摘要
杂种优势利用是显著提高作物产量的有效途径之一，其中不育系的创制与利用，对作物杂交种的选育及生产起着至关重要的作用。基于细胞核雄性不育基因的作物杂交育种技术与传统杂交育种技术相比，具有制种安全、组合自由、杂交种育性稳定等优点，已在玉米、水稻等作物中广泛应用，这为大豆杂种优势利用提供了新思路。前期在大豆中图位克隆了1个编码R2R3-MYB转录因子的细胞核雄性不育基因MS6，本研究在此基础上，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术，设计两个基因编辑靶点，在大豆品种Williams82中对MS6基因进行敲除；进一步通过对转基因后代植株的表型观察、花粉及育性鉴定、基因敲除位点分析，验证MS6基因调控大豆花粉形成及雄性育性的功能，最终获得稳定遗传的大豆ms6核不育新种质。这为进一步建立基于MS6基因的大豆第3代杂交育种技术系统，实现强优势杂交种的高效创制，提供了理论和技术参考。
杂种优势是指遗传基础有差异的亲本杂交生成的杂合子在生长势、生物量、抗逆性和适应性等方面优于亲本的现
基于细胞核雄性不育基因的杂交育种技术，由于拓宽了亲本的选择范围，且不受环境条件制约，作为作物杂种优势利用的新途径，在玉
前期通过构建高代回交群体、BSA测序及SSR分子标记分析，将大豆核不育基因MS6定位于13号染色体的SSR标记BARCSOYSSR_13_0257和BARCSOYSSR_13_0259之间的255 kb区域内，通过编码序列比对分析，推断Glyma.13G066600为大豆MS6候选基
大豆材料Williams 82、Nuclean Plant Genomic DNA Kit试剂盒、pEASY-T1 Cloning Kit试剂盒、SanPrep柱式质粒DNA小量抽提试剂盒、大肠杆菌DH5α、农杆菌EHA101、Cas9载体pYLCRISPR/Cas9P35S-B、gRNA载体pYLsgRNA-AtU3b、pYLsgRNA-AtU6-1、Bsa I、T4 DNA ligase、卡那霉素等由吉林省农业科学院杂交大豆研究团队保存和提供。
利用在线软件MMEJ-KO（http：//skl.scau.edu.cn/mmejko/），进行靶位点的选择，筛选出两个打靶效率高的靶点，分别位于MS6基因的第一和第二外显子，命名为ms-T1和ms-T2。ms-T1的snRNA启动子选用AtU3b，ms-T2的snRNA启动子选用AtU6-1。同时设计启动子接头的两对引物，引物分别命名为MS6T1和MS6T2（
引物名称 Primer name | 引物序列（5'-3'） Primer sequence （5'-3'） |
|---|---|
|
MS6T1-F MS6T1-R MS6T2-F MS6T2-R MS6-1-F MS6-1-R U-F gRNA-R Pps-GGL Pgs-GGR Pgs-GG2-R Pps-GG2-F |
GTCACTTGCCTATGTAGCCAATCA AAACTGATTGGCTACATAGGCAAG ATTGATCTAATTATTAACCTTCA AAACTGAAGGTTAATAATTAGAT CTCAGTCCTTCTCTTGCATT GCTTCCTATGGCTCCATGA CTCCGTTTTACCTGTGGAATCG CGGAGGAAAATTCCATCCAC TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC AGCGTGGGTCTCGTCAGGGTCCATCCACTCCAAGCTC TTCAGAGGTCTCTCTGACACTGGAATCGGCAGCAAAGG |
参照杨静
MS6基因全长1814 bp，cDNA全长1125 bp，包含3个外显子和2个内含子，在第一外显子165 bp、第二外显子418 bp处设计两个靶点，每个靶点23 bp，靶点位置及gRNA序列如
图1 MS6基因结构及靶点位置
Fig.1 Gene structure and target location of MS6
黑框表示下方图片在上方图片中的位置
The black box indicates the position of the lower picture in the upper picture
利用农杆菌介导的子叶节遗传转化方法，将MS6基因编辑载体转化至大豆材料Williams 82。T0代植株叶片进行草丁膦涂抹，阳性植株与野生型植株无明显差别，其他涂抹草丁膦的株系叶片出现泛黄、萎蔫直至脱落。由此初步判断，对草丁膦无明显反应植株CRISPR/Cas9-MS6编辑载体转入成功，共获得4株独立的T0代阳性转化株系。利用引物MS6-1对T0代阳性植株进行PCR扩增及扩增产物的测序分析发现，4株阳性材料的测序峰图均在两个靶点内出现套峰，表明上述株系的编辑位点为杂合型。另外，对上述材料进行花粉染色观察发现，阳性植株均可检测到花粉粒，并可染成黑色或深褐色，与野生型转化受体Williams 82一致，且成熟期均可正常结实。
对4株T0代阳性株系后代开展进一步分析，每个株系种植10株T1代植株，在盛花期取成熟花苞进行花粉检测。通过观察发现，野生型及部分T1代单株花药释放的花粉粒呈圆形，可被染成黑色或深褐色；而每个株系中均有植株的花药在显微镜的视野中没有观察到花粉粒存在，无法进行染色，这与前期用于基因定位的ms6突变体花粉育性鉴定表型一致（
图2 不同类型植株花粉检测结果
Fig.2 Pollen detection results of different types of plants
A：野生型植株；B：T1代无花粉型植株；C：用于基因定位的ms6突变体
A： Wild type plants； B： T1 pollen-free plants； C： ms6 mutant for gene mapping
进一步对成熟期的野生型植株和T1代不育突变体植株进行农艺性状观察发现，突变体与野生型相比，表现出非常明显的不育特征，其在植株高度上略有增加，茎秆持绿，无法形成正常的豆荚；而野生型则茎秆干枯，正常成熟结荚，二者植株表型对比如
图3 T1代不育突变体植株与野生型植株成熟期表型对比结果
Fig.3 Comparison of mature period phenotype between T1 sterile mutant and wild type plants
A：T1代不育突变体植株；B：野生型植株
A： T1 sterile mutant plants； B： Wild type plants
分别在4个T0代株行分离出的T1代无花粉型植株中，各选取3株T1代不育植株，提取叶片基因组DNA，利用引物MS6-1进行PCR扩增及产物测序。测序结果通过Vector NTI 8.0软件进行分析。在MS6纯合编辑T1代植株中分别检测到两种突变体ms6cr-1、ms6cr-2，全部为片段缺失。其中检测到ms6cr-1在靶点ms-T1位置发生了碱基A缺失，同时在靶点ms-T2位置发生了碱基T缺失。ms6cr-2在靶点ms-T1位置发生了5个碱基缺失，同时在靶点ms-T2位置发生了碱基T缺失（
图4 T1代突变植株碱基突变位点
Fig.4 Base mutation sites of T1 generation mutant plants
-为ms6cr-1、ms6cr-2突变体的碱基敲除位点
- is the knockout site in the ms6cr-1、ms6cr-2 mutant
图5 野生型和突变型蛋白序列对比结果
Fig.5 Comparison of wild type and mutant protein sequences
黄色部分为R2-MYB结构域，绿色部分为R3-MYB结构域，ms6红色方框内为第76位氨基酸由亮氨酸（Leu）突变为组氨酸（His），ms6cr-1红色方框内为第61位的氨基酸发生变化，ms6cr-2红色框方内为第60位的氨基酸发生变化
The yellow part is R2-MYB domain， the green part is R3-MYB domain， the 76th amino acid in the red box of ms6 changes from leucine （Leu） to histidine （His）， the 61st amino acid in the red box of ms6cr-1 changes， and the 60th amino acid in the red box of ms6cr-2 changes
传统的获得不育系的方法主要依靠回交选育，一般要经过5~6代左右的回交。虽然可以利用不育基因突变位点开发分子标记进行有针对性的辅助选
第3代作物杂交育种系统的研发成功，不仅解决了核不育系扩繁的问题，实现了利用核不育系进行杂交种生产的可能性，同时也拓宽了亲本的选择范围，且不受环境条件制约。这其中败育彻底且不育稳定的不育系，对于该系统的有效应用至关重要。大豆核不育基因MS6编码1个R2R3-MYB转录因子，前期研究认为其R2区域76位（L76H）的组氨酸残基取代亮氨酸引起的错义突变导致大豆雄性不
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