小麦籽粒相关性状全基因组关联分析

张志辉; 程宇坤; 任毅; 王睿; 董一帆; 耿洪伟; ZHANG Zhi-hui; CHENG Yu-kun; REN Yi; WANG Rui; Dong Yi-fan; GENG Hong-wei

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张志辉
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程宇坤
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任毅
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王睿
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董一帆
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耿洪伟
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新疆农业大学农学院/新疆农业大学优质专用麦类作物工程技术研究中心，乌鲁木齐 830052

最近更新：2023-06-13

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20221224001

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摘要

小麦籽粒大小和形态是决定产量的主要因素之一，挖掘籽粒大小和形态性状的关联位点，筛选相关候选基因对于提高小麦产量具有重要意义。本研究以国内外具有代表性的300份冬小麦自然群体为研究材料，对千粒重、粒长、粒宽、粒厚、籽粒长宽比、籽粒面积、籽粒周长、籽粒形状和籽粒饱满度等9个籽粒性状进行表型鉴定，利用小麦90 K SNP芯片进行基因型采集，通过混合线性模型（MLM+Q+K）对籽粒大小和形态性状进行全基因组关联分析。研究结果表明，小麦籽粒大小和形态性状表现出丰富的表型变异，变异系数范围3.80%~26.06%，广义遗传力在56.25%~91.98%之间。通过GWAS检测出66个与籽粒大小和形态相关的稳定关联位点（P≤0.001），分布在除3D、4D、5D外的18条染色体上，可解释3.74%~14.34%的表型变异。检测到37个与两个及以上籽粒性状关联的一因多效位点，其中3B染色体的BS00022512_51标记同时与4个籽粒性状（粒长、粒宽、粒厚和籽粒长宽比）关联，具有最大的表型贡献率（7.06%~14.34%），6D染色体的wsnp_Ex_c4480_8055475标记同时与除粒厚、籽粒形状和籽粒饱满度以外的6个籽粒性状关联，表型贡献率为3.81%~8.25%。将BS00022512_51和wsnp_Ex_c4480_8055475标记进行单倍型分析，发现位于6D染色体上的wsnp_Ex_c4480_8055475位点存在GC-Hap1、AT-Hap2和AC-Hap3三种单倍型，单倍型GC-Hap1为籽粒较大的高千粒重单倍型。3种单倍型的整体分布频率分别为65.58%、32.25%和2.17%，单倍型GC-Hap1在中国4个冬麦区品种（系）中被大量选育。对37个一因多效位点进行发掘，筛选到9个籽粒大小和形态性状相关的候选基因。

关键词

小麦; 籽粒大小和形态; 单倍型; GWAS; 候选基因

小麦（Triticum aestivum L.）是全球分布最广的粮食作物之一，以蛋白质含量高、口感好、品质优良著称^［

1］。随着世界经济的发展和人口的激增，到2050年小麦产量需提高约60%方能满足人们对粮食的需求^{［参考文献 2

百度学术}2］。籽粒性状能直接影响小麦的产量和品质，也是普通小麦在驯化过程中受到选择的基本性状之一^{［参考文献 3

百度学术}3］。小麦产量构成三要素中的粒重常用千粒重来表示，主要由籽粒大小（粒长、粒宽、粒厚）等基本要素反映^{［参考文献 4

百度学术}4］。不同小麦品种籽粒大小和粒重存在显著的遗传变异，籽粒大小决定着产量的高低，同时也影响幼苗活力的强弱^{［参考文献 5

百度学术}5］。籽粒的长宽厚不仅直接影响小麦产量，而且通过影响籽粒形态间接影响小麦品质，大粒、球形、质地均匀的籽粒深受农户和厂商的青睐，往往拥有更高的市场价值^{［参考文献 6-7}6-7］。因此，研究籽粒大小和形态相关性状对于培育高产优质小麦新品种具有重要意义。

标记辅助选择（MAS， marker-assisted selection）能从分子水平上快速准确地分析个体的遗传组成，其有效性取决于可用基因的数目和标记-性状的关联程度^［

8］。与传统育种相比，MAS可以直接通过基因选择加快育种效率，不受环境条件影响。籽粒大小和形态相关性状是复杂的数量性状，主要受遗传因素影响，同时也受到环境的制约^{［参考文献 9

百度学术}9］。以往对小麦籽粒大小和形态性状的研究多通过连锁分析检测相关QTL，如周小鸿等^{［参考文献 10

百度学术}10］以西藏半野生小麦Q1028和郑麦9023组成的RIL群体为研究材料，对3个年度环境的5个籽粒性状进行QTL定位，发现13个粒长、6个粒宽、2个长宽比、3个粒厚和9个籽粒大小的QTL，可解释4.64%~14.69%的表型变异。邹林翰等^{［参考文献 11

百度学术}11］以周8425B×小偃81衍生的含有102个家系的RIL群体为研究材料，对3个环境下的4个籽粒性状进行QTL定位，共检测出22个QTL位点，可解释4.77%~19.95%的表型变异，同时结合自然群体材料鉴定出两个与千粒重相关的单倍型优势类群。近年来，全基因组关联分析（GWAS， genome-wide association study）因不针对特定性状，省去了QTL作图群体构建时的费时费力，且多个世代的周期重组提供了广泛的变异，对复杂性状的捕捉具有更高的分辨能力^{［参考文献 12-13}12-13］，已被应用于许多作物的重要位点及基因的挖掘研究中^{［参考文献 14-16}14-16］。张芳等^{［参考文献 5

百度学术}5］利用50 K SNP芯片对121份在新疆种植的小麦品种（系）的千粒重、粒长、粒宽、籽粒周长、籽粒面积和籽粒长宽比进行了GWAS，在两个及以上环境中重复检测到29个SNP位点，这些位点分布在1A、1B、1D、2A、3B、5A、5D、6B、6D、7B和7D染色体上，可解释9.30%~22.70%的表型变异。Wang等^{［参考文献 17

百度学术}17］以198份小麦品种（系）为研究材料，利用35 K SNP芯片对6个环境下的5个籽粒性状进行全基因组关联分析，共鉴定出146个标记-性状关联（MTA，marker-trait association）位点，可解释表型变异的5.91%~15.02%，在发现的位点中有12个在多种环境中被鉴定到。Zhao等^{［参考文献 18

百度学术}18］以211份节节麦为研究材料，利用55 K SNP芯片对连续两年5个环境下的4个籽粒性状进行全基因组关联分析，基于BLUE值的关联分析鉴定出139个关联位点，可分别解释粒长、粒宽、籽粒周长、籽粒长宽比的表型变异率为5.86%~17.71%、6.83%~8.42%、5.99%~17.71%和5.80%~19.61%，并对26个稳定位点利用双尾t检验进行验证，鉴定出6个与籽粒相关的候选基因。

虽然已经报道了一些小麦籽粒大小和形态相关的QTL，但鉴于小麦基因组的规模庞大（约17 G）及复杂性，对籽粒大小和形态相关性状的分子调控机制的研究还是非常有限的，还需要进一步挖掘其调控基因及进行标记鉴定。本研究以国内外300份小麦品种（系）为研究材料，对小麦籽粒大小和形态相关性状进行全基因组关联分析，挖掘影响小麦籽粒大小和形态的稳定QTL位点，将挖掘到的与多性状显著关联的稳定主效QTL位点进行二次挖掘，寻找对籽粒性状有利的单倍型，并分析影响籽粒性状的单倍型在不同生态区的分布规律，同时根据基因注释筛选潜在候选基因，以期为小麦籽粒大小和形态的遗传改良和标记辅助选择提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料和田间试验

用于关联分析的试验材料为300份冬小麦品种（系）组成的自然群体。该群体包含65份国外引进品种（系），121份黄淮冬麦区的品种（系），51份北部冬麦区的品种（系），41份长江中下游冬麦区品种（系）和22份西南冬麦区品种（系），均具有较好的代表性。上述试验材料由中国农业科学院作物科学研究所小麦品质课题组夏先春研究员惠赠，所有材料均于2018-2019年和2019-2020年连续两个年度种植于新疆农业科学院玛纳斯综合试验站（44°17′N，86°15′E，海拔400 m），两个环境分别记为E1和E2。田间试验采用随机区组设计，设置3次重复，3行种植，行长2.0 m，行间距20.0 cm，播种量525万粒/hm²，人工点种，田间管理遵循当地小麦生产基本田间管理方式。

1.2 表型测定

小麦成熟时各品种（系）随机选择30个代表性穗进行人工脱粒，使用万深SC-G自动考种分析仪检测千粒重、粒长、粒宽、籽粒长宽比、籽粒面积和籽粒周长，每份材料选择不少于500粒；使用数显游标卡尺（精读为0.02 mm）测量粒厚。

参照《小麦种质资源描述规范和数据标准》^［

19］对籽粒形状进行籽粒清选后，随机抽取约100粒，采用目测法观察。根据观察结果并参照粒型模式图，确定种质籽粒的形状，籽粒形状评价参数为：1：长型；2：卵型；3：椭圆型；4：圆型。籽粒饱满度按照籽粒清选后，随机选取100粒左右，采用目测法观察。根据观察结果及标准，确定种质籽粒的饱满度。1：不饱满（籽粒未被胚乳充满，种皮有明显凹陷，籽粒瘪瘦），2：中等（籽粒基本被胚乳充满，种皮略有凹陷），3：饱满（籽粒完全被胚乳充满，种皮无凹陷）。

1.3 表型数据分析

采用Excel 2019、IBM SPSS Statistics 20和Origin 2021软件对千粒重、粒长、粒宽、粒厚、籽粒面积、籽粒周长、籽粒长宽比、籽粒形状和籽粒饱满度9个小麦籽粒大小和形态相关性状进行统计分析和相关性分析。采用QTL IciMapping v4.1软件中的ANOVA功能进行遗传力的估算。

1.4 基因型测定及连锁不平衡分析

采用小麦90 K SNP芯片对300份冬小麦品种（系）进行基因型测定，90 K SNP芯片由Illumina公司开发，包含81587个SNP标记。课题组前期完成300份品种（系）的数据质量控制，将杂合基因型作为缺失数据、过滤掉缺失率大于20%的标记，并去除最小等位基因频率（MAF， minor allele frequency）小于5%的标记，最后保留16710个高质量SNP标记用于进行全基因组关联分析。以r²作为衡量多态性位点连锁不平衡（LD， linkage disequilibrium）参数，运用Tassel v5.0软件进行LD估算，将第95百分位处的r²值与LD衰减曲线的交叉点作为LD衰减距离，染色体组平均LD衰减距离用于判断关联分析中显著关联SNP标记间的物理位置能否划分为同一位点。

1.5 群体结构分析

采用Power Maker V3.25软件计算多态性信息量（PIC，polymorphic information content）^［

20］。从筛选过的标记中，选取2000个在21条染色体上均匀分布的SNP标记，通过Structure V2.3.4软件进行群体结构分析，亚群数目K=2~12，每个K值重复5次，通过Structure Harvester在线分析软件获得最佳K值下的亚群数目。使用Tassel v5.0软件^{［参考文献 21

百度学术}21］进行主成分分析，共分析得到5个主成分，将前3个主成分基于Python v3.8的Axes3D程序包完成数据可视化。

1.6 全基因组关联分析

基于筛选获得的高质量SNP标记，对300份小麦品种（系）的籽粒大小和形态相关性状在每个环境下的均值及BLUE值进行GWAS。为避免亲缘关系和群体结构造成假阳性，采用TASSEL v5.0软件中的混合线性模型（MLM， mixed linear model）进行关联分析。以-log₁₀（p）=3作为SNP标记与目标性状关联结果的显著性阈值，将至少在两个环境中检测到与单个籽粒性状显著关联的位点视为稳定位点，将染色体组平均LD衰减距离内位点视为一因多效位点。GWAS结果基于R v4.2.0中的CMplot程序包绘制，曼哈顿图（Manhattan plot）展示标记的分布情况，Q-Q图（Quantile-quantile plot）用于评估关联分析结果的准确性。

1.7 单倍型分析及候选基因筛选

利用Haploview v4.2软件对表型贡献率大于8%，且同时与4个及以上籽粒性状显著关联的SNP位点进行单倍型分析，通过在线网站HIPLOT（https：//hiplot-academic.com/）对籽粒表型值进行小提琴图绘制，剔除SNP杂合的材料。将检测到与多个籽粒性状关联的SNP序列作为探针，在小麦基因组数据库（IWGSC， CS RefSeq v2.1，https：//www.wheatgenome.org/）、NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）及ENA（https：//www.ebi.ac.uk/ena）等数据库中检索比对，确定候选基因并对其进行功能注释。

2 结果与分析

2.1 小麦籽粒大小和形态性状表型数据分析

通过对小麦籽粒大小和形态性状的表型数据分析（表1），结果显示300份小麦品种（系）籽粒大小和形态性状在不同环境中呈连续分布。各性状在不同环境中均具有较大的表型变异，变异系数范围为3.80%~26.06%之间，广义遗传力适中，处于56.25%~91.98%之间，表明这些性状的表达受到遗传因素和环境因素的双重影响。峰度值中，E2环境中籽粒面积的峰度值最大，说明该环境中籽粒面积性状正态分布相对陡峭，存在部分极端值。偏度值中，籽粒性状偏度的绝对值都处于1以下，除粒宽的BLUE值（-0.76）略微左偏外，其余性状在偏度上均具有较好的表现。相关性分析发现（图1），除了粒长、籽粒面积、籽粒周长与籽粒饱满度，籽粒长宽比、籽粒形状与籽粒面积无显著相关关系外，其余性状之间均呈显著（P≤0.01）相关关系。其中，粒长和籽粒周长正相关系数最大（r=0.95），籽粒长宽比和籽粒形状负相关系数最大（r=-0.70）。以上结果表明，本研究中9个籽粒性状是多基因控制的数量性状，符合正态分布，适合用于全基因组关联分析。

表1 小麦籽粒大小和形态性状表型数据分析和遗传力

Table 1 Phenotypic data analysis and heritability of grain size and morphological traits in wheat

性状Traits	环境Environment	变异范围Range	均值±标准差Mean±SD	偏度Ske.	峰度Kur.	变异系数（%）CV	广义遗传力（%）H²
千粒重（g） TKG	E1	24.71~53.84	42.40±4.58	-0.38	0.40	10.81	84.75
	E2	26.54~57.49	43.64±4.54	-0.46	0.73	10.41
	BLUE	25.58~53.11	42.97±4.27	-0.60	0.73	9.95
粒长（mm） GL	E1	5.60~7.52	6.63±0.29	0.07	0.38	4.39	91.98
	E2	5.23~7.11	6.30±0.29	-0.03	0.69	4.62
	BLUE	5.47~7.20	6.47±0.28	-0.02	0.50	4.35
粒宽（mm） GW	E1	2.90~3.79	3.47±0.16	-0.64	0.39	4.54	86.40
	E2	2.82~3.76	3.36±0.15	-0.56	0.77	4.45
	BLUE	2.86~3.71	3.42±0.14	-0.76	0.83	4.21
粒厚（mm） GT	E1	2.62~3.68	3.13±0.16	-0.20	0.59	5.12	75.69
	E2	2.64~3.68	3.12±0.16	-0.12	0.86	5.09
	BLUE	2.65~3.52	3.12±0.14	-0.36	0.37	4.50
籽粒面积（mm²） GA	E1	12.53~21.14	17.89±1.29	-0.35	0.67	7.23	84.74
	E2	11.51~23.49	16.41±1.35	0.56	3.89	8.20
	BLUE	12.14~21.38	17.15±1.22	-0.17	1.49	7.12
籽粒周长（mm） GC	E1	14.73~19.44	17.55±0.68	-0.19	0.83	3.86	87.55
	E2	14.25~20.36	17.04±0.73	0.08	2.16	4.28
	BLUE	14.55~19.33	17.29±0.66	-0.23	1.29	3.80
籽粒长宽比 LWR	E1	1.68~2.35	1.94±0.10	0.40	0.89	5.08	90.64
	E2	1.69~2.31	1.90±0.09	0.58	1.30	4.81
	BLUE	1.68~2.33	1.92±0.09	0.50	1.38	4.73
籽粒形状 KS	E1	1.00~4.00	2.36±0.54	-0.36	0.28	22.83	61.94
	E2	1.00~4.00	2.33±0.61	0.01	0.00	26.06
	BLUE	1.00~3.63	2.34±0.47	-0.34	0.46	20.03
籽粒饱满度 GP	E1	1.00~3.00	2.15±0.52	-0.46	-0.17	24.17	56.25
	E2	1.00~3.00	2.26±0.57	-0.39	-0.52	25.06
	BLUE	0.97~3.07	2.21±0.43	-0.51	-0.08	19.42

E1：2018-2019年度玛纳斯环境点；E2：2019-2020年度玛纳斯环境点；BLUE：最佳线性无偏估计；TKG：千粒重；GL：粒长；GW：粒宽；GT：粒厚；GA：籽粒面积；GC：籽粒周长；LWR：籽粒长宽比；KS：籽粒形状；GP：籽粒饱满度；下同

E1： Manas 2018-2019 environmental point； E2： Manas 2019-2020 environmental point； BLUE： Best linear unbiased estimate； TKG： Thousand-kernel weight； GL： Grain length； GW： Grain width； GT： Grain thickness； GA： Grain area； GC： Grain circumference； LWR： Grain length-width ratio， KS： Kernel shape； GP： Grain plumpness； The same as below

图1 小麦籽粒大小和形态性状相关性分析

Fig.1 Correlation analysis of grain size and morphological characters in wheat

TKG：千粒重；GL：粒长；GW：粒宽；GT：粒厚；GA：籽粒面积；GC：籽粒周长；LWR：籽粒长宽比；KS：籽粒形状；GP：籽粒饱满度；*表示P≤0.05 水平上相关显著；**表示P≤0.01 水平上相关显著；***表示P≤0.001 水平上相关显著；下同

TKG： Thousand-kernel weight； GL： Grain length； GW： Grain width； GT： Grain thickness； GA： Grain area； GC： Grain circumference； LWR： Grain length-width ratio； KS： Kernel shape； GP： Grain plumpness； *： Significant at P≤0.05； **： Significant at P≤0.01； ***： Significant at P≤0.001； The same as below

2.2 连锁不平衡及群体结构分析

对300份小麦品种（系）的连锁不平衡分析得到，A、B和D亚基因组LD衰减距离分别为5、5和8 Mb，全基因组水平上LD衰减距离为8 Mb。依据全基因组水平将物理图谱上小于8 Mb区间内的位点划分为同一位点，每个位点选择重复检测到或者显著性最高的标记作为代表性标记。采用Structure v2.3.4软件进行群体结构分析，由图2B可知，ΔK在K=3时最大，表明该群体适宜亚群为3，图2A为具体亚群分布情况。同时对供试材料进行主成分分析，结果显示供试材料同样分为3个亚群（图2C）。因此，本研究以K=3生成的群体结构Q（固定影响因子）+亲缘关系K（随机影响因子）的MLM模型进行标记-性状关联分析。

图2 群体结构及主成分分析图

Fig.2 Population structure and principal component analysis diagram

A：群体结构示意图；B：群体结构分析ΔK随K值变化；C：主成分分析

A： Schematic of population structure； B： Population structure analysis Δ K as a function of K value； C： Principal component analysis

2.3 标记-性状关联分析

采用混合线性模型对两个环境及BLUE值的9个小麦籽粒大小和形态性状进行标记-性状关联分析。由图3曼哈顿图可以看出，本研究定位到较多的籽粒性状显著关联位点，各性状显著性关联位点存在少数聚集现象，Q-Q图结果显示本研究关联分析结果较好地控制了假阳性。将至少在两个及以上环境中检测到的SNP位点视为稳定位点，关联分析共检测到66个稳定SNP位点（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20221224001，附表1）。这些位点分布在除3D、4D、5D外的18条染色体上，可解释3.74%~14.34%的表型变异。在所有环境（包含BLUE值环境）中均检测到的关联位点有16个，包含4个粒长、4个粒宽、2个粒厚、1籽粒面积和5个籽粒长宽比的关联位点。在1B染色体上检测到籽粒大小和形态的关联位点最多（12个），包含3个粒长、1个粒厚、1个籽粒周长、6个籽粒长宽比和1个籽粒饱满度位点。1B染色体可能对籽粒大小和形态性状有较大影响，可作为研究籽粒性状的重要染色体。

图3 部分性状曼哈顿图及Q-Q图展示

Fig.3 Manhattan and Q-Q plot display of partial traits

左侧曼哈顿图中纵坐标为3时的黑实线代表阈值（-log₁₀（p）=3），大于3代表存在显著关联位点

The black solid line at an ordinate of 3 in the left Manhattan plot represents the threshold （-log₁₀（P）=3）， and a value greater than 3 represents the presence of a significant association site

将染色体组平均衰减距离8 Mb内位点视为一因多效位点，本研究共检测出37个与多个籽粒大小和形态性状显著关联的一因多效位点（表2）。这些位点分布在1A、1B、1D、2A、2B、2D、3A、3B、4A、4B、5B、6A、6B、6D、7A、7B和7D染色体上，可解释3.74%~14.34的表型变异。其中，定位到4个同时与4个及以上籽粒性状显著关联的位点。位于3B染色体的687.76 Mb处的标记BS0002 2512_51、位于6B染色体的（188.19~191.99 Mb）的标记Jagger_c555_287和位于7B染色体（23.44~26.24 Mb）的标记CAP7_c1383_548，为控制4个籽粒性状的多效位点，位于6D染色体的461.92~464.94 Mb处的标记wsnp_Ex_c4480_8055475为控制千粒重、粒长、粒宽、籽粒面积、籽粒周长和籽粒长宽比的位点。与4个及以上籽粒性状关联的位点可作为分子标记辅助育种和QTL精细定位的重点。值得关注的是，将本研究中发现的与单个籽粒性状显著关联的稳定位点和一因多效位点与前人研究结果进行比较，分别发现了8个和5个疑似新位点（表2，详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20221224 001，附表1）。

表2 同时与多个籽粒性状显著关联的位点信息

Table 2 Locus information significantly associated with multiple grain traits at the same time

序号Number	性状Traits	位点Marker	染色体Chr.	物理位置（Mb）Physical position	P 值P value	表型贡献率（%）R²
1	GL/LWR	Tdurum_contig60037_441	1A	23.97~28.62	1.54E-04~6.92E-04	4.15~5.65
2	TKG/GW	Ex_c15768_799	1A	517.48	1.18E-04~9.59E-04	3.74~5.10
3	GT/KS	wsnp_Ex_c5780_10153638	1B	20.18~26.19	3.73E-04~7.88E-04	4.12~4.60
4	GL/GT/LWR	BS00033332_51	1B	38.83~40.19	1.45E-04~9.56E-04	3.93~5.38
5	GW/GT/LWR	GENE-0403_301	1B	109.73	2.72E-05~8.54E-04	3.89~6.24
6	GL/LWR	Kukri_c19641_753	1B	275.67	4.65E-06~3.44E-04	4.36~7.36
7	GL/GC/LWR	Excalibur_c10111_127	1B	637.62~642.68	1.70E-05~9.30E-04	3.80~6.50
8	GT/GP	wsnp_Ex_c38849_46284348	1B	661.63~668.25	3.59E-04~7.70E-04	3.95~4.64
9	LWR/GP	IAAV426	1D	16.79	4.77E-06~6.51E-04	7.74~13.07
10	GL/LWR	RAC875_c259_1339	2A	759.83~760.56	4.69E-04~9.67E-04	4.12~5.79
11	TKG/GW/GA	BS00099658_51	2B	24.91	3.59E-06~7.97E-04	5.15~9.11
12	LWR/KS	BS00081406_51	2B	140.85~142.45	1.11E-04~9.23E-04	3.83~5.21
13	LWR/KS	Excalibur_c42512_584	2D	577.11~580.19	3.34E-04~8.25E-04	3.94~4.55
14	TKG/GP	Kukri_c14029_117	3A	53.34~55.09	6.68E-06~8.93E-04	3.76~7.19
15	GW/KS	IAAV8990	3A	375.82	7.11E-04~7.87E-04	4.03~4.43
16	TKG/GP	BS00097939_51	3A	729.58~732.04	1.29E-04~8.84E-04	4.65~5.84
17	GL/GC	Excalibur_c18641_1849	3B	230.34~235.87	1.12E-04~8.32E-04	3.80~5.19
18	GL/GW/GT/LWR	BS00022512_51	3B	687.76	4.05E-09~8.17E-05	7.06~14.34
19	TKG/GW	Tdurum_contig31852_251	4A	734~734.07	1.24E-04~9.62E-04	5.07~6.76
20	TKG/GW	IAAV971	4B	37.69~40.75	3.45E-04~9.04E-04	3.82~4.44
21	TKG/GW/GT	Excalibur_c56787_95	4B	59.21	2.40E-04~8.59E-04	4.11~5.88
22	GW/GT	Excalibur_c52517_464	4B	167.35	6.01E-05~6.48E-04	4.01~5.59
23	LWR/GT	wsnp_Ex_c25373_34639805	4B	480.59~482.65	3.51E-04~6.10E-04	4.12~5.53
24	TKG/GW	GENE-2771_327	4B	526.73~526.93	6.66E-04~9.37E-04	3.74~4.26
25	GL/GA/GC	wsnp_Ex_c831_1625061	5B	10.53	2.51E-04~8.32E-04	4.97~5.83
26	TKG/GW/GA	BobWhite_c14575_323	6A	129.74	1.65E-04~6.06E-04	4.11~4.97
27	GW/GT/KS	RFL_Contig6053_3082	6A	594.99~597.79	4.47E-04~8.11E-04	3.94~4.31
28	GA/GC/LWR/KS	Jagger_c555_287	6B	188.19~191.99	3.75E-04~9.48E-04	3.81~5.08
29	TKG/KS	Kukri_c50603_164	6B	451.93~456.76	3.41E-04~7.98E-04	4.05~4.75
30	GL/GA/GC	Kukri_c65194_111	6D	98.13	1.56E-04~9.22E-04	3.89~5.04
31	TKG/GL/GW/GA/GC/LWR	wsnp_Ex_c4480_8055475	6D	461.92~464.94	1.07E-04~9.95E-04	3.81~8.25
32	TKG/GT	BobWhite_c5396_296	7A	442.27~443.96	1.38E-04~9.95E-04	3.77~5.18
33	TKG/GC	Kukri_c24408_743	7A	670.82	3.21E-04~9.55E-04	3.85~4.67
34	GW/GT/LWR	Tdurum_contig29240_206	7A	702.40	3.50E-05~6.28E-04	4.02~5.97
35	GL/GA/GC/GP	CAP7_c1383_548	7B	23.44~26.24	1.16E-04~9.62E-04	3.74~5.17
36	TKG/GA/GP	wsnp_Ku_c665_1371121	7B	58.25~58.73	5.23E-04~8.78E-04	3.95~5.18
37	LWR/KS	Excalibur_c32138_394	7D	633.20~633.60	1.45E-04~7.64E-04	4.10~6.29

加粗位点为新发现位点

With bold sites as newly discovered sites

2.4 单倍型分析

将同时与4个及以上籽粒性状显著关联且具有较大表型贡献率的BS00022512_51（7.06%~14.34%）和wsnp_Ex_c4480_8055475（3.81%~8.25%）位点进行单倍型分析。结果发现，3D染色体的BS00022512_51标记处不存在单倍型，位于6D染色体的wsnp_Ex_c4480_8055475标记与其右翼标记wsnp_Ex_c4480_8056354形成一个约1 kb的单倍域（图4B），该单倍域中存在3个单倍型（GC-Hap1、AT-Hap2和AC-Hap3）。显著性分析（图4A）发现，具GC-Hap1单倍型的品种（系）在千粒重（43.38±4.19 g）、粒宽（3.44±0.14 mm）、籽粒面积（17.26±1.19 mm²）和籽粒周长（17.33±0.63 mm）上显著（P<0.05）高于具AT-Hap2单倍型的品种（系）的千粒重（41.77±4.21 g）、粒宽（3.37±0.14 mm）、籽粒面积（16.81±1.17 mm²）和籽粒周长（17.17±0.67 mm）；具GC-Hap1单倍型的品种（系）的籽粒长宽比（1.90±0.09）显著（P<0.05）低于具AT-Hap2单倍型的品种（系）的籽粒长宽比（1.94±0.10）；具AC-Hap3单倍型的品种（系）的籽粒性状在P<0.05水平上与具GC-Hap1和AT-Hap2单倍型的品种（系）的籽粒性状均无显著差异，整体均值介于GC-Hap1和AT-Hap2单倍型的品种（系）之间。具AT-Hap2单倍型的品种（系）虽然在籽粒长宽比性状方面显著（P<0.05）高于具GC-Hap1单倍型的品种（系），但两个单倍型的品种（系）间粒长不存在显著差异，粒宽存在显著差异。因此3个单倍型中单倍型GC-Hap1为籽粒较大的高千粒重单倍型。

图4 wsnp_Ex_c4480_8055475的单倍型分析

Fig.4 Haplotype analysis of wsnp_Ex_c4480_8055475

A：千粒重、粒长、粒宽、籽粒面积、籽粒周长、籽粒长宽比的小提琴图。B：6D染色体的wsnp_Ex_c4480_8055475标记关联的连锁区域。C： 3种单倍型在国内外300份小麦品种（系）的分布频率及3种单倍型在中国4个冬麦区和国外品种的分布频率；I： 3种单倍型整体的分布频率；II：黄淮冬麦区；III：北部冬麦区；IV：长江中下游冬麦区；V：西南冬麦区；VI：国外品种

A： Violin diagram of 1000-grain weight， grain length， grain width， grain area， grain perimeter and grain length-width ratio. B： Linked regions associated with wsnp_Ex_c4480_8055475 markers on chromosome 6D. C： The distribution frequencies of three haplotypes in 300 wheat varieties （lines）， and the distribution frequencies of three haplotypes in four winter wheat regions in China and foreign varieties； I： The overall distribution frequency of three haplotypes； II： Huang-Huai winter wheat region； III： Northern winter wheat region； IV： Middle and lower Yangtze River winter wheat region； V： Southwest winter wheat region； VI： Foreign varieties

从单倍型整体分布频率看，具GC-Hap1单倍型的品种（系）占65.58%，具AT-Hap2单倍型的品种（系）占32.25%，具AC-Hap3单倍型的品种（系）占2.17%，具GC-Hap1单倍型的品种（系）分布频率明显大于具AT-Hap2和AC-Hap3单倍型的品种（系）。从单倍型分布频率看，具GC-Hap1单倍型的品种（系）分布频率表现为西南冬麦区（90.00%）>长江中下游冬麦区（89.74%）>黄淮冬麦区（69.73%）>北部冬麦区（69.57%）>国外品种（32.26%）；具AT-Hap2单倍型的品种（系）分布频率表现为国外品种（67.74%）>黄淮冬麦区（27.52%）>北部冬麦区（26.09%）>西南冬麦区（10.00%）>长江中下游冬麦区（7.69%）；具AC-Hap3单倍型的品种（系）仅在北部冬麦区、黄淮冬麦区和长江中下游冬麦区分布，且在各麦区分布频率不超过5%（图4C）。结果表明，3种单倍型在各麦区的分布频率存在较大差异。

2.5 候选基因筛选

结合普通小麦中国春基因组数据库（IWGSC，https：//www.wheatgenome.org/），本研究对与多个籽粒大小和形态性状显著关联SNP标记进行序列检索比对，发现了9个可能的候选基因（表3）。在1B染色体上存在两个候选基因TraesCS1B03G0270700和TraesCS1B03G1104100，分别编码MYB转录因子（MYB transcription factor）和激酶（Kinase）。前者参与植物次生代谢途径，后者主要在细胞信号传导及其复杂的生命活动中起作用。2B染色体的TraesCS2B03G0104000编码的细胞色素P450（Cytochrome P450）在植物体内起生物合成的作用，具有解毒抗逆等功能。位于1D染色体的TraesCS1D03G0071600和3A染色体的TraesCS3A03G0182600编码富含半胱氨酸的受体样激酶（Cysteine-rich receptor-like kinase），主要在植物生长发育和应激反应中起关键作用。3B染色体的TraesCS3B03G1107600编码五肽重复序列的蛋白质（Pentatricopeptide repeat-containing protein），主要参与植物的逆境胁迫和生长发育。位于6B染色体的TraesCS6B03G0448200编码泛素（Ubiquitin），泛素介导靶蛋白的降解，泛素途径影响着植物种子大小测定^［

22］。位于6D染色体的TraesCS6D03G0893200编码RING/U-box 超家族蛋白（RING/U-box superfamily protein），参与植物中多种激素信号的转导；位于7A染色体的TraesCS7A03G1260500编码F-box家族蛋白（F-box family protein），该家族蛋白对植物的生长发育、信号转导和生物及非生物逆境胁迫等方面起到重要作用。

表3 筛选获得候选基因信息

Table 3 Screening to obtain candidate gene information

序号 Number	性状Traits	SNP标记SNP marker	染色体Chr.	物理位置（Mb） Physical position	候选基因Gene ID	功能注释Functional annotation
1	GW/GT/LWR	GENE-0403_301	1B	115.97	TraesCS1B03G0270700	MYB转录因子
2	GL/GC/LWR	Excalibur_c10111_127	1B	644.63	TraesCS1B03G1104100	激酶，推定
3	LWR/GP	IAAV426	1D	18.15	TraesCS1D03G0071600	富含半胱氨酸的受体激酶样蛋白
4	TKG/GW/GA	BS00099658_51	2B	27.54	TraesCS2B03G0104000	细胞色素 P450
5	TKG/GP	Kukri_c14029_117	3A	53.51	TraesCS3A03G0182600	富含半胱氨酸的受体样激酶
6	GL/GW/GT/LWR	BS00022512_51	3B	703.84	TraesCS3B03G1107600	含有五肽重复序列的蛋白质
7	GA/GC/LWR/KS	Jagger_c555_287	6B	198.25	TraesCS6B03G0448200	泛素，推定
8	TKG/GL/GW/GA/GC/LWR	wsnp_Ex_c4480_8055475	6D	484.02	TraesCS6D03G0893200	RING/U-box 超家族蛋白，推定
9	GW/GT/LWR	Tdurum_contig29240_206	7A	707.89	TraesCS7A03G1260500	F-box家族蛋白

3 讨论

3.1 籽粒性状的表型观察

小麦籽粒大小和形态是影响籽粒产量、磨粉品质和市场价值的重要因素，其遗传解析对于我国粮食安全具有重要意义^［

23］。本研究中，小麦籽粒大小和形态相关性状整体呈正态分布，遗传力在56.25%~91.98%之间，所有目标性状均具有较大的表型变异，适合用于全基因组关联分析。千粒重作为产量的主要构成因素之一，受到籽粒长度、宽度、厚度和籽粒面积等因素的共同影响^{［参考文献 5

百度学术}5］。本研究表明除籽粒长宽比外，其余性状均与千粒重呈极显著（P≤0.001）正相关关系，籽粒面积与千粒重的相关性最高（r=0.90）。籽粒面积受到粒长、粒宽的共同影响。粒长、粒宽虽然都与千粒重呈极显著正相关，但粒宽与千粒重的相关性明显大于粒长与千粒重的相关性。同时粒宽与千粒重的相关性也明显大于粒厚与千粒重的相关性，这表明目前小麦产量的增加受到粒宽的影响更大，这些结果在前人的研究中也有证明^{［参考文献 24

百度学术}24］。同时，本研究中的粒形整体呈卵型偏椭圆型，其原因可能与育种家对小麦籽粒宽度偏好选择存在极大的关系。Gegas等^{［参考文献 25

百度学术}25］分析了大多数已知小麦属种的籽粒大小和形态性状，发现小麦的籽粒从一种细长的原始籽粒进化成一种更宽、更短的椭圆型现代籽粒。Marshall等^{［参考文献 26

百度学术}26］对小麦籽粒用几何模型分析，发现不同大小和形态的籽粒出粉率存在一定差异，长型小麦籽粒出粉率最低，椭圆型小麦籽粒出粉率最高。这些结果表明相较于其他籽粒大小性状，粒宽对产量和磨粉品质的影响更大，籽粒的宽度相较于长度和厚度是更有效的育种性状。

3.2 本研究GWAS结果与前人研究比较

GWAS作为检测基因特征和表型变异的有力工具，在植物遗传育种中发挥越来越多的作用^［

27］。小麦籽粒大小和形态相关性状属于微效多基因控制的数量性状，其遗传解析往往受到基因型和环境互作的影响，因此在不同环境中检测到稳定的标记-性状关联位点往往具有更高的参考价值^{［参考文献 28

百度学术}28］。本研究以-log₁₀（p）=3为阈值，在两个及以上环境中共检测到66个稳定的标记-性状关联位点，可解释3.74%~14.34%的表型变异。其中，1B染色体定位到的位点最多（12个），这12个位点分别影响粒长、粒厚、籽粒周长、籽粒长宽比和籽粒饱满度。严勇亮等^{［参考文献 29

百度学术}29］的研究也发现1B染色体对小麦籽粒性状调控具有重要影响，在今后对小麦籽粒性状的研究中可优先选择1B染色体的位点。将本研究结果和前人研究进行比较，发现一些相邻或相近的位点和基因。本研究于4A染色体定位到的与粒宽显著关联的标记Tdurum_contig31852_251与Yue等^{［参考文献 30

百度学术}30］鉴定的粒重基因6-SFT-A2相距约4.9 Mb，推测该位点控制籽粒长度的效应可能来源于该基因。Zhao等^{［参考文献 18

百度学术}18］于1D染色体定位到控制籽粒长宽比的位点AX-108835501与本研究中定位到的与籽粒长宽比显著关联的IAAV426位点相距仅0.14 Mb。在本研究中IAAV426能够解释较高表型变异（10.84%~13.07%），该位点可能存在调控小麦籽粒长宽比的基因。同时，本研究于2B染色体的24.91 Mb处检测到控制千粒重、粒宽和籽粒面积的BS00099658_51位点。Daba等^{［参考文献 31

百度学术}31］在该染色体16.90 Mb处检测到控制粒宽的标记S2B_16897947，邹林翰等^{［参考文献 11

百度学术}11］在该染色体1.60~10.17 Mb处检测到控制粒厚的QTL，Malik等^{［参考文献 32

百度学术}32］在该位点下游16.59 Mb处检测到了粒长位点，这些位点与本研究位点均不足20 Mb，推测该染色体区段可能是控制小麦籽粒大小和形态性状的重要候选区段。本研究定位于4B染色体短臂的Excalibur_c56787_95标记同时控制千粒重、粒宽和粒厚，前人研究也证明了4B染色体上的QTL对千粒重和籽粒大小有多效性影响^{［参考文献 4

百度学术}4，33］。位于6A染色体129.74 Mb处的控制千粒重、粒宽和籽粒面积的BobWhite_c14575_323标记与Daba等^{［参考文献 31

百度学术}31］定位的粒长和邹林翰等^{［参考文献 11

百度学术}11］定位到控制粒厚的标记位置相距3 Mb范围内，该位点处还未发现籽粒性状相关的基因，推测这些性状可能为同一基因调控。定位于6D染色体与6个籽粒性状关联的wsnp_Ex_c4480_8055475标记与Li等^{［参考文献 34

百度学术}34］定位到的千粒重标记AX_109481324和Zhao等^{［参考文献 18

百度学术}18］定位的籽粒长宽比标记AX-95156239相距不足2 Mb，该位点可能是控制小麦籽粒性状的主效QTL。综上，本研究发现的SNP位点与已知小麦籽粒相关性状的QTL位点或基因吻合，表明本研究的全基因组关联分析具有较高的可信度。与6个籽粒性状关联的wsnp_Ex_c4480_8055475标记和1D 染色体定位的表型贡献率大的IAAV426标记，可作为QTL精细定位和标记开发的首选。

虽然前人利用不同群体已定位到较多的小麦籽粒性状QTL，但小麦基因组庞大而复杂，因此克隆的基因数目有限^［

35］。本研究以国内外300份小麦品种（系）为研究材料，发现了13个籽粒大小和形态相关性状的新位点。定位于1B（Kukri_c19641_753）、3A（IAAV8990）、3B（BS00022512_51），4B（wsnp_Ex_c25373_34639805）和7A（Tdurum_contig 29240_206）的标记是影响籽粒性状的一因多效标记。其中，3B染色体上的标记BS00022512_51在本研究中解释最大的表型变异（7.06%~14.34%），这些定位到的一因多效位点可能涉及小麦籽粒大小和形态发育过程中组成型表达基因。下一步研究，可优先选择以3B染色体为主的多效性标记进行图位克隆和功能验证，以期进一步推进小麦籽粒大小和形态遗传机制的研究。

3.3 籽粒性状有利单倍型鉴定及分布

近年来，全基因组关联分析已经成为分析复杂性状的首选方法^［

14］。然而，用SNP位点的双等位基因描述性状和位点之间复杂关系的分辨率是有限的，基于连锁不平衡构建单倍型进行相关分析是克服这一局限的有效途径^{［参考文献 36

百度学术}36］。单倍型将两个或多个SNP等位基因作为一个遗传单位，通过关联分析结合单倍型分析的方法，极大提高了关联分析的可靠性。本研究对表型贡献率大且控制4个及以上籽粒性状的2个关联位点进行单倍型分析，发现位于6D染色体的wsnp_Ex_c4480_8055475标记存在3个单倍型。具单倍型GC-Hap1和AT-Hap2的品种（系）在5个籽粒性状上差异均达到了显著水平（P≤0.05），进一步分析发现GC-Hap1为籽粒较大的高千粒重单倍型。在作物育种中，优异等位变异或单倍型总会受到育种家的正向选择，使其在育成品种中出现的频率提高^{［参考文献 37

百度学术}37］。本研究同样也发现与籽粒性状好、高千粒重紧密相关的GC-Hap1单倍型（65.58%）品种（系）的频率远高于AT-Hap2单倍型（32.25%）和AC-Hap3单倍型（2.17%）品种（系）的频率。这表明单倍型GC-Hap1受到了育种家的正向选择，同时也表明单倍型GC-Hap1对小麦籽粒性状及粒重的遗传改良具有较大的提升空间。进一步对不同麦区分布频率分析（图4C），具GC-Hap1单倍型的品种（系）在不同麦区分布频率存在较大差异。具GC-Hap1单倍型的品种（系）在中国育成小麦品种（系）中被大量选育，在4个中国冬麦区分布频率均达到了69%以上，而在国外品种中的分布频率仅有32.26%。中国育成小麦品种（系）整体分布频率大于国外引进品种（系）可能是因为生态条件和选择压力，对小麦的千粒重等籽粒性状产生了积极的影响，而国外小麦育种对于千粒重的选择不强，对于产量提升的需求也不大，其产量的提升更依赖于穗数和穗粒数^{［参考文献 38

百度学术}38］。国内4个冬麦区中，具GC-Hap1单倍型的品种（系）在长江中下游冬麦区和西南冬麦区中分布频率最高，达到了85%以上，原因可能与两地的气候条件密切相关，病害频发和生育后期高温等不利因素是影响两地产量提升的主要原因，所以育种家在品种选育上更加重视籽粒灌浆程度和籽粒饱满度的选择，在一定程度上籽粒灌浆充实的小麦一般抗逆抗病性好、千粒重高^{［参考文献 39

百度学术}39］。本研究进行单倍型分析的标记可依据该标记的位置及候选基因筛选的结果，进一步通过连锁分析验证标记的实用性，并深入解析候选基因的作用机制。同时，在今后的小麦育种工作中，可以根据不同麦区的实际情况选择适宜的单倍型的品种进行遗传改良。

3.4 候选基因分析

在作物育种中，已经验证了一些与籽粒大小和形态相关的候选基因。例如，细胞色素P450通过影响小麦种皮数量的多少影响籽粒大小，其沉默可导致小麦籽粒大小下降11%^［

40］；RING/U-box超家族蛋白在泛素通道起作用，而泛素途径在水稻和拟南芥中影响籽粒大小已经得到了证明^{［参考文献 22

百度学术}22，41］。本研究对与多性状显著关联的SNP位点进行候选基因分析（表3），发现了9个可能的候选基因，其中候选基因TraesCS6D03G0893200和TraesCS2B03G0104000在前人研究中已经证实。其次，位于1B染色体检测到两个候选基因，TraesCS1B03G0270700编码MYB转录因子，MYB家族参与植物逆境胁迫响应和植物生长发育的许多重要阶段，朱治等^{［参考文献 37

百度学术}37］对小麦TaMYB5-3B基因研究发现，该基因与株高、穗下节长和千粒重显著相关。TraesCS1B03G1104100编码激酶，在激酶中最大族群是蛋白激酶，蛋白激酶在细胞的信号转导和生命活动中起到了重要作用，关于激酶在小麦籽粒性状方面的作用还有待进一步研究。位于3B染色体上拥有表型贡献率最大标记处发现基因TraesCS3B03G1107600，该基因编码含有五肽重复序列的蛋白质（PPR），该家族蛋白在植物细胞中主要对植物生长发育和响应逆境胁迫等方面起到重要作用。Li等^{［参考文献 42

百度学术}42］对花生种子大小和重量研究发现，在鉴定的候选基因中，有1/2都编码五肽重复序列。本研究筛选的候选基因编码不同蛋白，在调控小麦籽粒大小和形态方面起到了直接或间接作用，需要进一步深入解析，为小麦籽粒大小和形态改良提供参考。

4 结论

本研究利用小麦90 K SNP芯片，对国内外300份小麦品种（系）的籽粒大小和形态相关性状进行全基因组关联分析。在两个及以上环境中共检测到66个稳定显著的SNP标记，37个一因多效位点，与前人研究对比后发现了13个新位点。对表型贡献率大且同时与4个及以上性状的位点进行单倍型分析，于6D染色体的wsnp_Ex_c4480_8055475标记处发现了籽粒较大的高千粒重单倍型GC-Hap1；对发现的与多性状显著关联的SNP进行候选基因筛选后，鉴定出9个候选基因。

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