辣椒果色全基因组关联分析

张小微; 陈小翠; 陈仕泽; 覃成; 杨红; 唐相群; 邱化荣; 罗希榕; ZHANG Xiao-wei; CHEN Xiao-cui; CHEN Shi-ze; QIN Cheng; YANG Hong; TANG Xiang-qun; QIU Hua-rong; LUO Xi-rong

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辣椒果色全基因组关联分析 PDF

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罗希榕 ^1,3

1. 遵义市农业科学研究院，贵州遵义 563100； 2. 西南科技大学环境与资源学院，四川绵阳 621010； 3. 遵义职业技术学院现代农业系，贵州遵义 563000； 4. 贵州省农业科学院辣椒研究所，贵阳 550025

最近更新：2023-04-27

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20221010006

摘要

辣椒果色作为辣椒重要的农艺性状直接影响辣椒商品价值，其遗传机制的解析可对辣椒果实外观品质改良提供指导。本研究利用全基因组关联分析（GWAS）挖掘辣椒果色显著关联的SΝP位点及候选基因。以195份一年生辣椒构成的自然群体为试验材料，分别在2020年和2021年调查辣椒果色（青果色和熟果色）性状，通过DNA测序和SNP变异检测，质控得到的高质量SNP位点用于GWAS分析。结果表明：两年间辣椒果色性状表型完全一致，性状遗传稳定，其中青果色为绿的分布频率最高，达89.74%，熟果色为鲜红的分布频率最高，达60.51%；GWAS分析后共筛选出8个与辣椒果色相关的SNPs，这些位点分布在0、1、3、4号等4条染色体上；对显著SNP位点进行LD block分析并筛选候选基因，共注释到31个基因，预测呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（Capana01g000138）、类异黄酮2′-羟化酶（Capana04g000616、Capana04g000617、Capana04g000618、Capana04g000619、Capana04g000620、Capana04g000621和Capana04g000622）和F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y（Capana04g000624）可能与辣椒果色相关。这些结果将为开展辣椒果色相关分子辅助育种提供参考依据。

关键词

辣椒; 果色; SNP; 全基因组关联分析; 候选基因

辣椒（Capsicum annuum L.）是茄科（Solanaceae）辣椒属（Capsicum）一年生或多年生草本植物^［

1］。辣椒广泛种植于世界范围内，具有极高的经济价值和营养价值，目前为我国第二大蔬菜作物^{［参考文献 2

百度学术}2］。果色作为辣椒最主要的经济性状之一，直接影响着购买者的选择。辣椒果色是由辣椒果实中的叶绿素类、类胡萝卜素类、花青素类和类黄酮类等色素物质的相对含量所决定的^{［参考文献 3

百度学术}3］。丰富多彩的果实颜色使得辣椒成为果色相关研究的一种模式植物^{［参考文献 4

百度学术}4］。目前，关于辣椒果色相关基因的研究有一些报道。CCS基因编码的辣椒红素/辣椒玉红素合成酶是催化合成辣椒红素和辣椒玉红素形成的最后一个酶，控制着红色果实的形成^{［参考文献 5

百度学术}5］。CaSGR基因使得辣椒果实中叶绿素随着果实的成熟逐渐降解^{［参考文献 6

百度学术}6］。PSY基因编码类胡萝卜素生物合成途径中的限速酶——八氢番茄红素合成酶，决定果实为橙色或红色^{［参考文献 7

百度学术}7］。由此可见，果色性状关键基因的挖掘及遗传机理的研究对于提高辣椒的遗传改良具有重要的意义。

近年来，随着二代测序技术的快速发展，全基因组关联分析（GWAS，genome-wide association study）作为一种新兴技术，利用群体中广泛的遗传多样性，利用全基因组高密度的SNP标记挖掘基因变异位点，以简单易行、高通量等优点成为基因组学研究的热点^［

8］。目前，GWAS在拟南芥、玉米、水稻、小麦等作物遗传研究应用较多，在辣椒中的研究也相继报道^{［参考文献 9

百度学术}9］。Nimmakayala等^{［参考文献 10-11}10-11］通过辣椒GWAS分析，分别得到16和36个SNP位点与辣椒单果重和花梗长度显著相关。Han等^{［参考文献 12

百度学术}12］对208份辣椒GWAS分析，定位到与辣椒素含量显著关联的99个SNP位点，并在3号和6号染色体上筛选出5个候选基因。赵红^{［参考文献 13

百度学术}13］对312份一年生辣椒的48个主要性状进行GWAS分析，20个性状定位到94个显著关联的SNPs。

SNP标记在基因组中数量多、分布广、多态性丰富、定位精度高，是目前最具潜力的分子标记^［

14］。本研究以195份一年生辣椒构成的自然群体为材料，结合两年辣椒果色性状调查结果进行DNA测序，对质控得到的高质量SNP位点进行全基因组关联分析，并发掘辣椒果色性状的遗传位点，筛选相关候选基因，为相关基因克隆和分子标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料与田间试验

195份供试材料为辣椒自然群体，来自于收集的贵州地方种质资源及相关改良自交系，由贵州省农业科学院辣椒课题组提供（表1）。供试材料分别于2020年和2021年种植于贵州省遵义市红花岗区新蒲镇贵州省农业科学院辣椒所科研基地，海拔840 m（27°43′28″N，107°2′54″E）。采用随机区组试验设计，3次重复，每个材料2行，每行15株，2粒播，行距60 cm，株距25 cm。辣椒栽培按照常规栽培管理方式进行。在青果期和熟果期分别调查辣椒青果色（Ifc， immature fruit color）和熟果色（Mfc， mature fruit color）2个性状，采用Excel 2019对数据进行处理和统计分析。在辣椒初果期，取195份辣椒材料的幼嫩叶片各100 mg，液氮速冻，-80 ℃保存备用。

表1 辣椒供试材料

Table 1 Test materials of pepper

名称 Name	类型（青果/熟果） Type （immature fruit/mature fruit）	种质类型 Germplasm type	来源 Source	名称 Name	类型（青果/熟果） Type （immature fruit/mature fruit）	种质类型 Germplasm type	来源 Source
cp-1	浅绿/深红	地方品种	凤冈县	cp-58	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-2	白/橘红	地方品种	凤冈县	cp-60	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-3	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-61	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-4	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-62	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-5	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-63	浅绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当
cp-6	绿/鲜红	地方品种	正安县	cp-64	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当
cp-7	绿/鲜红	地方品种	正安县	cp-65	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当
cp-8	白/橘红	地方品种	凤冈县	cp-66	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当
cp-9	绿/深红	地方品种	凤冈县	cp-67	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-10	浅绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-68	绿/深红	地方品种	贵阳乌当
cp-11	绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-69	绿/鲜红	地方品种	道真县
cp-12	绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-70	绿/深红	地方品种	道真县
cp-13	绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-71	绿/鲜红	地方品种	道真县
cp-14	浅绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-72	绿/鲜红	地方品种	道真县
cp-15	绿/鲜红	地方品种	凤冈县	cp-73	绿/深红	地方品种	道真县
cp-16	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-74	绿/深红	地方品种	道真县
cp-17	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-75	绿/鲜红	地方品种	道真县
cp-19	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-76	绿/深红	地方品种	道真县
cp-20	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-77	绿/深红	地方品种	道真县
cp-21	紫/橘红	地方品种	遵义新蒲	cp-78	绿/深红	地方品种	道真县
cp-22	绿/鲜红	地方品种	务川县	cp-79	绿/深红	地方品种	道真县
cp-23	绿/鲜红	地方品种	务川县	cp-80	紫黑/深红	地方品种	道真县
cp-24	绿/紫红	地方品种	务川县	cp-81	绿/深红	地方品种	道真县
cp-25	紫/橘红	地方品种	务川县	cp-82	绿/鲜红	地方品种	道真县
cp-26	绿/鲜红	地方品种	三都县	cp-83	绿/鲜红	改良自交系	湄潭县
cp-27	绿/深红	地方品种	三都县	cp-84	绿/深红	改良自交系	湄潭县
cp-28	浅绿/鲜红	地方品种	三都县	cp-85	绿/深红	改良自交系	湄潭县
cp-29	绿/棕红	地方品种	三都县	cp-86	绿/鲜红	改良自交系	湄潭县
cp-30	绿/橘红	地方品种	三都县	cp-87	浅绿/鲜红	改良自交系	湄潭县
cp-31	白/黄	地方品种	遵义新蒲	cp-88	白/鲜红	改良自交系	余庆县
cp-32	白/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-89	绿/深红	改良自交系	余庆县
cp-33	白/橘红	地方品种	遵义新蒲	cp-90	绿/鲜红	改良自交系	余庆县
cp-34	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-91	绿/深红	改良自交系	余庆县
cp-35	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-92	白/鲜红	地方品种	大方县
cp-36	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-93	绿/深红	地方品种	大方县
cp-37	白/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-94	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-38	绿/棕红	地方品种	遵义新蒲	cp-95	绿/深红	地方品种	大方县
cp-39	绿/鲜红	地方品种	金沙县	cp-96	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-40	绿/鲜红	地方品种	金沙县	cp-97	绿/深红	地方品种	大方县
cp-41	绿/鲜红	地方品种	金沙县	cp-98	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-42	绿/深红	地方品种	金沙县	cp-99	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-43	绿/深红	地方品种	金沙县	cp-100	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-44	绿/鲜红	地方品种	金沙县	cp-101	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-45	深绿/鲜红	地方品种	金沙县	cp-102	绿/深红	地方品种	大方县
cp-46	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-103	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-47	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-104	绿/鲜红	地方品种	大方县
cp-48	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-105	绿/深红	地方品种	大方县
cp-49	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当	cp-106	绿/鲜红	地方品种	桐梓县
cp-50	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-107	绿/鲜红	地方品种	桐梓县
cp-51	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当	cp-108	绿/鲜红	地方品种	桐梓县
cp-52	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-109	绿/深红	地方品种	桐梓县
cp-53	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当	cp-110	绿/深红	地方品种	桐梓县
cp-54	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当	cp-111	绿/鲜红	地方品种	桐梓县
cp-55	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-112	绿/深红	地方品种	桐梓县
cp-56	绿/鲜红	地方品种	贵阳乌当	cp-113	绿/深红	地方品种	桐梓县
cp-57	绿/深红	地方品种	贵阳乌当	cp-114	绿/鲜红	地方品种	桐梓县
cp-115	绿/深红	地方品种	桐梓县	cp-159	绿/鲜红	地方品种	正安县
cp-116	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-160	绿/鲜红	地方品种	正安县
cp-117	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-161	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-119	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-162	绿/深红	地方品种	金沙县
cp-121	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-163	绿/深红	地方品种	金沙县
cp-122	绿/深红	地方品种	桐梓县	cp-164	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-123	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-165	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-124	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-166	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-125	绿/深红	地方品种	桐梓县	cp-167	绿/深红	地方品种	金沙县
cp-126	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-168	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-127	绿/鲜红	地方品种	桐梓县	cp-169	绿/鲜红	地方品种	金沙县
cp-128	绿/深红	地方品种	桐梓县	cp-170	深绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-129	绿/鲜红	地方品种	凤岗县	cp-171	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-130	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-172	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-131	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-173	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-132	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-174	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-133	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-175	深绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲
cp-134	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-176	绿/深红	地方品种	凤冈县
cp-135	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-177	绿/鲜红	地方品种	凤冈县
cp-136	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-178	绿/鲜红	地方品种	凤冈县
cp-137	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-179	绿/棕红	地方品种	凤冈县
cp-138	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-180	绿/棕红	改良自交系	绥阳县
cp-139	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-181	绿/棕红	改良自交系	绥阳县
cp-140	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-182	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县
cp-141	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-183	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县
cp-142	绿/深红	地方品种	遵义新蒲	cp-184	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县
cp-143	绿/鲜红	地方品种	遵义新蒲	cp-185	绿/棕红	改良自交系	绥阳县
cp-144	绿/黄	地方品种	遵义新蒲	cp-187	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县
cp-145	绿/鲜红	改良自交系	遵义播州	cp-188	绿/深红	改良自交系	绥阳县
cp-146	绿/鲜红	改良自交系	遵义播州	cp-189	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县
cp-147	绿/深红	改良自交系	遵义播州	cp-190	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-148	绿/鲜红	改良自交系	遵义播州	cp-191	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-149	绿/鲜红	改良自交系	遵义播州	cp-192	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-150	绿/深红	改良自交系	绥阳县	cp-193	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-151	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县	cp-194	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-152	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县	cp-195	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-153	绿/鲜红	改良自交系	绥阳县	cp-196	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-154	绿/深红	地方品种	正安县	cp-197	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-155	绿/鲜红	地方品种	正安县	cp-198	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-156	绿/鲜红	地方品种	正安县	cp-199	绿/鲜红	地方品种	安顺西秀
cp-157	绿/深红	地方品种	正安县	cp-200	绿/深红	地方品种	安顺西秀
cp-158	绿/鲜红	地方品种	正安县

1.2 基因组测序、比对和SNP 检测

辣椒幼嫩叶片（-80 ℃保存）液氮研磨后用CTAB法提取基因组DNA。检测DNA浓度和质量（浓度≥20 ng/µL，体积≥ 30 µL），以确保DNA样品符合测序反应的要求。对Illumina HiSeq测序平台双端测序下机原始数据预处理，平均测序深度为12.31×，过滤得到高质量测序序列。将测序结果与辣椒参考基因组Zunla-1（http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp， version 2.0）进行比对，检测SNPs，过滤获得高质量SNP进行后续分析。

1.3 全基因组关联分析

过滤（位点完整度integrity > 0.8，次要等位基因频率MAF > 0.05）、筛选得到高质量SNP标记，分别用EMMAX、FaST-LMM和GEMMA三款软件模型进行全基因组关联分析（GWAS）。以-log10（P）>6为显著性筛选阈值，筛选得到显著的SNPs。将关联到的结果用R软件绘制曼哈顿图和Q-Q图进行展示。

1.4 候选基因挖掘

利用全基因组关联分析后得到的强关联SNP位点，基于强关联位点在基因组的物理位置计算包含此位点的LD block的区域，在此区域内基于辣椒参考基因组Zunla-1（http：//peppersequence.genomics.cn/page/species/index.jsp， version 2.0）注释信息，分析预测候选基因。

2 结果与分析

2.1 辣椒果色性状统计

2020年和2021年分别对辣椒果色性状进行表型统计（表2）。本研究测量了青果色（Ifc）和熟果色（Mfc）2个性状。结果显示，辣椒果色性状在2020年和2021年表现完全一致，说明选择的性状遗传比较稳定，不易受环境因素影响，调查数据可靠。青果色为3-绿的分布频率最高，达89.74%。熟果色为2-鲜红的分布频率最高，达60.51%。

表2 辣椒果色性状表型统计

Table 2 Phenotypic statistics of fruit color traits in pepper

性状 Trait	性状描述级别 Trait description level	年份 Year	样本数 Samples	分布频率（%） Frequency distribution
青果色 Ifc	1-白	2020	8	4.10
		2021	8	4.10
	2-浅绿	2020	6	3.10
		2021	6	3.10
	3-绿	2020	175	89.74
		2021	175	89.74
	4-深绿	2020	3	1.53
		2021	3	1.53
	5-紫	2020	2	1.02
		2021	2	1.02
	6-紫黑	2020	1	0.51
		2021	1	0.51
熟果色 Mfc	1-橘红	2020	6	3.08
		2021	6	3.08
	2-鲜红	2020	118	60.51
		2021	118	60.51
	3-深红	2020	62	31.79
		2021	62	31.79
	4-棕红	2020	6	3.08
		2021	6	3.08
	5-紫红	2020	1	0.51
		2021	1	0.51
	6-黄	2020	2	1.03
		2021	2	1.03

Ifc：Immature fruit color； Mfc：Mature fruit color； The same as below

2.2 全基因组关联分析

为提高分析的可靠性，利用EMMAX、FaST-LMM和GEMMA软件模型对195份辣椒材料的果色性状表现型进行全基因组关联分析（GWAS）。以-log10（P）>6为显著性筛选阈值，利用3款软件分别对2020年和2021年检测到显著的SNPs位点进行统计（表3）。统计结果发现，不同年份辣椒果色在同一软件模型分析下，关联到相同的SNP位点。同一年份辣椒材料在不同模型分析下关联到的SNP位点数不同，其中EMMAX模型关联到的SNP位点数最少，且关联到的所有SNP位点在另外两款软件模型中均有关联到，表明数据可靠。

表3 辣椒果色显著关联SNP位点统计

Table 3 Statistics of SNP locus significantly associated with fruit color in pepper

性状 Trait	年份 Year	显著关联SNP数 Significant SNP number
性状 Trait	年份 Year	EMMAX	FaST-LMM	GEMMA
青果色 Ifc	2020	6	15	19
	2021	6	15	19
熟果色 Mfc	2020	2	3	3
	2021	2	3	3

利用EMMAX、FaST-LMM和GEMMA软件模型共同关联得到的辣椒果色性状显著关联SNP位点见表4。GWAS分析后共筛选出8个与辣椒果色相关的SNPs，其中青果色（Ifc）6个、熟果色（Mfc）2个。这些位点分布在0、1、3、4号等4条染色体上。

表4 辣椒果色显著关联SNP位点

Table 4 SNP locus significantly associated with fruit color in pepper

性状 Trait	SNP数 SNP number	染色体 Chr.	位置 Position	P值 P value	-log10（P）值 -log10（P）value	年份 Year
性状 Trait	SNP数 SNP number	染色体 Chr.	位置 Position	P值 P value	-log10（P）值 -log10（P）value	2020	2021
青果色 Ifc	6	01	2007364	5.3221e-07	6.27	√	√
		01	2007559	4.3358e-07	6.36	√	√
		04	9958667	1.1605e-07	6.94	√	√
		03	232836190	2.5503e-07	6.59	√	√
		03	233013134	1.1995e-07	6.92	√	√
		03	233013160	1.1995e-07	6.92	√	√
熟果色 Mfc	2	00	243497132	4.6031e-07	6.34	√	√
		00	243497365	4.7084e-07	6.33	√	√

√：能够在该年份检测到该SNP位点

√： The SNP site can be detected in this year

利用EMMAX软件模型分析得到辣椒果色的GWAS正态化结果曼哈顿图和Q-Q图（图1）。曼哈顿图显示了GWAS的优势位点，Q-Q图展示信号与原假设之间的偏差。通过Q-Q图观察发现，观测值与期望值基本在一条斜线上，每个性状Q-Q图结果仅在尾部区域稍微偏离P值分布，表明EMMAX模型不存在群体分层现象（λ接近1），SNP关联分析的假设与统计分布没有偏离，模型适合该资源群体。曼哈顿图中以-log10（P）>6为显著性筛选阈值。结果显示，2020年和2021年青果色共同检测到6个显著SNP位点（图1A、B）；2020年和2021年熟果色共同检测到2个显著SNP位点（图1C、D）。

图1 辣椒果色性状的GWAS曼哈顿和Q-Q图

Fig.1 GWAS Manhattan and Q-Q plot of fruit color traits in pepper

A：2020年青果色（Ifc）；B：2021年青果色（Ifc）；C：2020年熟果色（Mfc）；D：2021年熟果色（Mfc）。曼哈顿图中，绿色线代表-log10（P）=5；红色线代表-log10（P）=6；紫色线代表-log10（P）=7

A： Immature fruit color（Ifc）in 2020； B： Immature fruit color（Ifc）in 2021； C： Mature fruit color（Mfc）in 2020； D： Mature fruit color（Mfc）in 2021. In Manhattan plot， the green line represents -log10（P）=5； the red line represents - log10（P）=6； the purple line represents - log10（P）=7

2.3 候选基因挖掘

为进一步确定辣椒果色相关候选基因，对关联得到的8个显著SNP位点进行LD block分析。取位点前后100 kb进行LD block绘图（图2）。结果显示，0号染色体243.479~243.479 Mb（共309.00 bp）位于1个LD block区域内（图2A）；1号染色体1.959~2.008 Mb（共48.76 kb）位于1 个LD block区域内（图2B）；3号染色体232.763~232.836 Mb（共73.17 kb）位于1个LD block区域内（图2C）；4号染色体9.866~10.027 Mb（共161.19 kb）位于1 个LD block 区域内（图2D）。

图2 显著SNP位点LD block分析

Fig.2 LD block analysis of significant SNP sites

A：0号染色体； B：1号染色体；C：3号染色体；D：4号染色体

A： Chr00； B： Chr01； C： Chr03； D： Chr04

对关联到的SNPs进行候选基因挖掘及功能注释（表5）。本次关联分析共发现 31个基因与辣椒果色性状变化相关，其中青果色30个基因，熟果色1个基因。对其进行功能分类，其中能源生产和转换2个；细胞内运输、分泌和囊泡转运1个；翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣3个；次级代谢物生物合成、运输和分解代谢7个；染色质结构和动力学1个；细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割1个；翻译、核糖体结构和生物发生1个；碳水化合物运输和代谢2个；仅一般功能预测5个；未知8个。挖掘到呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（Capana01g000138）、类异黄酮2′-羟化酶（Capana04g000616、Capana04g000617、 Capana04g000618、Capana04g000619、Capana04g000620、Capana04g000621和Capana04g000622）和F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y（Capana04g000624）可能与辣椒果色相关。

表5 候选基因及注释信息

Table 5 Candidate genes and annotation information

性状 Trait	基因数 Gene number	基因ID Gene ID	功能分类 Functional classification	功能注释 Function annotation
青果色 Ifc	30	Capana01g000131	能源生产和转换	预测：ADP、ATP载体蛋白3，类线粒体［马铃薯］
		Capana01g000132	未知	预测：类TPX2蛋白异构体X5 ［番茄］
		Capana01g000135	未知	预测：类牙本质涎磷蛋白异构体X1 ［马铃薯］
		Capana01g000136	仅一般功能预测	预测：未表征蛋白LOC104221795 ［烟草］
		Capana01g000137	未知	预测：类LURP-1相关的17异构体X2 ［马铃薯］
		Capana01g000138	未知	呼吸爆发氧化酶同源蛋白A ［马铃薯］
		Capana01g000139	未知	预测：未表征蛋白LOC102578735 ［马铃薯］
		Capana01g000140	未知	预测：未表征蛋白LOC104234439 ［烟草］
		Capana01g000141	仅一般功能预测	预测：可能的类膜相关激酶调节因子2 ［马铃薯］
		Capana01g000142	仅一般功能预测	预测：未表征蛋白LOC104100317 ［茸毛烟草］
		Capana01g000143	仅一般功能预测	预测：未表征蛋白LOC104100317 ［茸毛烟草］
		Capana01g000144	细胞内运输、分泌和囊泡转运	预测：类网状蛋白B4 ［番茄］
		Capana01g000145	翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣	预测：含ATP酶家族AAA结构域的类蛋白1-A ［烟草］
		Capana01g000146	翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣	预测：类烦躁蛋白1 ［马铃薯］
		Capana04g000615	未知	应激诱导蛋白6 ［辣椒］
		Capana04g000616	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［马铃薯］
		Capana04g000617	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［烟草］
		Capana04g000618	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［烟草］
		Capana04g000619	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［烟草］
		Capana04g000620	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［烟草］
		Capana04g000621	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［烟草］
		Capana04g000622	次级代谢物生物合成、运输和分解代谢	预测：类异黄酮2′-羟化酶［马铃薯］
		Capana04g000623	未知	预测：未表征蛋白LOC104231847，部分［烟草］
		Capana04g000624	染色质结构和动力学	预测：F-box/WD重复类蛋白TBL1Y ［马铃薯］
		Capana04g000625	细胞周期控制、细胞分裂、染色体分割	预测：假定的细胞周期蛋白A3-1 ［番茄］
		Capana03g003647	翻译、核糖体结构和生物发生	预测：60S核糖体蛋白L18-2 ［茸毛烟草］
		Capana03g003648	仅一般功能预测	预测：类双功能环氧化物水解酶2 ［马铃薯］
		Capana03g003649	翻译后修饰、蛋白质周转、伴侣	预测：环状H2类指蛋白ATL2 ［番茄］
		Capana03g003650	碳水化合物运输和代谢	预测：可能的果胶酯酶/果胶酯酶抑制剂41 ［茸毛烟草］
		Capana03g003653	碳水化合物运输和代谢	预测：类果胶酯酶［茸毛烟草］
熟果色 Mfc	1	Capana00g000414	能源生产和转换	ATP合酶CF1亚基（叶绿体）［辣椒］

3 讨论

辣椒作为世界重要经济作物之一，具有丰富的遗传多样性。辣椒果色性状直接影响辣椒商品价值，不同辣椒品种之间果色性状差异很大。本研究以195份一年生辣椒构成的自然群体为试验材料，分别在2020年和2021年调查辣椒果色（青果色和熟果色）性状，调查数据显示，两年间辣椒果色性状表型完全一致，性状遗传比较稳定，遗传性丰富，可以用于以自然群体为研究对象，以遗传多样性丰富、目标性状变异明显的群体的关联分析。

本研究利用两年（2020和2021）数据，采用EMMAX、FaST-LMM和GEMMA软件模型共同关联得到辣椒果色性状（青果色和熟果色）相关的SNP位点共8个，说明这些位点可靠性较高。本研究青果色关联的显著SNP在1、3、4号染色体上，熟果色关联的显著SNP在0号染色体上。2019年Wu等^［

15］研究发现，分布在6号染色体上的16个SNP（49个基因）与辣椒成熟果实颜色（Mfc）相关，其中06_10060744、06_8776355和06_8769243与Mfc相关性最高。2022年Wu等^{［参考文献 16

百度学术}16］对辣椒未成熟果实颜色进行了全基因组关联分析，定位到10号染色体35.07 kb区域的Capana10g001710（CaPP2C35）编码序列的第313个碱基发生G-A替换，导致其编码的PP2C35蛋白的α-螺旋转变为β-折叠，预测其可能通过调节果皮中叶绿素含量的积累而参与辣椒浅绿色未成熟果实的形成。赵红^{［参考文献 13

百度学术}13］研究发现，青熟果颜色关联的SNP在0号染色体上。本研究结果与赵红研究相吻合。

植物呼吸爆发氧化酶同源蛋白（Rboh， respiratory burst oxidase homologue）又称NADPH氧化酶，是一类以胞质中的NADPH为电子供体，可以将氧催化生成ROS的多酶复合物^［

17］。氧化剂H₂O₂的产生与质膜NADPH氧化酶（PMRS的一个重要成分）有很大关系^{［参考文献 18

百度学术}18］。苯丙氨酸解氨酶（PAL， phenylalanineammonialyase）是植物合成花青素等次生代谢产物的关键酶类，H₂O₂作为植物信号分子通过PAL活性启动调节花青素等次生代谢产物的合成^{［参考文献 19

百度学术}19］。本研究预测呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（Capana01g000138）可能通过产生信号分子H₂O₂调节花青素合成来影响辣椒青果色，为控制辣椒青果色的关键基因。

异黄酮羟化酶是合成花青素的一类关键酶，异黄酮2′-羟化酶（I2′H， isoflavone 2′-hydroxylase），又称异黄酮2′-单加氧酶，是细胞色素P450（CYP450）家族成员之一，可参与异黄酮衍生物合成^［

20］。在辅因子的作用下，异黄酮经I2′H的催化，其2′-C部位被羟化产生2-羟基异黄酮，最终转化为黄酮类化合物参与植物花、果实、种子等颜色形成^{［参考文献 21

百度学术}21］。本研究预测类异黄酮2′-羟化酶（Capana04g000616、Capana04g000617、Capana04g000618、Capana04g000619、Capana04g000620、Capana04g000621和Capana04g000622）功能为次级代谢物生物合成、运输和分解代谢，可能通过参与辣椒青果色类黄酮合成来影响果实颜色的形成，初步推测为控制辣椒青果色的关键基因。

花色素苷是花青素糖基化衍生物的总称，广泛存在于植物的根、茎、叶、花、果实等器官中，是植物的重要性状，可以赋予植物颜色^［

22］。在花青素合成的途径中，转录因子发挥着关键的调控作用，其中，R2R3-MYB、bHLH和WD40三种类型的转录因子可以通过形成MBW复合体，共同与结构基因的启动子结合并诱导其表达，从而控制花青苷的合成^{［参考文献 23

百度学术}23］。Ben-Simhon等^{［参考文献 24

百度学术}24］在石榴（Punica granatum）中研究发现，PgWD40基因与bHLH转录因子（PgAn1）和MYB转录因子（PgAn2）相互作用，共同调控下游结构基因DFR和无色花青素双加氧酶（LDOX，leucoanthocyanidin dioxygenase）的表达。Jin等^{［参考文献 25

百度学术}25］研究表明，R2R3-MYB型转录因子PavMYB10.1与PavbH-LH和PavWD40蛋白相互作用，结合花青素生物合成基因PavANS和PavUFGT的启动子区域，影响樱桃（Prunus pseudocerasus）成熟期果皮的颜色。研究表明，WD40（WD—重复蛋白）等通过调控结构基因的表达来影响花青苷的合成积累^{［参考文献 26

百度学术}26］。本研究预测F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y（Capana04g000624）功能为染色质结构和动力学相关蛋白，可能通过调控结构基因的表达来影响花青苷的合成积累，进而影响辣椒青果色。

辣椒果色是辣椒育种中重要的农艺性状，今后可进一步对呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（Capana01g000138）、类异黄酮2′-羟化酶（Capana04g000616、Capana04g000617、Capana04g000618、Capana04g000619、Capana04g000620、Capana04g000621和Capana04g000622）和F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y（Capana04g000624）进行功能验证，针对呼吸爆发氧化酶同源蛋白A可能通过产生信号分子H₂O₂调节花青素合成来影响辣椒青果色，类异黄酮2′-羟化酶可能参与辣椒青果色类黄酮合成过程及F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y可能作为染色质结构和动力学相关蛋白，通过调控结构基因的表达来影响花青苷的合成积累来影响果色形成等进行深入研究，从而解析辣椒青果色的调控机制。

4 结论

本研究共检测到8个与辣椒果色性状稳定关联的SNP标记，共注释到31个基因，预测呼吸爆发氧化酶同源蛋白A（Capana01g000138）、类异黄酮2′-羟化酶（Capana04g000616、Capana04g000617、Capana04g000618、Capana04g000619、Capana04g000620、Capana04g000621和Capana04g000622）和F-box-like/WD重复类蛋白TBL1Y（Capana04g000624）可能与辣椒果色相关，可为后续开展辣椒果色相关分子辅助育种提供参考依据。

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