供理论支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料及试验设计

选择果实相同发育阶段质地显著不同的两个黄秋葵品种苏优葵3号和Z06为试验材料，2020年4月10日播种于苏州市农业科学院蔬菜所基地，其中苏优葵3号为质地脆嫩品种，Z06为质地易老化变硬品种（图1）。于9：00~10：00分别收获开花后3 d、5 d和7 d的黄秋葵果实。每个时期取3个生物学重复，每个重复选取不同植株上的8个果实，去除果实头部、尾部及种子，留取中间3 cm的果实部分，将每个重复的取样部分充分混匀，分为3部分并迅速置于液氮中，保存于-80 ℃冰箱中分别进行后续细胞壁组分的测定、转录组测序和荧光定量试验。

图1  老化进程不同的2个黄秋葵品种（花后5 d）

Fig.1  Two okra varieties with different aging processes （5 days after flowering）

1.2 果实硬度、纤维素、半纤维素、木质素、果胶含量的测定

果实硬度使用GY-4硬度计（莱恩德，中国）测定；纤维素采用硫酸蒽酮比色法测定［

14］；半纤维素采用盐酸水解法测定［15］；木质素采用浓硫酸法测定［15］；可溶性果胶，原果胶采用咔唑比色法测定［16］。

1.3 RNA提取

准确称取100 mg黄秋葵果实使用液氮研磨，并置于1.5 mL离心管中，使用Plant RNA Kit（Omega，美国）提取RNA。对核酸样本进行琼脂糖凝胶电泳，目的是检验核酸样本的完整性；使用NanoDrop One（Thermo Fisher，美国）检测核酸的OD值，以测定核酸的纯度。

1.4 文库构建与转录组测序

提取后，使用寡核苷酸磁珠富集真核mRNA，使用Ribo-zerotm Magnetic Kit（Epicentre，美国）去除原核核糖体RNA（rRNA）。然后使用裂解缓冲液将富集的mRNA片段化，并使用随机引物将其转录成互补DNA（cDNA）。使用QiaQuick PCR Purification Kit（QIAGEN，德国）纯化DNA片段，进行末端修复、聚腺苷酸化并连接到Illumina测序接头。通过琼脂糖凝胶电泳分离连接产物，使用PCR进行扩增，在广州基迪奥生物公司使用Illumina HiSeqTM 4000进行测序。

1.5 差异表达基因的鉴定

通过删除包含接头、未知“N”碱基和低质量的Reads，获得高质量的Clean data。随后，进行气相色谱分析并计算读数的Q20和Q30。使用Trinity软件［

17］对参考基因组进行从头转录组组装。使用StringTie软件［18］计算每千碱基转录物片段/百万映射读取数（FPKM，fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值，以量化单基因的表达丰度和变异。同时，使用DESeq2和EdgeR软件［17］分析两个不同组之间RNA的差异表达。利用错误发现率（FDR，false discovery rate）校正P值，根据差异倍数（FC，fold change）确定差异表达基因，使用P<0.05和|log2 FC|≥1作为识别基因表达显著差异的阈值。并对筛选的DEGs进行GO和KEGG富集分析。

1.6 实时荧光定量（qRT-PCR）验证

选择10个显著差异表达的基因验证转录组数据的可靠性。使用Primer 5.0软件设计特异性引物。每个反应体系为20 μL，包含10 μL SYBR green Master Mix、0.4 μL正向和反向引物以及2 μL cDNA。扩增条件如下：95 ℃下初始变性30 s，95 ℃下变性10 s，60 ℃下退火30 s，循环35个周期。以ACT4作为内参基因，使用2-ΔΔCt方法用于计算每个样品的相对表达量。引物序列见表1。

表1  引物序列表
Table 1  Primer sequence listing

引物名称

Primer name

正向引物

Forward primer

反向引物

Reverse primer

退火温度（℃）Tm

扩增长度（bp）

Amplification length

ACT4 GCATCTCTTAGCACCTTCCAGCAG AGAAGCACTTCCTGTGGACAATGG 59.1 88
ASK8 CCGAAGCAGGTCAGATAA GCCACTCTCTAAGCACTT 60.2 140
RVE5- GTCACAGTGGCAGTAGT CCAGGGTCAAAGACATTAC 59.8 142
RPP25L GTGAAGCCATTGACTGAG CATAACCTCTCCCACCAT 59.5 100
At1g16860 GTGCCAAGATGCGTATATG CAGGAGAAGTAGCGATGT 60.3 92
FRL4B GCCTTGAGCAGTTAGAGA GCATAGGACCGCCATTA 59.4 96
CESA4 CGGTTACACCAAGTTCTG AAGCCTCTCAAGCCATT 59.7 111
PAL GCTAAGTGGTGAAGAAGTG GTTCCATTCCTCCAGACA 60.0 112
CCR1 TGAAGGAGCGAATGAGAG CAGGTGAAGCAGTATGGA 59.7 110
SUS1 AATGACCTGTGGACTACC CTAAATCGCCGTTGTAAGG 60.0 107
BGLU41 CGCCGATACTTCAAGGA CGAGGAACAGATACTACCA 60.0 148

2 结果与分析

2.1 黄秋葵果实发育过程中硬度与细胞壁组分的变化

随着黄秋葵果实发育，果实硬度逐渐升高，且Z06的硬度显著高于苏优葵3号（P<0.05）（图2）。果实中纤维素、木质素和原果胶的变化与果实硬度类似，开花后7 d，Z06的纤维素、木质素和原果胶含量比苏优葵3号显著高21.7%、40.84%、37.47%（P<0.05）。随着果实发育，苏优葵3号的半纤维含量呈现先升高后降低的趋势，Z06的半纤维素含量呈先降低后升高的趋势，开花后7 d，Z06的半纤维素含量比苏优葵3号显著高32.60%（P<0.05）。两品种中可溶性果胶含量随果实发育逐渐升高，而苏优葵3号的可溶性果胶含量显著高于Z06（P<0.05）。

图2  黄秋葵果实老化过程相关品质指标变化

Fig.2  Changes of quality indexes related to okra fruit aging process

*表示两品种在P<0.05水平上存在显著差异

*Indicates a significant difference between the two varieties at the P<0.05 level

2.2 转录组数据分析

在获得原始测序读数后，评估了测序数据的质量。在删除低质量的Reads后，获得了4000万到5500万Clean data。各样品中Q20碱基百分比均不小于97%，样品的GC含量在43.46%至44.37%之间。测序错误率在0.03%左右，满足后续分析要求（表2）。主成分分析（PCA，principal component analysis）表明（图3A），开花后5 d，苏优葵3号和Z06之间差异较小，其他各处理均具有较好的重复性和差异性。

表2  转录组数据质控表
Table 2  Transcriptome data quality control sheet

样品序号

Sample

原始数据

Raw data

有效数据

Clean data

错误率（%）

Error rate

Q20（%）Q30（%）GC（%）
AT1-1 47007958 46819292 0.03 97.53 93.20 43.99
AT1-2 45172246 44978518 0.03 97.63 93.41 43.46
AT1-3 49023184 48793698 0.03 97.44 93.04 43.97
AT2-1 49867614 49715450 0.03 97.59 93.29 43.91
AT2-2 49072880 48912576 0.03 97.62 93.35 43.96
AT2-3 49296486 49155128 0.03 97.73 93.58 43.90
AT3-1 40713026 40588450 0.03 97.71 93.55 43.71
AT3-2 49066968 48887278 0.03 97.58 93.27 43.78
AT3-3 44540166 44390560 0.03 97.58 93.29 43.78
BT1-1 53597436 53403072 0.03 97.70 93.49 43.98
BT1-2 45836548 45695616 0.03 97.66 93.34 44.22
BT1-3 45542282 45397510 0.03 97.69 93.47 44.37
BT2-1 44478354 44286514 0.03 97.56 93.25 43.67
BT2-2 44557716 44426318 0.03 97.65 93.41 43.82
BT2-3 48467076 48302570 0.03 97.61 93.31 43.88
BT3-1 45458472 45272078 0.03 97.35 92.76 43.74
BT3-2 47433318 47270036 0.03 97.57 93.22 43.78
BT3-3 52676596 52468026 0.03 97.55 93.24 43.57

AT： 苏优葵3号；BT： Z06；AT1、AT2、AT3分别表示AT在开花后3 d、5 d、7 d；BT1、BT2、BT3分别表示BT在开花后3 d、5 d、7 d；-1、-2、-3表示3个重复；下同

AT： Suyoukui 3； BT： Z06； AT1， AT2 and AT3 represent AT at 3 d， 5 d and 7 d after flowering， respectively； BT1， BT2 and BT3 represent BT at 3d， 5d and 7d after flowering， respectively； -1， -2 and -3 represent three duplicates； The same as below

图3  不同转录组样本PCA分析及DEGs统计

Fig.3  PCA analysis of different transcriptome samples and DEGs statistics

A： PCA分布图，红色虚线表示AT3，紫色虚线表示BT3，蓝色虚线表示AT2和BT2，绿色虚线表示AT1和BT1； B： DEGs统计分析，vs：比较组中均为后者相较于前者而言，下同

A： PCA distribution map， red dotted lines represent AT3， purple dotted lines represent BT3， blue dotted lines represent AT2 and BT2， and green dotted lines represent AT1 and BT1； B： Statistical analysis of DEGs； vs： In the comparison group， the latter was compared with the former， the same blow

2.3 差异表达基因分析

对鉴定的DEGs进行分类，不同发育时期相较而言，苏优葵3号中3个比较组共有15569个DEGs，Z06中共有18691个DEGs；在苏优葵3号中，开花后5 d较开花后3 d、开花后7 d较开花后5 d、开花后7 d较开花后3 d，有978个共同表达的差异表达基因；在Z06中，开花后5 d较开花后3 d、开花后7 d较开花后5 d、开花后7 d较开花后3 d，有1286个共同表达的差异表达基因。两品种相较而言，3个时期共有6288个DEGs；在3个发育时期，Z06相较于苏优葵3号，有219个共同表达的差异表达基因（图4A）。对差异表达基因进行聚类分析发现，两品种在同一时期和同一品种在不同发育时期的表达模式具有较大差异（图4B）。同一品种在开花后5 d较开花后3 d，下调基因数高于上调基因；而开花后7 d较开花后5 d，上调基因数高于下调基因。两品种在相同发育时期，Z06较苏优葵3号而言，除开花后3 d上调基因数高于下调基因，其他时期下调基因数均高于上调基因（图3B）。

图4  韦恩图及DEGs表达模式

Fig.4  Venn diagram and Expression pattern of DEGs

A： 不同品种和发育时期DEGs表达韦恩图，数字表示差异表达基因数量； B： 差异表达基因表达模式

A： Venn diagram of DEGs among different combinations of samples and stages， the number represents the number of DEGs； B： Expression pattern of DEGs

2.4 差异表达基因的GO和KEGG富集分析

Gene onotology（GO）可分为生物过程（Biological process）、细胞成分（Cellular component）以及分子功能（Molecular function）三大类功能。对同一品种不同发育时期和相同时期不同品种的DEGs进行GO富集分析，结果发现，差异表达基因在两种富集方式的结果相似，在生物过程（Biological process）中，代谢过程（Metabolic process）、细胞过程（Cellular process）和单生物过程（Single-organism process）显著富集；在细胞成分（Cellular Component）中细胞（Cell）、细胞组分（Cell part）和细胞器（Organelle）的DEGs数量最多；在分子功能（Molecular Function）中主要在催化活性（Catalytic activity）和物质结合（Binding）中富集显著（图5）。

  

  

图5  不同品种和果实发育时期DEGs的GO富集

Fig.5  GO enrichment of DEGs among different combinations of samples and stages

A：同一品种不同发育时期的DEGs；B：相同时期不同品种的DEGs

A： DEGs of the same variety at different developmental stages； B： DEGs of different varieties in the same period

利用KEGG对DEGs进行代谢通路富集，自上而下按-log10（Qvalue）大小排列聚类结果，发现相同时期不同品种的DEGs主要在代谢途径（Metabolic pathways）、光合（Photosynthesis）和光合作用天线蛋白（Photosynthesis-antenna protein）显著富集（图6A）；而同一品种不同发育时期的DEGs主要在苯丙烷生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、代谢途径（Metabolic pathways）和次级代谢产物的生物合成（Biosynthesis of secondary metabolites）显著富集（图6B）。

图6  不同品种和果实发育时期DEGs的KEGG富集

Fig.6  KEGG enrichment of DEGs among different combinations of samples and stages

A：相同时期不同品种的DEGs；B：相同品种在不同发育时期的DEGs

A： DEGs of different varieties in the same period； B： DEGs of the same variety in different developmental stages

2.5 与木质素合成相关的差异表达基因分析

对果实发育过程与木质素合成相关的DEGs进行筛选，在苏优葵3号中共筛选到30个DEGs，在Z06中共筛选到32个DEGs。对这些DEGs进行聚类分析，结果发现，在苏优葵3号中，开花后7 d较开花后5 d，PAL6、CAD1、CYP84A、CCR1、3个COMT、3个CYP73A、2个4CL显著上调表达；其中，4个PER基因显著上调表达，6个PER基因显著下调表达。开花后5 d相较于开花后3 d，7个过氧化物酶（PER，peroxidase）基因显著上调表达，4个PER基因显著下调表达。在Z06中，开花后7 d相较于开花后5 d，共有21个基因显著上调表达（包括PAL、CAD、CCR、COMT、CYP73A、CYP84A和部分4CL、PER基因）；其中，3个4CL基因显著上调表达，4 CL2显著下调表达；5个PER基因显著上调表达，8个PER基因显著下调表达。开花后5 d相较于开花后3 d，7个PER基因显著上调表达，2个PER基因显著下调表达（图7）。

图7  与木质素合成相关的差异表达基因在不同品种和发育时期的表达分析

Fig.7  Analysis of differential genes related to lignin synthesis among different combinations of samples and stages

红色为显著上调，蓝色为显著下调，白色没有显著差异

Red is significant up-regulated expression， blue is significantly down-regulated expression， and white is not significantly different

相同时期不同品种相比较而言，木质素合成相关DEGs在不同时期差异较大，开花后3 d，两品种间共有4个差异表达的基因，Z06较苏优葵3号显著上调表达的基因有CYP84A1、PAL6和PAL1，仅PER25显著下调表达；开花后5 d，共有6个差异表达的基因，Z06较苏优葵3号显著上调表达的基因有4个（PER30、PER19、PER72、CYP73A12），显著下调表达的基因有2个（PER52、PER25）；开花后7 d，两品种间的DEGs数最多，共有13个，Z06较苏优葵3号显著下调的基因包括6个PER基因（PER64、PER30、PER52、PER53、PER25、PER72）和1个CYP73A16，显著上调表达的6个基因分别为CYP84A1、CCR2、PAL6、PAL5、PAL1、CYP73A12。

2.6 与纤维素和果胶合成代谢相关的差异表达基因分析

由于开花后3 d，未筛选到纤维素和果胶合成代谢相关的DEGs，所以对开花后5 d和7 d重点分析。结果发现，开花后7 d较开花后5 d，两品种各有6个纤维素合成酶基因（CesA，cellulose synthase）显著上调表达；开花后5 d，Z06相较于苏优葵3号，CesA4基因显著下调表达，但在开花后7 d上调表达。BGLU作为纤维素酶家族，开花后7 d较开花后5 d，两品种各有2个基因显著下调表达，同时分别各有2个基因显著上调表达；两品种相较而言，开花后5 d有1个BGLU显著下调表达。SUS在纤维素合成过程起重要作用，开花后7 d较开花后5 d，两品种各有3个SUS基因显著上调表达；而在开花后5 d，Z06相较于苏优葵3号，仅SUS1显著上调表达，SUS5、SUS6、SUS7均显著下调表达；在开花后7 d，仅SUS1显著下调表达（图8）。

图8  与纤维素和果胶合成代谢相关的DEGs在不同品种和发育时期的表达分析

Fig.8  Expression analysis of DEGs associated with cellulose and pectin anabolism among different combinations of samples and stages

基因表达自左往右的4列分别代表AT2 vs AT3、BT2 vs BT3、AT2 vs BT2和AT3 vsBT3。彩色圆形符号表示该基因在此比较组显著差异表达，白色表示没有显著差异。GALE的3个比较组分别为BT2 vs BT3、AT2 vs BT2和AT3 vsBT3

The four columns of gene expression represent AT2 vs AT3， BT2 vs BT3， AT2 vs BT2 and AT3 vsBT3. Colored circle symbol indicates that the gene is significantly different expressed in this comparison group，and white is not significantly different.The three comparison groups of GALE are BT2 vs BT3， AT2 vs BT2 and AT3 vs BT3

开花后7 d较开花后5 d，参与果胶合成的GAUT1、GAUT12、GAUT14在苏优葵3号中表达量显著升高，GAUT1、GAUT6、GAUT9、GAUT12在Z06中表达量显著升高，而GAUT8基因在苏优葵3号中下调表达，GAUT5和GAUT8在Z06中下调表达；在开花后5 d和开花后7 d，Z06相对于苏优葵3号各有1个显著上调表达的GAUT基因，而开花后5 d，Z06相较于苏优葵3号有2个下调GAUT基因，在开花后7 d有3个下调GAUT基因。开花后7 d较开花后5 d，2个UDP阿拉伯糖4-差异构酶（GALE，UDP-glc 4-epimerase）基因在Z06中显著上调表达；两品种相较而言，差异表达的GALE基因均下调表达。在果胶代谢过程，开花后7 d较开花后5 d，PME15在苏优葵3号和Z06中均显著上调表达，但4个PME基因在苏优葵3号中显著下调表达，6个PME基因在Z06中显著下调表达；在开花后5 d，Z06相较于苏优葵3号，PME51显著下调表达，而在开花后7 d，除PME19显著上调表达外，5个PME基因显著下调表达。两品种在开花后7 d有3个PG均显著下调表达；而在开花后5 d，Z06相较于苏优葵3号，PG1上调表达，在开花后7 d，PG2、PG3下调表达（图8）。

2.7 与光合作用和天线蛋白相关的差异表达基因分析

对相同时期两品种与光合作用相关的DEGs表达情况进行分析，在开花后3 d，两品种间有22个与光合作用途径相关的DEGs，有9个与光合天线蛋白途径相关的DEGs，且这些基因在Z06中均上调表达（表3）。在Z06中，开花后5 d 6个光合作用途径相关基因显著上调，有5个基因显著下调；4个与光合天线蛋白途径相关的DEGs均显著上调。在开花后7 d，仅有psbB 1个差异表达基因显著上调表达。

表3  两品种与光合作用和天线蛋白相关的DEGs分析
Table 3  Analysis of DEGs related to photosynthesis and antenna proteins in two cultivars

代谢途径

Metabolic pathway

基因名称

Gene name

log2FC （AT1 vs BT1）log2FC （AT2 vs BT2）log2FC （AT3 vs BT3）

基因描述

Description

光合作用

Photosynthesis

atpF — 1.03 — ATP合成酶CF0亚基
atpB 1.06 -2.20 — ATP合成酶CF1β亚基
ATPC 1.76 — — ATP合酶γ链
petC 1.02 — — 细胞色素b6-f复合铁硫亚基
AP1 1.63 — — 铁氧化还原蛋白
PSBO 1.61 — — 放氧增强蛋白1
PSBP2 2.00 1.29 — 放氧增强蛋白2
psaA — -2.75 — 光系统I P700载脂蛋白A1
psaD 1.54 — — 光系统I反应中心亚基II
PSAF 1.63 1.01 — 光系统I反应中心亚基III
PSAK 1.42 — — 光系统I反应中心亚基psaK
PSAG 1.55 1.05 — 光系统I反应中心亚基V
PSAH 1.35 — — 光系统I反应中心亚基VI
PSAL 1.33 — — 光系统I反应中心亚基XI
PSAO 1.64 — — 光系统I亚基O
PSBY 1.41 — — 光系统II核心复合蛋白
psbK 1.08 -1.86 — 光系统II蛋白I
psbZ 1.22 -2.19 — 光系统II蛋白z
PSBW 1.36 — — 光系统II反应中心W蛋白
PSB27 1.32 1.24 — 光系统II修复蛋白
psbB — -1.90 1.19 光系统II反应中心蛋白CP47
PSBQ 1.43 — — 放氧增强蛋白3
PSAEA 1.39 1.79 — 光系统I反应中心亚基IV
PSBS 1.08 — — 光系统II22kDa蛋白
PSBR 1.38 — — 丙酮酸脱羧酶1样

光合天线蛋白

Photosynthesis antenna proteins

CAB-151 1.36 1.04 — CAB151蛋白
CAB1R 1.82 1.47 — 叶绿素a-b结合蛋白2
LHCA3 1.35 — — 叶绿素a-b结合蛋白3
CAB6A 1.45 — — 叶绿素a-b结合蛋白6A
LHCA6 1.50 — — 叶绿素a-b结合蛋白7
CAP10A 1.74 1.35 — 叶绿素a-b结合蛋白CP24 10A
LHCB5 1.43 — — 叶绿素a-b结合蛋白CP26
LHCB4.1 1.52 — — 叶绿素a-b结合蛋白CP29.2
LHCA4 1.67 1.03 — 叶绿素a-b结合蛋白4

表中正值为比较组后者较前者上调表达，负值为下调表达，—表示没有显著差异

The positive value is up-regulated expression of the latter in the comparison group， the negative value is down-regulated expression of the latter in the comparison group， and — indicates no significant difference

2.8 差异表达基因荧光定量PCR验证

为了测试转录组数据的可靠性，分别选择果实发育过程中显著上调和下调的基因各5个进行qRT-PCR（图9）。结果表明，基于qRT-PCR数据中10个基因的相对表达趋势与转录组测序结果一致。表明转录组的结果是高度可靠的。

图9  差异表达基因的qRT-PCR验证

Fig.9  qRT-PCR validation of differentially expressed genes

2.9 果实质地变硬的关键因素分析

冗余分析（RDA，redundancy analysis）可揭示多种因素对目标的影响。为了明确细胞壁组分对质地硬化的贡献度，通过RDA分析了5种细胞壁组分与硬度的关系，结果表明，木质素对果实硬度的贡献最大，其次为原果胶和纤维素，半纤维素对果实硬度的贡献较小，可溶性果胶对果实硬度的贡献最低（图10）。随后，通过RDA分析了影响木质素、纤维素和原果胶积累的关键基因。PAL对木质素的积累影响最大，其次为CCR1、4CL1和CAD1，PER31、PER51对木质素的积累呈负贡献。SUS3基因对纤维素的积累贡献最大，其次为SUS1、SUS2和CesA4、CesA9、CesA2及大部分BGLU基因对纤维素的积累有负贡献。GAUT6、SUS6、SUS2和GAUT14对原果胶的积累贡献较大，但大部分PME基因和PG基因对原果胶的积累呈负贡献（图10）。与光合作用相关的DEGs大部分与果实硬度成正相关，其中PSBP2和CAB1R对硬度的贡献较高，psaA等5个基因对果实硬度呈负贡献。RDA分析结果与前述中基因表达模式一致，证明了结果的可靠性。

图10  RDA分析影响质地的关键因素

Fig.10  RDA analysis of key factors affecting texture

A： 果实硬度与细胞壁组分相关性；B： 纤维素与纤维素合成代谢相关基因相关性；C： 木质素与木质素合成代谢相关基因相关性；D： 原果胶与果胶合成代谢相关基因相关性；E：硬度与光合相关基因相关性；横纵坐标分别表示在整体解释量中的重要性

The correlation between A： Fruit Hardness and cell wall components； B： Cellulose and cellulose synthetic metabolic related genes； C： Lignin and lignin synthetic metabolism related genes； D： Protopectin and pectin synthesis metabolism related genes； E： Hardness and photosynthesis related genes. The horizontal and vertical coordinates represent the importance in the overall interpretation volume

3 讨论

RNA-seq是探究植物发育分子机制的重要技术手段，广泛应用于产品器官质地变化的机理研究［

18］。本研究对果实成熟阶段质地变化进程显著不同的两个黄秋葵品种进行转录组测序，结果发现，随黄秋葵果实质地变硬，差异表达基因主要在苯丙烷生物合成途径富集。赵亚梅等［19］在桃树上有相似的发现，苯丙烷生物合成途径参与木质素生物合成，这与木质素对黄秋葵果实硬度贡献最大一致（图10），表明木质素积累是黄秋葵果实质地变硬最关键的因素。两品种质地的差异，除了与苯丙烷生物合成途径有关，光合作用和光合天线蛋白途径的差异表达基因也起到关键作用，大部分光合作用相关的基因与黄秋葵果实硬度呈正相关（图10），因为光合作用作为碳源积累的关键过程为纤维素、木质素、果胶等生物合成提供基础。Chen等［20］同样发现，光合作用对棉花的最终产量和纤维有很大贡献。本研究中，PSBP2和CAB1R对硬度的贡献较高。Ifuku等［21］研究发现PsbP对PSII的调节和稳定性至关重要，而CAB作为叶绿素结合蛋白，在桃果实成熟软化阶段迅速下调表达［22］，进一步揭示了PSBP2和CAB1R是影响黄秋葵两品种果实质地差异的重要基因。

细胞壁结构是影响果实质地的重要因素［

23］。木质素作为细胞壁的重要组分，是影响黄秋葵果实质地变硬的主要原因。类似的研究表明，木质素积累会增加桃果实的硬度［19］，但降低愈伤组织弹性［24］。PAL是木质素生物合成途径的限速酶，其表达及活性与木质素含量密切相关［25］。Lu等［26］研究表明，过表达RcPLA基因可显著提高蓖麻木质素的含量。本研究中，PAL对木质素合成的贡献最高，筛选的所有PAL基因均随黄秋葵果实老化显著上调表达，且Z06的PAL表达显著高于苏优葵3号，表明PAL是调控黄秋葵果实木质素积累的关键因子。此外，CCR1、4CL1和CAD1也对木质素的积累有较大贡献。CCR是木质素生物合成单信号通路中的第一个固定酶［27］，且CCR的表达与木质素含量呈显著正相关［28］。本研究中，Z06差异表达的CCR基因随果实发育均显著上调表达，且CCR2基因在Z06中的表达高于苏优葵3号，表明CCR对黄秋葵果实木质素的积累起重要作用。相似的研究表明，CCR2基因的敲除会导致杨树木质素的显著降低［29］。4CL是催化单信号醇生物合成途径中的一个关键步骤，对木质素沉积具有重要作用［30］，本研究中两品种的4CL1在开花后7 d表达量最高，从而促进黄秋葵果实发育后期木质素的积累。过表达AaCAD可显著提高青蒿中木质素的含量［31］，这也与本研究中CAD1对木质素的贡献一致。本研究中共筛选到15个差异表达的PER基因，而仅有PER21对木质素的贡献最高，大部分PER基因对木质素的积累为负贡献，这可能因为PER为大基因家族，存在功能冗余，且仅有部分PER对木质素的合成起作用［32］，因此，本研究筛选的PER21基因对木质素的合成促进作用有待进一步研究。

本研究中，纤维素对果实硬度也呈正贡献。李永平等［

33］同样发现，纤维素在黄秋葵果实老化过程起重要作用。本研究发现，SUS3对纤维素的合成贡献最高，Fujii等［34］同样研究表明，除CesA外，SUS是纤维素合成催化单元的重要部分，且Coleman等［35］在杨树中过表达SUS基因，显著提高了木质部纤维素含量，证明了SUS与纤维素合成及次生细胞壁形成密切相关。CesA是纤维素合成的重要催化步骤［36］，本研究中，CesA4、CesA6、CesA7、CesA8对纤维素合成呈正贡献，表明CesA的上调表达也是纤维素积累重要原因。BGLU在纤维素代谢过程起重要作用［37］。本研究中，除BGLU41外，其他BGLU基因均对纤维素呈负贡献，表明BGLU基因的下调表达是黄秋葵果实中纤维素积累的重要原因。

果胶可在局部水平上控制水的性质，从而影响分子相互作用，赋予细胞壁机械性能［

38］，且Kozioł等［39］研究表明果胶是细胞壁力学性能的决定因素。原果胶的降解，会使果肉细胞分离导致硬度下降［3］。本研究中，原果胶对果实硬度的贡献度与纤维素类似，且Z06的原果胶含量显著高于苏优葵3号，表明原果胶作为连接细胞壁各组分的重要物质，对黄秋葵果实硬度有重要作用。类似的研究发现，较高的原果胶、纤维素含量可维持细胞壁的完整性，从而保证无花果的硬度，但可溶性果胶含量较低［4］。本研究中，GAUT6对原果胶的贡献最高，其次为SUS6和SUS2，Biswal等［40］同样研究发现，GAUT的沉默表达导致杨树中果胶含量的降低，表明GAUT6是影响黄秋葵果实果胶积累的关键基因；但SUS对果胶的调控作用报道较少，本研究中SUS对果胶生物合成的调控机制有待进一步研究。PG和PME是促进果胶降解重要的代谢酶，本研究中，大部分PME和PG对原果胶的积累均呈负贡献，表明PG和PME表达水平的降低也是果胶积累的重要原因。Gwanpua等［41］同样研究发现，MdPG的表达水平与苹果硬度呈显著负相关。

4 结论

综上所述，与黄秋葵果实发育和质地变硬有关的差异表达基因主要富集于苯丙烷生物合成途径；而两个品种质地的差异除了与苯丙烷生物合成途径有关，光合作用及光合天线蛋白途径的差异表达基因也起到关键作用。PSBP2和CAB1R是光合途径中影响两品种质地差异的关键基因。木质素的积累对黄秋葵果实质地变硬起主要作用，PAL是调控木质素积累的主要基因，显著影响不同发育时期两个品种木质素的合成，而PAL、CCR2、CYP84A1、CYP73A12是影响品种质地差异的重要基因。纤维素和原果胶对黄秋葵果实变硬也具有积极的贡献。SUS3对黄秋葵果实纤维素积累贡献最大，且SUS和CesA显著影响了果实发育过程纤维素的积累。GAUT6是调控黄秋葵果实原果胶积累的重要基因，且PG和PME的下调表达是果实发育过程果胶积累的重要原因；此外SUS6和SUS2对原果胶的积累也具有较大贡献，但其对果胶合成的调控机制有待进一步研究。

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