摘要
小麦雄性不育材料作为一种非常宝贵的种质资源，对小麦杂交育种和杂种优势利用研究具有重要价值。本团队前期从小麦高代品系4167中发现一个雄性不育突变体，将其命名为4167ms，对其进行了不育表型鉴定、遗传分析和分子标记定位研究。结果表明，该突变体表现为花药干瘪不外露，1% I2-KI染色发现突变体花粉粒为不能正常着色的无规则形状，败育彻底。经过多年秋播和春播鉴定，其不育性状稳定，不受光温变化的影响。以4167ms为母本和不同小麦品种杂交得到的正交F1育性完全正常， F2分离群体中可育株与不育株的理论分离比例均符合3∶1；反交（科大342//4167ms/4167）F1结实正常，F2育性分离行中可育株与不育株的分离比例符合3∶1，说明4167ms不育表型受单隐性核不育基因控制，暂命名为ms1t。构建4167ms/中国春F2定位群体，采用BSA法和SSR分子标记连锁分析，获得位于小麦染色体4BS上5个与mslt连锁的SSR标记，其顺序为Xwmc617、Xkd661、Xkd696、ms1t、Xkd495、Xkd393，两侧最近标记Xkd696、Xkd495与ms1t基因的遗传距离分别为3.9和1.9 cM。比对分析中国春物理图谱，ms1t与MS1基因位于相同区域，因此推测4167ms的ms1t可能是MS1的一个隐性等位变异。
小麦是全世界最重要的粮食作物之一，也是中国第二大粮食作物。随着经济快速发展和人口的不断增长，再加上不良气候的影响，小麦产量供不应求，而小麦的各项性状普遍存在杂种优势，为了满足日益增长的需求，利用杂种优势是充分发掘小麦生产潜力和提高其抗逆性及适应性的有效途
目前发现的小麦核不育基因位点有5个，分别为3个显性位点：MS2、MS3和MS4，2个隐性位点：MS1和MS5。MS1基因被定位在4BS染色体上，先后由我国学者邓兴旺、马力耕团队合作以及澳大利亚学者与美国先锋公司合作克隆并鉴
分子标记技术是发掘和定位小麦新基因的主要技术手段之一。SSR（Simple sequence repeat）标记即简单重复序列多态性，也叫微卫星分子标
4167ms是本课题组从小麦高代品系4167中发现的一个小麦雄性不育突变体，该突变体具有不育性状稳定、败育彻底、恢复性强、异交结实率好等特点。本研究对4167ms进行了初步的表型鉴定、遗传分析和基因定位，获得了与其紧密连锁的SSR标记，并绘制了分子遗传连锁图谱，研究结果对雄性不育基因进行分子标记辅助选择和小麦杂交育种体系的应用具有重要意义。
试验材料为本课题组2015年在普通小麦高代品系4167（系谱为科大H328/西农291//郑麦366）中发现的雄性不育突变体，根据其与本品系可育株杂交后代的育性分离情况，初步推测可能为隐性核不育，并将该不育突变体命名为4167ms。小麦品种中国春、新麦26、轮选1298、西农22、长武521、周麦18、西农979、新麦2111、豫教5号、济麦22、西农1376、天民198、周麦24、济麦987、矮抗58、许科718、农大3486、邯6172、周麦22、郑麦0943、西农20、科大342均来自河南科技大学小麦遗传育种课题组，种植于河南科技大学实验农场。
镜检：小麦扬花期选取可育及不育穗，剥取中下部的花药，随后将花药中部切开，用镊子挤压花药，花粉于1% I2-KI中染色制片，随后在显微镜下观察并拍照，根据染色结果判断花粉粒育性。
秋播育性调查：2017-2020年，每年10月中旬播种（4167ms/4167）F2分离群体，在扬花期随机选取30个不育株，每株选取1穗花前套袋自交，灌浆后期进行育性调查。
春播育性调查：2018-2020年，每年2月中旬播种（4167ms/4167）F2分离群体，在扬花期随机选取30个不育株，每株选取1穗花前套袋自交，灌浆后期进行育性调查。
回交试验组合：4167ms与4167杂交获得F1，以F1为父本与4167ms杂交，获得BC1F1，其中可育株自交获得BC1F2。
正交试验组合：以4167ms为母本，以新麦26、轮选1298、西农22、长武521、周麦18、西农979、新麦2111、豫教5号、济麦22、西农1376、天民198、周麦24、济麦987、矮抗58、许科718、农大3486、邯6172、周麦22、郑麦0943、西农20共计20个品种为父本杂交获得F1和F2。
反交试验组合：以科大342为母本，以育性完全恢复的（4167ms/4167）F1为父本进行反交，反交F1每株取1穗脱粒，获得的反交F2种植成穗行，调查各穗行的育性表现及育性分离穗行的分离比例。
调查上述试验获得的F1、F2、BC1F1和BC1F2的育性表现。单穗结实率=［两侧基部总粒数/（可孕小穗数×2）］×100%，卡方测验分析遗传规律。
以4167ms与中国春的杂交F2为作图群体，用来进行遗传分析和基因定位。在育性分离调查后，用CTA
参考GrainGenes网站（http：//wheat.pw.usda.gov/）上公布的小麦SSR标记分子遗传图谱，在小麦21条染色体上选取并合成308对SSR引物。在亲本及近等基因池间筛选多态性的SSR标记，进行聚丙烯酰胺凝胶电泳完成初步定位。根据基因初步定位结果，在Ensembl Plants网站（http：//plants.ensembl.org/index.html）上下载MS1基因的CDS序列，并在WheatOmics上Chinese Spring v1.0 MS1基因上下游各3M bp范围内寻找多次重复序列，运用Primer5.0软件设计SSR引物（
引物名称 Primer name | 重复序列（次数） Repeat sequence （frequency） | 正向引物（5'-3'） Forward sequence （5'-3'） | 反向引物（5'-3'） Reverse sequence （5'-3'） |
|---|---|---|---|
| Xwmc617 | CCACTAGGAAGAAGGGGAAACT | ATCTGGATTACTGGCCAACTGT | |
| Xkd393 | CT（24） | ATTCCATCCCGCCTCTTT | CACGCACTCAGTCATCTTTCTC |
| Xkd495 | TC（15） | TTGGCTGTGGCGACCAATC | ACCTAAATGGGCAGGCTCACA |
| Xkd661 | ACCAA（6） | CCACCAACCCAAGTAAGC | GAACAACGCAAGGAAAGC |
| Xkd696 | AC（26） | CTGTGACAACACAAACCCGC | CAACTCGCTATGCGGTCTCC |
在Applied Biosystems GeneAmp PCR System 9700上进行PCR反应。反应体系为10 μL，含有2×Taq Master Mix 5 μL，ddH2O 3 μL，上下游引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL。扩增程序为94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，55~61 ℃（根据具体引物确定退火温度）退火45 s，72 ℃ 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸5 min。PCR产物保存在4 ℃。扩增产物经8%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，银染显色后进行带型统计。
不育突变体植株在营养生长阶段和野生型植株无差异。在抽穗后期，突变体植株对比野生型植株特点显著，表现为突变体穗型松散，颖壳张角增大，可见羽毛状柱头，虽能正常产生花药，但花药基本不外露。在灌浆期，突变体植株穗型收缩，没有结实，野生型植株正常灌浆结实（
图1 不育系4167ms和野生型表型
Fig.1 Phenotypic of the sterile line 4167ms and its wild type （WT）
A： 穗型；B： 花药；C1~C2： 花粉粒
A： Spike type； B： Anther type； C1-C2： Pollen grains
突变体育性调查结果表明，连续3年秋播和春播套袋的所有4167ms不育穗均没有自交结实现象。由此证明4167ms为不受光温变化影响的稳定彻底的雄性不育突变体。
回交试验的调查结果表明：BC1F1可育株与不育株间的育性分离比例符合1∶1的单隐性基因遗传分离规律，BC1F2可育株与不育株的育性分离比例符合3∶1的单隐性基因遗传分离规律（
组合 Crosses | 总株数 No. of plants | 可育株数 No. of fertile plants | 不育株数 No. of sterile plants | 分离比 Segregation ratio | 理论分离比 Theoretical segregation ratio | P值 P value | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| P1/P2 F1 | 49 | 26 | 23 | 1.13 | 1∶1 | 0.1837 | 0.50~0.75 |
| P1/P2 F2 | 413 | 306 | 107 | 2.86 | 3∶1 | 0.1364 | 0.50~0.75 |
P1： 4167ms； P2： 4167ms/4167；
P1： 4167ms； P2： 4167ms/4167；
正交试验的调查结果表明：20个F1均结实正常，平均结实率为81.2%，F2可育株与不育株分离比例符合3∶1的单隐性基因遗传分离规律（
组合 Crosses | F1结实率（%） Seed set rate of F1 | F2总株数 No. of F2 plants | 可育株数 No. of fertile plants | 不育株数 No. of sterile plants | 分离比 Segregation ratio | 理论分离比 Theoretical segregation ratio | P值 P value | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 4167ms/新麦26 | 81.3 | 206 | 157 | 49 | 3.204 | 3∶1 | 0.1036 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/轮选1298 | 84.9 | 150 | 114 | 36 | 3.167 | 3∶1 | 0.0356 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/西农22 | 85.1 | 157 | 116 | 41 | 2.829 | 3∶1 | 0.0531 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/长武521 | 83.2 | 164 | 122 | 42 | 2.905 | 3∶1 | 0.0081 | ＞0.90 |
| 4167ms/周麦18 | 78.9 | 196 | 149 | 47 | 3.170 | 3∶1 | 0.0612 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/西农979 | 83.4 | 162 | 118 | 44 | 2.682 | 3∶1 | 0.2963 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/新麦2111 | 89.7 | 218 | 167 | 51 | 3.275 | 3∶1 | 0.2202 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/豫教5号 | 83.9 | 126 | 93 | 33 | 2.818 | 3∶1 | 0.0423 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/济麦22 | 81.5 | 151 | 114 | 37 | 3.081 | 3∶1 | 0.0022 | ＞0.90 |
| 4167ms/西农1376 | 78.3 | 159 | 120 | 39 | 3.077 | 3∶1 | 0.0021 | ＞0.90 |
| 4167ms/天民198 | 78.8 | 207 | 157 | 50 | 3.140 | 3∶1 | 0.0403 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/周麦24 | 81.4 | 169 | 128 | 41 | 3.122 | 3∶1 | 0.0178 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/济麦987 | 80.5 | 141 | 105 | 36 | 2.917 | 3∶1 | 0.0024 | ＞0.90 |
| 4167ms/矮抗58 | 86.3 | 196 | 150 | 46 | 3.261 | 3∶1 | 0.1701 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/许科718 | 78.4 | 130 | 99 | 31 | 3.194 | 3∶1 | 0.0410 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/农大3486 | 87.6 | 141 | 106 | 35 | 3.029 | 3∶1 | 0.0024 | ＞0.90 |
| 4167ms/邯6172 | 85.4 | 188 | 143 | 45 | 3.178 | 3∶1 | 0.0638 | 0.75~0.90 |
| 4167ms/周麦22 | 83.1 | 185 | 143 | 42 | 3.405 | 3∶1 | 0.4054 | 0.50~0.75 |
| 4167ms/郑麦0943 | 86.8 | 209 | 156 | 53 | 2.943 | 3∶1 | 0.0016 | ＞0.90 |
| 4167ms/西农20 | 84.6 | 203 | 154 | 49 | 3.143 | 3∶1 | 0.0411 | 0.75~0.90 |
反交试验的调查结果表明：（科大342//4167ms/4167）F1结实正常，F2种植总穗行数为16行，其中全可育行数为7行；育性分离行数为9行，总株数209株，可育株数157株，不育株数52株；育性分离行中可育株与不育株的分离比例符合3∶1的单隐性核基因遗传分离规律（
组合 Crosses | 总株数 No. of plants | 可育株数 No. of fertile plants | 不育株数 No. of sterile plants | F2分离比 Segregation ratio | 理论分离比 Theoretical separation ratio | P值 P value | |
|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 科大342//4167ms/4167 | 209 | 157 | 52 | 3.019 | 3∶1 | 0.0016 | 0.90~0.95 |
上述表型鉴定和遗传分析表明，该雄性不育突变体为不育性状遗传稳定、败育彻底，不受光温变化影响的单隐性核基因突变体，将该基因暂命名为ms1t。
选取分布在小麦21条染色体上共计308对SSR引物在可育亲本中国春、不育亲本4167ms，可育池、不育池上进行PCR扩增，结果发现位于4B染色体上有两个SSR标记Xwmc617和Xwmc710分别扩增出多态性条带，将Xwmc617与Xwmc710在4167ms/中国春的F2分离群体进行单株检测，发现Xwmc710连锁不紧密，Xwmc617连锁较为紧密，为共显性标记（
图2 Xwmc617、Xkd393、Xkd495和Xkd661在4167ms/中国春F2群体部分单株上的PCR扩增结果
Fig.2 Amplification pattern of polymorphic marker Xwmc617、Xkd393、Xkd495 and Xkd661 in the F2 individuals of the 4167ms/CS segregating population
1：4167ms； 2：中国春； 3~12：不育单株； 13~22：可育单株
1： 4167ms； 2： Chinese Spring； 3-12： Sterile plants； 13-22： Fertile plants
根据初步定位结果，利用4BS染色体上的多次重复序列，设计SSR引物Xkd393、Xkd495、Xkd661和Xkd696，分别在双亲、可育单株和不育单株上进行PCR扩增检测。结果显示：Xkd393、Xkd495和Xkd696在可育、不育亲本和可育、不育单株间扩增出了有差异的多态性条带，为共显性标记；Xkd661在可育亲本和可育单株上扩增出了多态性条带，而在不育亲本和不育单株上没有相应的扩增产物，为显性标记（
图3 Xkd696在4167ms/中国春F2群体部分单株上的PCR扩增结果
Fig.3 Amplification pattern of polymorphic marker Xkd696 in the F2 individuals of the 4167ms/CS segregating population
1：中国春；2：4167ms；3~12：可育单株；13~22：不育单株
1： Chinese Spring； 2： 4167ms； 3-12： Fertile plants； 13-22： Sterile plants
图4 染色体4BS上雄性不育基因的分子标记连锁图谱
Fig.4 Linkage map of male sterile gene on wheat chromosome 4BS
小麦隐性核不育系具有很多优势，它们很容易与大多数普通小麦形成恢复系，并且不会受到异源细胞质的不利影响，因此用其作为亲本很容易选出强优势的杂交组合。4167ms是由本课题组发现的由自然突变而来的稳定雄性不育材料，经过多年秋播和春播种植鉴定，4167ms农艺性状良好，败育彻底，其育性不受光照、温度条件变化的影响，正常小麦品种均可成为它的恢复系，因此明确其雄性不育基因具有重要的研究价值。小麦隐性核不育材料虽然恢复系广泛，但是存在无法获得稳定遗传的雄性不育保持系的问题。刘忠祥
本研究通过遗传分析明确了4167ms的不育性是由1对隐性核基因（ms1t）控制，并通过获得的5个与之连锁的SSR标记（Xwmc617、Xkd661、Xkd696、Xkd495和Xkd393），将其定位在染色体4BS上，它们与不育基因ms1t间的遗传距离分别为10.9、4.0、3.9、1.9和5.5 cM。距离目的基因最近的两侧标记为Xkd696和Xkd495，其遗传距离分别为3.9和1.9 cM。目前位于小麦染色体4BS上的已发现并克隆的雄性不育基因为MS1。本研究成功地将4167ms定位在染色体4BS上12.27~14.26 Mb的物理区间，该区间中存在MS1基因，本研究开发的多态性SSR标记是基于MS1基因为中心上下游选取多次重复序列设计，且分子标记连锁图谱的结果与MS1基因在物理图谱中的位置基本对应。Xkd661和Xkd696在连锁图谱和物理图谱上的位置出现了相反的变化，表明亲本材料可能发生了染色体倒位。同时课题组使用Tucker
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