不同超长链脂肪酸延长酶基因<bold>FAE1</bold>芥酸合成功能的比较

韩凤英; 王津; 胡馨月; 徐劲松; 许本波; 张学昆; 赵福永; HAN Feng-ying; WANG Jin; HU Xin-yue; XU Jin-song; XU Ben-bo; ZHANG Xue-kun; ZHAO Fu-yong

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不同超长链脂肪酸延长酶基因FAE1芥酸合成功能的比较 PDF

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徐劲松 ^2,3
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许本波 ^1,3
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张学昆 ^2,3
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赵福永 ^1,3
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1. 长江大学生命科学学院，湖北荆州 434025； 2. 长江大学农学院，湖北荆州 434025； 3. 长江大学湿地生态与农业利用教育部工程研究中心，湖北荆州 434025

最近更新：2023-03-13

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20220913001

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摘要

植物芥酸是在以FAE1（Fatty acid elongase 1）编码的β-酮脂酰-CoA合酶为关键限速酶的多酶复合体的催化下合成的，主要以TAG形式储存于种子中，是一种重要的油脂化工原料。不同植物来源的FAE1基因序列差异是导致其芥酸合成能力差异的根本原因。为分离和鉴定芥酸高合成能力的FAE1，本研究采用同源克隆法从油菜、海甘蓝、旱金莲和荷包蛋花等4种植物中克隆获得了12条正常编码的FAE1基因序列，并分别构建表达载体在酵母中进行诱导表达和芥酸含量比较分析。结果表明，源于不同植物的12条FAE1基因cDNA序列一致性介于52.1%~99.9%，氨基酸序列一致性介于49.9%~99.8%，FAE1基因具有明显的种属特性。酵母表达及GC-MS分析结果表明，源于绵油328、海甘蓝和荷包蛋花的8个FAE1基因具有超长链脂肪酸合成能力，其中CaFAE1-3合成芥酸能力最强（4.82%），其次为GjFAE1-1（4.53%），LdFAE1合成芥酸能力最弱（0.29%）；CaFAE1-3对C20∶1转化率可达95.39%，在高芥酸育种领域具有极大的应用潜力。另外4个源自阳光80和旱金莲的FAE1基因均不具有芥酸合成功能，因为GyFAE1-2、TmFAE1-1和TmFAE1-2在保守的半胱氨酸或（和）组氨酸位点存在突变，而GyFAE1-1存在1个R395K突变，导致酶活丧失。本研究增进了对FAE1基因结构与功能之间关系的认识，为油菜和海甘蓝的高芥酸育种及芥酸性状基因工程改良提供了科学依据。

关键词

FAE1; 超长链脂肪酸; 芥酸; 生物合成; 酵母表达

超长链脂肪酸（VLCFAs，very-long-chain fatty acids）是指主链碳原子数超过18个的脂肪酸，在生物体内主要以三酰甘油（TAG，triacylglycerol）、蜡质前体、甘油磷脂及鞘磷脂等4种形式存在，参与多种生命活动进程^［

1］。植物能合成多种形式的VLCFAs，不同的VLCFAs有着不同的生理功能，如种子中以TAG形式贮存的VLCFAs是重要的能量储备物质，为种子萌发和幼苗生长供能；鞘脂和磷脂是细胞膜的重要结构组分和信号分子；基于VLCFAs合成的植物表皮角质层蜡质对于避免水分散失、防止病原菌入侵以及适应环境胁迫方面有着重要作用^{［参考文献 2

百度学术}2］。

芥酸（Erucic acid， C22∶1）是一种超长链单不饱和脂肪酸，主要由十字花科（Cruciferae）和金莲花科（Tropaeolaceae）等植物合成并以TAG形式贮存于种子中^［

3-4］。芥酸因其具有疏水性强、润滑性能优异以及氧化-聚合速度较短碳链脂肪酸慢等特性，是一种重要的油脂化工原料，在冶金、机械、橡胶、化工、油漆、纺织和医药等领域具有广泛用途^{［参考文献 5

百度学术}5］。芥酸的生物合成通路及其分子调控网络现已研究得较为清楚^{［参考文献 1-2}1-2］。芥酸等单不饱和超长链脂肪酸是在细胞内质网中以油酯酰-CoA（C18∶1-CoA）为底物，在脂肪酸碳链延长酶复合体的催化下，以丙二酰-CoA为碳源并经过多次相继的缩合反应合成的，其中由FAE1（Fatty acid elongase1）编码的β-酮脂酰-CoA合酶（KCS，β-ketoacyl-CoA synthase）是关键的限速酶^{［参考文献 1-2}1-2］。James等^{［参考文献 6

百度学术}6］首次从拟南芥中克隆了FAE1基因，并证明其是种子中超长链脂肪酸合成的必需基因。此后，FAE1在希蒙得木^{［参考文献 7

百度学术}7］（Simmondsia chinensis）、油菜^{［参考文献 8-12}8-12］（Brassica napus， Brassica rapa， Brassica juncea）、甘蓝^{［参考文献 11-12}11-12］（Brassica Olercea）、芜菁^{［参考文献 11-12}11-12］（Brassica campestris）、旱金莲^{［参考文献 13

百度学术}13］（Tropaeolum majus）、海甘蓝^{［参考文献 14

百度学术}14］（Crambe abyssinica）、荷包蛋花^{［参考文献 15

百度学术}15］（Limnanthes douglasii）、银扇草^{［参考文献 16

百度学术}16］（Lunaria annua）、碎米荠^{［参考文献 17

百度学术}17］（Cardamine graeca）等多种植物中被克隆。不同植物种子芥酸含量差异极大，旱金莲是迄今报道的自然界中种子芥酸含量最高的植物，达80%，其次为海甘蓝，为55%~60%^{［参考文献 13-14}13-14］。遗传因素、环境因子和栽培措施（播期、氮肥施用量、栽培密度等）等均会影响种子芥酸含量，其中遗传因素是决定因素^{［参考文献 18-19}18-19］。FAE1编码产物的功能正常与否、活性高低、表达水平等直接决定芥酸的合成量。

Ghanevati等^［

20］研究发现，功能型FAE1具有高度保守的半胱氨酸残基（C85、C223、C270、C312、C389、C460）和组氨酸残基（H302、H387、H391、H420），其中C223是活性位点，可能参与酰基链转移。Han等^{［参考文献 8

百度学术}8］和Katavic等^{［参考文献 12

百度学术}12］发现，BnFAE1第282位丝氨酸残基（S）对其芥酸合成能力至关重要，若突变为苯丙氨酸（F），则芥酸合成能力丧失。Katavic等^{［参考文献 21

百度学术}21］进一步对该位点进行点突变后发现，FAE1的活性高低主要与该位点氨基酸残基的大小和电子密度有关，若为甘氨酸（G）或半胱氨酸（C）等较小的氨基酸则其活性更高。FAE1的S282对芥酸合成能力的重要性后续也得到了证实^{［参考文献 22-24}22-24］。AtFAE1和BnFAE1嵌合基因表达结果证实，FAE1第92位氨基酸（K92R）是决定底物特异性的关键位点^{［参考文献 25

百度学术}25］。Sun等^{［参考文献 26

百度学术}26］依据DNA序列将十字花科FAE1归为5个进化分支，并鉴定了16个影响种子芥酸含量的候选活性位点。FAE1关键位点氨基酸的突变会导致生物学活性丧失，是产生低芥酸材料的重要途径^{［参考文献 27

百度学术}27］。

酵母自身仅能合成微量的VLCFAs，且不能合成C22∶1等超长链单不饱和脂肪酸，但在其体内重组表达功能型FAE1则能合成C22∶1^［

8，12］。因此，酵母表达系统非常适宜用于FAE1芥酸合成功能分析，并已有多例报道^{［参考文献 8

百度学术}8，10，14，16-17，20-21，24，28-30］。该系统的优点在于，不仅能鉴定FAE1有无芥酸等超长链脂肪酸合成能力，而且还能平行比较不同FAE1的芥酸合成能力，因为相同条件下不同FAE1的芥酸合成量与其活性紧密相关。因此，为分离和鉴定芥酸高合成能力的FAE1，本研究选取了高芥酸油菜绵油328、高油酸油菜阳光80、荷包蛋花^{［参考文献 15

百度学术}15］、旱金莲^{［参考文献 31

百度学术}31］和海甘蓝^{［参考文献 32

百度学术}32］等5种种子芥酸含量不同的植物材料，采用同源克隆法拟获取其基因组中全部FAE1拷贝并分别构建重组表达载体，然后通过气质联用色谱仪检测各酵母重组菌诱导表达后的脂肪酸组分，筛选具有芥酸高合成能力的FAE1，以期增进对FAE1基因结构与功能关系的认识，为采用现代生物技术创制超高芥酸材料和高芥酸遗传育种提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

高芥酸油菜绵油328（芥酸含量51.3%）、高油酸油菜阳光80（芥酸含量<2.0%）种子由长江大学油菜课题组提供；海甘蓝种子由中国农业科学院油料作物研究所陆光远副研究员馈赠；旱金莲和荷包蛋花种子由长江大学生命科学学院何勇副教授馈赠。油菜与海甘蓝均播种于长江大学农业科技产业园试验地，常规田间管理。旱金莲和荷包蛋花，用营养土种植于植物生长培养室中（25±2 ℃，16 h/8 h（光照/黑暗））。

1.2 菌株、质粒及主要试剂

大肠杆菌（DH5α）和酵母菌株（INVSc1）感受态细胞均购自上海维地生物技术有限公司，酵母表达质粒pYES2/NT A由长江大学油菜遗传育种实验室保存。植物基因组DNA提取试剂盒（EasyPure Plant Genomic DNA Kit）、平末端连接试剂盒（pEASY-Blunt Cloning Kit）、质粒提取试剂盒（Plasmid MiniPrep Kit）及高保真DNA聚合酶（FastPfu DNA polymerase）、T4 DNA连接酶等均购自北京全式金生物技术有限公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒（FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit）购自南京诺唯赞生物技术有限公司；限制性内切酶EcoRI、BamHI等购自Fermentas公司；酵母氮源基础（YNB）、DO Supplement-Ura购自北京酷莱博科技有限公司；棉子糖、半乳糖购自上海麦克林生化科技有限公司；脂肪酸甲酯化试剂甲醇、正庚烷、石油醚均为色谱纯，其他试剂均为分子试剂级或分析纯。

1.3 FAE1的克隆与测序

已报道的绝大多数FAE1是无内含子蛋白编码基因^［

6，11-13，28，33］。因此，本研究以各种植物基因组DNA为扩增模板进行FAE1克隆。分别剪取各植物幼嫩叶片组织100 mg，按照植物基因组DNA提取试剂盒说明书操作步骤提取高质量基因组DNA。依据甘蓝型油菜（BnaA08g11130D）、海甘蓝（AGG87083）、旱金莲（DQ417593.1）、荷包蛋花（AF247134.1）FAE1基因序列，应用NCBI网站Primer-BLAST程序设计PCR特异扩增引物，送北京擎科生物技术有限公司合成（表1）。PCR扩增体系（50 μL）为：10×Buffer（Mg²⁺）5 μL；Primer-F（10 μmol/L）2 μL ；Primer-R（10 μmol/L）2 μL；dNTPs（2.5 mmol/L）5 μL ；gDNA 模板（100 ng）2 μL；Pfu DNA聚合酶 2 μL；ddH₂O 32 μL；扩增程序为：95 ℃ 3 min；95 ℃ 45 s， 60 ℃ 45 s， 72 ℃ 1 min 30 s， 36个循环；72 ℃ 7 min。PCR扩增产物经2.0%琼脂糖凝胶电泳后，切取目的条带用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。按平末端连接试剂盒说明书构建连接反应体系，连接产物转化大肠杆菌感受态细胞，转化产物涂布于含50 mg/L卡那霉素的LB固体平板。37 ℃、过夜培养，挑取抗性单菌落进行菌落PCR检测，各挑取10个左右阳性菌落送北京擎科生物技术有限公司进行测序。

表1 基因克隆与重组表达载体构建引物信息

Table 1 Information of primers for gene cloning and recombinant expression vector

引物名称	引物序列（5'-3'）	引物名称	引物序列（5'-3'）
Primer name	Sequence （5'-3'）	Primer name	Sequence （5'-3'）
BnFAE1-F	CCGGAATTCATGACGTCCGTTAACGTAAAGC	BnFAE1-R	CGGGATCCTTAGGACCGACCGTTTTGGAC
CaFAE1-F	CCGGAATTCATGACGTCCATTAACGTAAAGCTC	CaFAE1-R	CGGGATCCTTAGGACCGACCGTTTTGGG
TmFAE1-F	CCGGAATTCATGTCAGGAACAAAAGCAACATCAG	TmFAE1-R	CGGGATCCTTAATTTAATGGAACCTCAACCGGAA
LdFAE1-F	CCGGAATTCATGTCGGAGACAAAACCTGAGA	LdFAE1-R	CGGGATCCTTAGACAACAGCAACCGGAAAC
LdFAE1-Ex2-F	GGAGAAGACAAAGGTGAATCCGAAG	LdFAE1-Ex1-R	CTTCGGATTCACCTTTGTCTTCTCC
Linker-F	AGCTTGGGCCGGAATTCCGGGATCCCGGCT	Linker-R	CTAGAGCCGGGATCCCGGAATTCCGGCCCA
pYES2-sq-F	AATATACCTCTATACTTTAACGTC	pYES2-sq-R	GCGTGAATGTAAGCGTGAC

引物序列中斜体加粗字母表示限制性内切酶识别序列

Italic and bold letters in primer sequences indicate the restriction enzyme recognition site

1.4 FAE1序列生物信息学分析

对测序后的FAE1基因序列采用BioEdit 7.0（http：//www.mbio.ncsu.edu/bioedit/bioedit.html）、序列处理在线工具包（http：//www.bio-soft.net/sms/）、MOTIF Search （https：//www.genome.jp/tools/motif/）、TMHMM 2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php?TMHMM-2.0）、MEGA-X （https：//www.megasoftware.net/）等进行基因结构、DNA及推导氨基酸序列比对、限制性酶切位点、结构域预测以及系统进化树构建等分析。

1.5 酵母表达质粒pYES2/NT A的改造与FAE1重组表达质粒的构建

为避免表达载体N端标签序列（6×His、Xpress^TM epitope、Enterokinase （EK） recognition site）影响FAE1蛋白的正确折叠和生物学功能发挥，遂对表达载体进行了改造。依据载体序列酶切位点构成及所有FAE1基因序列酶切位点分析结果（均不含EcoRI和BamHI识别序列），本研究设计了含4个限制性酶切位点（HindIII+EcoRI+BamHI+XbaI）的连接头（表1）。载体改造流程如下：（1）pYES2.0/NT A质粒DNA用HindIII和 XbaI进行双酶切，回收大片段备用；（2）取Linker-F 和Linker-R各10 μL混合于离心管，95℃水浴5 min，自然冷却备用；（3）用T4 DNA连接酶构建回收载体大片段与连接头退火产物的连接体系（10 μL），16℃连接过夜；（4）连接产物转化大肠杆菌，筛选重组子并鉴定，改造后的质粒命名为pYES2/HEBX。

提取pYES2/HEBX质粒DNA，用EcoRI和BamHI进行双酶切，回收大片段；然后与经相同双酶切处理的各FAE1扩增产物进行连接、转化和重组子鉴定。对于各FAE1重组表达质粒菌，经测序引物组合（pYES2-sq-F/pYES2-sq-R）初筛后，各挑取2~3个单菌落送北京擎科生物技术有限公司进行测序验证。对于序列无误的单菌落，摇菌后用质粒提取试剂盒抽提质粒DNA，用于酵母转化。

1.6 酵母重组菌的诱导表达及脂肪酸分析

各FAE1重组表达质粒及空载体pYES2/HEBX质粒的酵母转化，参照酵母菌INVSc1感受态细胞产品说明书进行。转化菌液涂布于SD-U平板筛选后，挑取单菌落用载体测序引物组合进行菌落PCR鉴定，阳性菌落用于后续诱导表达分析。为得到理想的FAE1蛋白表达量，诱导表达前，以酵母转化菌（pYES2/HEBX、pYES2/HEBX-TmFAE1-1、pYES2/HEBX-GyFAE1-1）绘制生长曲线，获得的最佳诱导表达条件为：30℃，250 r/min，振荡培养16 h。

取诱导表达后的各重组菌菌液于4 ℃，4000 r/min离心6 min收集酵母菌体。无菌水重复清洗3次后，菌体置-80 ℃冰箱中冷冻8 h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥。称取酵母干燥菌体65 mg或种子样品100 mg按照武玉花等^［

24］方法进行脂肪酸甲酯化处理。以空载体酵母转化菌为阴性对照，取甲酯化后的样品用气相色谱质谱联用仪（Thermo Scientific Trace 1300-ISQ）进行脂肪酸组分分析，2次生物学重复。色谱及质谱条件：TG-FAME（50 m×0.25 mm×0.20 μm）色谱柱；载气为氦气；流速为0.63 mL/min；进样量为1.0 μL；分流比为30∶1；进样口温度270 ℃；升温程序为80 ℃（保持1 min），以20 ℃/min速率升高到160 ℃（保持1.5 min），再以3 ℃/min的速率升高到250 ℃（保持3 min）。离子化方式为电子轰击（EI，electron impact）；离子化能量70 eV；传输线温度260 ℃；离子源温度280 ℃；扫描范围50~350 amu （atomic mass unit）。

酵母菌株INVSc1仅能合成微量的VLCFAs，对研究结果影响极小，故计算各脂肪酸含量及脂肪酸转化率时均未加以考虑。因FAE1延长酶仅以C18∶0或C18∶1为初始底物进行碳链延长，并不涉及不饱和键数的改变，因此每一分子超长链脂肪酸均可对应一分子C18∶0或C18∶1，故其脂肪酸转化率可以按照公式：转化率=［1-Cn/（Cn+C（n+2）+C（n+4）+C（n+6））］×100%计算（n=18~22），饱和脂肪酸和单不饱和脂肪酸分类计算。

2 结果与分析

2.1 不同植物来源的FAE1的序列分析

测序结果分析表明，不同植物基因组中的FAE1基因拷贝数不同，且功能基因间存在SNP位点，编码氨基酸序列存在差异（图1）。绵油328中至少存在3个FAE1拷贝，分别命名为GjFAE1-1、GjFAE1-2 和GjFAE1-3，均为单外显子基因，长度分别为1521 bp、1521 bp和1517 bp。GjFAE1-1和GjFAE1-2均编码长度为506个氨基酸的FAE1蛋白。相对于GjFAE1-1和GjFAE1-2，GjFAE1-3在第1366~1369位有4 bp碱基（TCAG）缺失，导致其编码区发生移码突变，不能翻译出正常功能蛋白。阳光80中则至少存在4个FAE1拷贝，分别命名为GyFAE1-1、GyFAE1-2、GyFAE1-3 和GyFAE1-4，均为单外显子基因，长度分别为1521 bp、1521 bp、1519 bp和1519 bp。其中GyFAE1-1和GyFAE1-2均编码长度为506个氨基酸的FAE1蛋白，但GyFAE1-3 和GyFAE1-4相对于GyFAE1-1和GyFAE1-2，在第1422~1423位存在2 bp碱基（GA）缺失，导致其编码区发生移码突变，不能翻译出正常功能蛋白。海甘蓝中至少存在5个FAE1拷贝，分别命名为CaFAE1-1、CaFAE1-2、CaFAE1-3、CaFAE1-4和CaFAE1-5，均为单外显子基因，长度也均为1521 bp，均能编码506个氨基酸的FAE1蛋白。旱金莲中至少存在2个FAE1拷贝，分别命名为TmFAE1-1和TmFAE1-2，均为单外显子基因，长度均为1512 bp，编码503个氨基酸的FAE1蛋白。TmFAE1-1和TmFAE1-2编码区仅存在1个SNP（T698G）位点，但导致了氨基酸序列出现了F233C差异。荷包蛋花中仅鉴定到1个FAE1拷贝，命名为LdFAE1。不同于上述物种中的FAE1基因，LdFAE1含有1个长度为80 bp的内含子，其cDNA编码区全长1518 bp，编码505个氨基酸的FAE1蛋白。因此，在构建表达载体的过程中，特异设计了LdFAE1-Ex1-R和LdFAE1-Ex2-F引物，以实现2个外显子的拼接而获得其编码区全长序列。上述12个能正常编码蛋白的FAE1基因之间cDNA序列一致性介于52.1%~99.9%之间，推导氨基酸序列一致性介于49.9%~99.8%之间，其系统进化关系如图2所示，FAE1表现出明显的种属特性。

图1 不同植物来源FAE1氨基酸序列功能结构域及关键氨基酸位点分析

Fig.1 Key amino acid site and functional domain analyses of FAE1 originated from different plant species

GjFAE1、GyFAE1、CaFAE1、TmFAE1和LdFAE1分别表示克隆自高芥酸油菜绵油328、高油酸油菜阳光80、海甘蓝、旱金莲和荷包蛋花的FAE1基因的氨基酸推导序列；AAA70154.1为拟南芥FAE1氨基酸序列；下同。表示丙二酰辅酶A结合位点；表示二聚体组装作用位点；表示催化活性位点；表示短链酯酰CoA结合位点；红色矩形内序列表示跨膜结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）

GjFAE1， GyFAE1， CaFAE1， TmFAE1， and LdFAE1 represent the deduced amino acid sequences of FAE1 isolated from high erucic acid rapeseed Mianyou 328， high oleic acid rapeseed Yangguang 80， Crambe abyssinica， Tropaeolum majus， and Limnanthes douglasii， respectively. AAA70154.1 represents the arabidopsis FAE1 protein； The same as below. symbol indicates key sites for malonyl-CoA binding； symbol indicates key sites for dimer interface； symbol indicates key sites for active； symbol indicates key sites for product binding site； Sequences in red rectangle represent transmembrane domain Ⅰ，Ⅱ and Ⅲ

图2 不同植物来源的FAE1系统进化树

Fig.2 Phylogenetic tree of FAE1 originated from different plant species

GjFAE1：绵油328 FAE1； GyFAE1：阳光80 FAE1； CaFAE1：海甘蓝 FAE1； TmFAE1：旱金莲 FAE1； LdFAE1：荷包蛋花 FAE1； AAA70154.1：拟南芥 FAE1

GjFAE1： FAE1 isolated from rapeseed cultivar Mianyou 328； GyFAE1： FAE1 isolated from rapeseed cultivar Yangguang 80； CaFAE1： FAE1 isolated from Crambe abyssinica；TmFAE1： FAE1 isolated from Tropaeolum majus； LdFAE1： FAE1 isolated from Limnanthes douglasii； AAA70154.1： FAE1 from Arabidopsis

FAE1是一种膜结合蛋白^［

25］。跨膜结构域的数量、位置及其氨基酸残基组成均会影响其膜结合稳定性，进而影响其生物学功能。对各FAE1基因推导氨基酸序列采用TMHMM 2.0程序分析发现，不同物种来源的FAE1其跨膜结构域的数量和位置均不同，而同一物种的不同FAE1拷贝则相同（图1）。油菜、海甘蓝和旱金莲3个物种的FAE1均含有3个跨膜结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ），其中Ⅰ、Ⅱ位于N端，而油菜和海甘蓝FAE1的跨膜结构域Ⅲ位于C端，旱金莲的跨膜结构域Ⅲ则位于中部；荷包蛋花和拟南芥FAE1只有两个跨膜结构域（Ⅰ、Ⅱ），且均位于N端。进一步对各跨膜结构域分析发现，亲缘关系越近的物种间其FAE1相同位置跨膜结构域氨基酸序列保守性越高，亲缘关系越远的物种间相同位置跨膜结构域氨基酸序列差异越大，各结构域包含18~23个氨基酸残基不等；同属十字花科的油菜和海甘蓝的FAE1其3个跨膜结构域（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）的氨基酸残基数均为23个，但其序列组成存在差异；而拟南芥FAE1的2个跨膜结构域的氨基酸残基数分别为20个（Ⅰ）和23个（Ⅱ），序列组成与前二者之间差异更大。旱金莲FAE1的跨膜结构域Ⅰ和Ⅱ的氨基酸残基数均为23个，而跨膜结构域Ⅲ为18个。荷包蛋花的FAE1的跨膜结构域Ⅰ和Ⅱ的氨基酸残基数均为23个（图1）。

依据旱金莲FAE1蛋白序列（ABD77097）的功能注释，对本研究克隆所获得的12条FAE1蛋白序列及拟南芥FAE1蛋白序列（AAA70154）分析发现，参与丙二酰辅酶A结合的氨基酸位点F272、V334、GRA（394~396）均极其保守，位点R98、DT（101~102）可塑性较大。十字花科的FAE1在98、101~102均分别为K、DI，而与旱金莲（R、DT）和荷包蛋花（H、KC）的差异较大；参与二聚体组装的位点在十字花科内较保守，与旱金莲和荷包蛋花的差异较大；3个催化活性位点（C223、H391、N424）极其保守，除TmFAE1-1为F223外，其余FAE1的3个活性位点氨基酸完全相同；参与短链脂酰CoA结合的位点也较为保守，E251、I253、R273、G344、V339、S426和S456在所有FAE1中完全相同。上述有些关键氨基酸位点还同时参与多种作用，如V325既参与二聚体组装也参与短链脂酰CoA的结合，V334既参与丙二酰辅酶A结合也参与短链脂酰CoA的结合（图1）。

从上述序列分析结果可以看出，不同植物来源的FAE1一级结构存在广泛的氨基酸差异，这些差异位点的协同作用可能是导致芥酸等超长链脂肪酸合成能力差异的根本原因。

2.2 FAE1的酵母表达分析

武玉花等^［

24］研究证明，源于十字花科不同物种的6个FAE1基因，不论是否具有生物学活性，酵母中蛋白表达量均无明显差异。本研究采用的表达系统和策略与武玉花等^{［参考文献 24

百度学术}24］相似，故借鉴其研究结果粗略认为，本研究中各FAE1基因在相同诱导表达条件下的蛋白表达量基本一致。

GC-MS分析结果表明，阴性对照（含pYES2/HEBX空载体酵母转化菌）不积累C22∶1（图3A），表达阳光80及旱金莲FAE1的酵母菌株也不积累C22∶1（图3I~L）。但是，在旱金莲种子中检测到有较高水平的C22∶1积累（图4），说明旱金莲基因组中还可能存在其他FAE1拷贝，而已克隆的2个FAE1拷贝功能失活。表达绵油328、海甘蓝及荷包蛋花FAE1 的酵母菌株均积累C20-C24超长链脂肪酸（图3B~C、D~H、M），但各种脂肪酸合成量存在差异；表达绵油328、阳光80和海甘蓝FAE1菌株中的C20∶1含量差异与各植物种子中C20∶1含量差异趋势一致，但在这些种子中均能检测到多不饱和脂肪酸（图4）。从超长链脂肪酸合成总量平均值（表2）看，表达GjFAE1-1的酵母菌株积累最多，相对丰度达20.99%，其次为CaFAE1-2（20.18%），在CaFAE1中CaFAE1-4积累最少，为12.06%，比LdFAE1还低1.06%，说明不同FAE1其编码产物的生物学活性差异较大。从合成产物的碳链长度看，表达GjFAE1-1的酵母菌株积累的C22（C22∶0、C22∶1）脂肪酸相对于所有脂肪酸组分总量占比最大，为11.51%，其次为表达CaFAE1-3的酵母菌株（11.47%），说明这2个基因产物对C18和C20饱和及单不饱和脂酰-CoA均具有较高的底物亲和性；但是，CaFAE1-3更倾向于以C20∶1-CoA为底物，能合成更多的芥酸（4.82%），其C20∶1转化率可达95.39%，远高于GjFAE1-1的81.67%，在高芥酸育种及芥酸基因工程上极具应用潜力。

图3 不同FAE1基因转化酵母脂肪酸组分的气质色谱分析

Fig.3 GC-MS analysis of fatty acid components in yeast transformed with different FAE1 genes

A：空载质粒Pyes2/HEBX； B， C： GjFAE1-1， GjFAE1-2； D~H： CaFAE1-1~CaFAE1-5； I， J： GyFAE1-1， GyFAE1-2； K， L： TmFAE1-1， TmFAE1-2； M： LdFAE1. 色谱峰1至峰11代表的脂肪酸分别为棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、花生酸（C20∶0）、花生烯酸（C20∶1）、山嵛酸（C22∶0）、二十二碳烯酸（C22∶1，cis-11）、芥酸（C22∶1，cis-13）、木蜡酸（C24∶0）、神经酸（C24∶1）

A： Negative plasmid Pyes2/HEBX； B， C： GjFAE1-1， GjFAE1-2； D-H： CaFAE1-1-CaFAE1-5； I， J： GyFAE1-1， GyFAE1-2； K， L： TmFAE1-1， TmFAE1-2； M： LdFAE1.Chromatographic peak 1 to peak 11 represents palmitic acid （C16∶0）， palmitoleic acid （C16∶1）， stearic acid （C18∶0）， oleic acid （C18∶1）， arachidic acid （C20∶0）， eicosenoic acid （C20∶1）， behenic acid （C22∶0）， docosenoic acid （C22∶1， cis-11）， erucic acid （C22∶1， cis-13）， lignoceric acid （C24∶0）， and nervonic acid （C24∶1）， respectively

图4 种子中脂肪酸组分的气质色谱分析

Fig.4 GC-MS analysis of fatty acid components in seeds

A：绵油328； B：海甘蓝； C：阳光80； D：旱金莲；色谱峰1至峰12代表的脂肪酸分别为棕榈酸（C16∶0）、棕榈油酸（C16∶1）、硬脂酸（C18∶0）、油酸（C18∶1）、亚油酸（C18∶2）、花生酸（C20∶0）、花生烯酸（C20∶1）、亚麻酸（C18∶3）、山嵛酸（C22∶00）、芥酸（C22∶1）、木蜡酸（C24∶0）、神经酸（C24∶1）

A： Mianyou328； B： Crambe abyssinica； C： Yangguang80； D： Tropaeolum majus； Chromatographic peak 1 to peak 12 represent palmitic acid （C16∶0）， palmitoleic acid （C16∶1）， stearic acid （C18∶0）， oleic acid （C18∶1）， linoleic acid （C18∶2）， arachidic acid （C20∶0）， eicosenoic acid （C20∶1）， linolenic acid （C18∶3）， behenic acid （C22∶0）， erucic acid （C22∶1）， lignoceric acid （C24∶0）， and nervonic acid （C24∶1）， respectively

表2 不同FAE1转化酵母菌脂肪酸组分气相色谱质谱分析

Table 2 GC-MS analyses of fatty acid components in yeast transformed with different FAE1 genes

峰号 Peak number	脂肪酸种类 Fatty acid type	转化基因及平均脂肪酸相对含量 Target gene and average relative abundance of fatty acid
峰号 Peak number	脂肪酸种类 Fatty acid type	GjFAE1-1	GjFAE1-2	CaFAE1-1	CaFAE1-2	CaFAE1-3	CaFAE1-4	CaFAE1-5	LdFAE1	GyFAE1-1	GyFAE1-2	TmFAE1-1	TmFAE1-2	pYES2/HEBX
1	棕榈酸（C16∶0）	14.76	14.97	15.02	14.79	14.58	16.94	15.39	14.77	21.27	21.22	21.31	20.95	21.15
2	棕榈油酸（C16∶1）	25.10	24.03	24.41	24.15	25.72	28.83	25.15	25.28	29.55	29.35	28.18	29.58	28.24
3	硬脂酸（C18∶0）	3.90	4.30	4.38	4.04	3.78	5.11	4.39	5.68	10.71	10.30	11.03	10.09	10.66
4	油酸（C18∶1）	8.65	9.38	9.46	8.84	9.48	13.81	9.70	17.84	24.65	24.51	24.48	25.25	24.71
5	花生酸（C20∶0）	0.88	0.90	0.92	0.93	0.84	0.89	0.78	3.30	0.15	0.15	0.17	0.17	0.19
6	花生烯酸（C20∶1）	2.15	2.03	2.62	2.42	0.48	1.99	1.97	4.92	0.07	0.06	0.04	0.03	0.06
7	山嵛酸（C22∶0）	3.11	2.74	2.46	2.97	2.77	1.42	2.69	1.88	0.08	0.08	0.10	0.10	0.11
8	二十二碳烯酸（C22∶1（cis-11））	3.87	3.49	4.17	3.73	3.88	3.41	3.22	0.17
9	芥酸（C22∶1（cis-13））	4.53	4.05	3.68	3.73	4.82	1.31	4.42	0.29
10	木蜡酸（C24∶0）	5.27	4.82	4.20	5.12	4.60	2.68	4.64	2.50	0.13	0.15	0.17	0.16	0.21
11	神经酸（C24∶1）	1.18	1.13	1.02	1.28	1.23	0.36	1.27	0.06

脂肪酸相对含量值取自两次独立生物重复测定的平均值；表中空格表示未检测到相应脂肪酸

The value of relative abundance of fatty acid is taken from the average of two independent biological repeated determinations； The space in the table indicates that the corresponding fatty acid is undetectable

来自阳光80和旱金莲FAE1的酵母转化菌均未检测到C22∶1、C24∶1脂肪酸的积累。对其序列分析发现，GyFAE1-2编码产物第282位为苯丙氨酸F，而非丝氨酸S，是一种无活性的产物；GyFAE1-1蛋白氨基酸序列与本研究具有芥酸合成能力的其他FAE1蛋白相比，其在第395位为赖氨酸K，而其他FAE1蛋白为精氨酸R，可能是其无活性的原因，其编码基因来自于C基因组^［

23］。功能型FAE1均具有保守的半胱氨酸残基和组氨酸残基，任何一个发生突变都会使酶的活性完全丧失^{［参考文献 20

百度学术}20］。TmFAE1-1仅具有其中的5个保守的半胱氨酸残基，对应GjFAE1-1第223位为苯丙氨酸F；此外，对应GjFAE1-1第420位也非组氨酸H，为酪氨酸Y。TmFAE1-2与TmFAE1-1仅1个氨基酸残基差异，即对应GjFAE1-1第223位，TmFAE1-2此处为半胱氨酸C，第420位与TmFAE1-1相同，均为酪氨酸Y。因此，可以推测，TmFAE1-2的失活是保守的组氨酸突变（H420Y）的结果，TmFAE1-1是保守的半胱氨酸（C223F）和保守的组氨酸（H420Y）双重突变的结果。然而，LdFAE1在对应的第420位也为酪氨酸Y，但它仍具备较弱的超长链脂肪酸合成能力，说明不同的FAE1活性丧失分子机制存在差异。

3 讨论

3.1 植物芥酸性状的遗传与利用

虽然自然界中旱金莲种子的芥酸含量最高，但其种子含油量极低（6%~10%），且具有匍匐性生长习性、种子成熟期不一致、易脱落等不利性状，致使其无法大规模推广和应用^［

34］。目前，国内外芥酸工业制备的主要原料是高芥酸菜籽油和海甘蓝籽油，国内企业则主要使用高芥酸菜籽油。

甘蓝型油菜^［

3-4］（AACC， 2n=4 x =38）和海甘蓝^{［参考文献 35

百度学术}35］（2n=6x=90）均为十字花科多倍体物种，但对于种子芥酸性状遗传的认识多来源于甘蓝型油菜。甘蓝型油菜种子芥酸含量受2对具有加性作用的胚基因控制，同时还受遗传因素和环境因素互作影响^{［参考文献 36-37}36-37］，后发展为2对主基因+多基因控制的遗传模式，2对主基因分别位于A、C不同染色体组，基因效应不等，同时存在多基因的修饰作用^{［参考文献 38

百度学术}38］。Fourmann等^{［参考文献 39

百度学术}39］发现，甘蓝型油菜基因组中的2个FAE1基因（BnFAE1.1和BnFAE1.2）与控制芥酸含量的2个基因座位（E1和E2）存在共分离关系。Barret等^{［参考文献 40

百度学术}40］进一步证实，其中一个FAE1（CE7）即为E1候选基因，推测另一个FAE1可能为E2候选基因，E1和E2分别决定芥酸含量水平总变异的56.4%和28.6%，二者可共解释芥酸含量变异的90.6%。Qiu等^{［参考文献 41

百度学术}41］利用TNDH群体检测到2个调控种子芥酸含量的主效QTL，分别位于A8和C3连锁群。在此基础上，Wang等^{［参考文献 42

百度学术}42］证实，这2个QTL的候选基因均为FAE1基因（Bn.FAE1-A8、Bn.FAE1-C3）。十字花科FAE1基因的序列变异与其种子芥酸含量密切相关，两者之间存在因果关系^{［参考文献 26

百度学术}26］。虽然少有海甘蓝种子芥酸性状遗传的文献报道，但其种子中的芥酸含量同样是受FAE1调控^{［参考文献 14

百度学术}14，43］。

因此，生产上高、低芥酸品种的选育主要是FAE1的选择。选择功能失活型FAE1培育低芥酸或高油酸品种用于食用油生产，如阳光80、中双系列、华杂系列等品种^［

27，44-45］；选择功能型FAE1培育高芥酸品种用于工业用油生产，如绵油系列^{［参考文献 18-19}18-19］、高芥1号^{［参考文献 46

百度学术}46］等油菜品种以及Carmen、Hochst、Prophet等海甘蓝品种^{［参考文献 16

百度学术}16，35，43］。针对两种类型的FAE1基因序列特征，已开发出了SNP、RAPD、CAPS、SCAR、InDel等^{［参考文献 9

百度学术}9，23，39，45，47-49］多种分子标记可供使用，大大提高了育种效率，加速了育种进程。

3.2 FAE1基因与芥酸合成能力

肖玲等^［

22］发现，油菜FAE1基因在其编码区DNA序列水平存在广泛的单核苷酸多态性（SNP）。在本研究中，不同物种的FAE1基因其编码蛋白同样存在广泛的一级结构差异，是导致其芥酸合成能力差异的根本原因。来自绵油328和海甘蓝的功能型FAE1均具有3个跨膜结构域、6个保守的半胱氨酸残基、4个保守的组氨酸残基以及S282、R395等特征，而来自阳光80和旱金莲的失活型FAE1在上述某一或多个关键氨基酸位点均存在突变，但LdFAE1虽存在H420Y关键位点突变却仍具有弱活性，说明FAE1的分子失活机制存在多样性。

底物特异性是FAE1最重要的特性之一，与其一级结构紧密相关。不同的FAE1对不同碳链长度和饱和度的脂酰-CoA亲和力存在差异，并最终决定了合成的VLCFAs的碳链长度。AtFAE1仅以C18∶1-CoA和C20∶1-CoA为底物^［

28］，LdFAE1倾向于以饱和脂肪酸C18∶0-CoA和C20∶0-CoA为底物^{［参考文献 14

百度学术}14］，而SdFAE1^{［参考文献 6

百度学术}6］、BnFAE1^{［参考文献 15

百度学术}15］、TmFAE1^{［参考文献 12

百度学术}12］以及CaFAE1^{［参考文献 13

百度学术}13］对C18和C20饱和及单不饱和脂肪酸-CoA均具有亲和力，且对C20的亲和力更高。本研究也有相似发现，2个生物学活性较高的GjFAE1-1和CaFAE1-3对C20的底物特异性均要高于C18，两者对C18∶0-CoA的转化率分别为70.36%和68.47%，对C20∶0-CoA的转化率均为90%左右；两者对C18∶1-CoA的转化率分别为57.56%和52.34%，但对C20∶1-CoA的转化率CaFAE1-3（95.39%）要远远高于GjFAE1-1（81.67%）。因此，高芥酸育种上CaFAE1-3更具应用潜力。

Blacklock等^［

25］认为，FAE1的底物特异性是由其N端和C端氨基酸序列共同决定的。目前，FAE1对底物脂酰-CoA碳链长度和不饱和度选择的分子机制还不太清楚^{［参考文献 50-51}50-51］。但对于合成产物碳链长度的分子机制，Denic等^{［参考文献 51

百度学术}51］通过蛋白脂质体重构实验提出了分子卡尺（Molecular caliper）机制，认为活性位点与Elop延长酶跨膜螺旋管腔端附近的赖氨酸之间的距离是决定因子。Paul等^{［参考文献 30

百度学术}30］发现，酵母中单一一种超长链碳链延长酶Elop能将不同碳链长度底物合成到同一长度产物，同时不同Elop又能将同一碳链长度底物合成为不同碳链长度产物。

3.2 FAE1基因与芥酸含量

FAE1基因剂量与芥酸含量。转基因研究表明，种子中芥酸含量与其转入FAE1拷贝数成正相关，功能拷贝数越多芥酸含量越高，且含油量也越高^［

4］；反之，FAE1基因突变失活后，其种子芥酸含量显著降低，同时含油量也降低^{［参考文献 10

百度学术}10，42，52-53］。本研究发现，海甘蓝基因组中至少存在5个FAE1基因拷贝，且均具备芥酸合成能力，是否是其种子芥酸含量高的直接原因值得进一步研究。

FAE1芥酸合成能力与芥酸含量。Puyaubert等^［

54］发现，源自于高、低芥酸油菜品种的FAE1基因在转录水平具有相似的表达趋势，但仅高芥酸来源的FAE1能在种子中合成芥酸，说明这种芥酸合成能力差异是发生在翻译后，即蛋白质序列水平。芥酸高合成能力的FAE1基因其编码产物往往具有特定的序列组成和关键氨基酸位点。Wang等^{［参考文献 23

百度学术}23］采用EcoTILLING技术对110余份芸薹属材料的FAE1基因序列分析发现，Bn.FAE1-A8第845 bp的碱基C或T对种子芥酸含量影响显著，此处为C的单倍型其平均芥酸含量为45.36%，为T的单倍型仅含2.04%；对应的编码氨基酸分别为282位丝氨酸（S）或苯丙氨酸（F）。Bn.FAE1-C3则存在第1366~1369 bp或（和）第1422~1423 bp碱基缺失的3种单倍型，无缺失单倍型的芥酸平均含量为44.73%，1366~1369 bp缺失单倍型芥酸平均含量为2.78%，1422~1423 bp缺失单倍型芥酸平均含量为0.67%，双位点缺失单倍型芥酸平均含量为0.55%，显著低于单位点缺失的含量。本研究从高芥酸油菜品种绵油328和高油酸品种阳光80中克隆的FAE1序列特征与Wang等^{［参考文献 23

百度学术}23］分析结果极其相似，只是FAE1缺失型突变缺失的碱基组成存在差异，缺失的碱基数目和位置均相同。此外，FAE1蛋白氨基酸序列也是正确空间构象形成、二聚体组装效率、膜结合稳定性、底物结合偏好性等的决定因素。FAE1突变导致其编码产物失活是目前低芥酸油菜的主要基因资源。Wu等^{［参考文献 44

百度学术}44］鉴定到FAE1发生4 bp缺失导致零芥酸油菜。Wang等^{［参考文献 42

百度学术}42］采用TILLING技术获得的3个低芥酸材料（L080-1， N004-1，L297-1），可以作为一种新的遗传资源用于LEA油菜育种，而不会产生间接近亲繁殖效应和遗传侵蚀。

FAE1基因表达调控与芥酸含量。FAE1启动子具有极强的种子表达特异性，且活性要高于同类启动子napin，由其驱动的FAE1的转录高峰期与油脂积累进程几乎同步^［

55］。Yan等^{［参考文献 45

百度学术}45］对我国1981份白菜型油菜地方品种分析发现，不同于甘蓝型油菜，白菜型油菜低芥酸性状并不是FAE1编码序列变异导致，而可能是其起始密码子上游1300 bp处的28 bp碱基（富含AT）缺失导致了FAE1表达水平下降所致。该基因型表现出在分离群体中与低芥酸性状共分离。此外，转录因子MYB96可以结合到FAE1基因启动子区促进其在种子中的表达进而促进芥酸合成^{［参考文献 56

百度学术}56］。

3.3 超高芥酸分子设计育种的几点思考

芥酸是一种重要的化工原料，具有广泛的应用领域和巨大的市场需求，培育超高芥酸含量的作物品种，经济价值可观，社会效益明显^［

5，34］。用植物种子生产芥酸具有可再生性，是工业芥酸原料获取的理想途径。提高种子油中的芥酸含量能有效降低其工业制备成本，Li等^{［参考文献 43

百度学术}43］估算，若种子油中芥酸含量增加10%，其制备成本可降低一半；若含量达到90%则可直接用于芥酸酰胺生产而无需纯化。在高芥酸及超高芥酸材料创制方面，已有大量的研究和报道，方法和手段也多样，如种内杂交^{［参考文献 57

百度学术}57］、种间杂交^{［参考文献 58

百度学术}58］、体细胞杂交^{［参考文献 32

百度学术}32，59］、RNA干扰^{［参考文献 60-61}60-61］、转基因^{［参考文献 4

百度学术}4，10，43，62-65］等，其中Li等^{［参考文献 43

百度学术}43］报道的一个海甘蓝转基因株系（BnFAE + LdLPAT + CaFAD2-RNAi）种子芥酸含量达76.9%，是迄今芥酸含量最高的遗传工程材料。那么，植物种子中的芥酸含量是否还有提升空间，又如何实现？

基于对种子中脂肪酸生物合成通路、转运储存机制及分布规律^［

66］等的认识和理解，以及按照作物生产上的“源-流-库”理论，从以下几个方面着手对脂肪酸合成关键结构基因和调控基因进行设计和优化，并综合应用于育种实践，获得芥酸含量达到80%~90%的材料是完全有可能的。

（1）育种手段的选择。油菜和海甘蓝基因组中均不具有将芥酸导入到TAG的sn-2位功能的溶血性磷脂酸酰基转移酶（LPAAT），因此常规育种方法无法突破66.7%的理论极限含量，采用转基因、基因编辑等生物技术手段是必然选择。遗传修饰材料再辅以分子标记辅助选择、小孢子培养、人工杂交等技术可以快速实现目标基因的聚合和纯合，从而大大加速育种进程。

（2）遗传转化受体材料的选择。众多研究表明，FAE1对种子芥酸含量具有加性和显性效应，单个FAE1转基因贡献的芥酸含量在1%~30%之间。含油量高及基础芥酸含量高的受体材料，往往具有对芥酸合成有利的基因型（主基因+修饰基因），加上转入的FAE1作用，可以大大提升对“源”（C18∶1）的转化效率。目前，以油菜和海甘蓝为受体材料的遗传转化技术体系已相当成熟，因此高芥酸油菜和海甘蓝是理想的遗传转化受体材料，但应注意特殊基因型受体材料的遗传转化体系的优化。

（3）靶标基因的选择与载体构建策略。已有研究表明，种子中芥酸含量主要取决于FAE1、FAD2和LPAAT 3个基因的协同作用，它们涉及芥酸合成与储存的“源”、“流”和“库”三个环节，因此，这3个基因是芥酸基因工程的主要靶标。针对这3个基因，理想的高芥酸材料基因型应该是FAE1 FAE1/fad2 fad2/LPAAT LPAAT。芥酸高合成能力的FAE1可实现油酸“源”的高效转化；FAD2的失活（fad2）可以阻断油酸“源”向多不饱和方向转化，增加其向碳链延伸方向转化的底物量，再结合高活性、多拷贝FAE1可实现“引流”和“扩流”效果；外源LPAAT负责芥酸入“库”，将游离芥酰-CoA导入到TAG的sn-2位。表达载体启动子应均为种子特异启动子，FAE1启动子要优于napin和CaMV 35SP。3个基因可以构建在一个表达载体中，也可以分开构建、转化然后再通过杂交而聚合，但后者后期筛选、鉴定工作量较大。以fad2fad2基因型高含油量高芥酸材料为受体，再构建FAE1+LPAAT共表达载体进行转化较为可行。

（4）FAE1基因的选择。实现超高芥酸的3个目标基因当中，FAE1的选择可塑性最大。目前并不清楚决定FAE1芥酸合成能力的最佳一级结构，这也是本研究的出发点和初衷，筛选自然界中存在的芥酸高合成能力的FAE1。本研究克隆的12个正常编码的FAE1当中，CaFAE1-3对C20∶1的转化率可达95.39%，若再配合一个对C18∶1高转化率的FAE1，则可显著提高芥酸的合成量。此外，还可以利用点突变、基因改组（Gene shuffling）等技术人为促进FAE1的进化，筛选获得芥酸合成能力进一步提高的FAE1用于遗传转化。因此，要实现超高芥酸就应选择具有高合成能力的FAE1基因。

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