柿种质资源炭疽病抗性评价及病原菌分离鉴定

闻家乐; 王淑瑾; 范芝蕊; 吕中一; 杨勇; 关长飞; WEN Jia-le; WANG Shu-jin; FAN Zhi-rui; LYU Zhong-yi; YANG Yong; GUAN Chang-fei

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杨勇
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西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100

最近更新：2023-06-13

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230110001

摘要

依托国家柿种质资源圃，观察记载了柿炭疽病主要发病部位及症状表型，并对479份常见柿资源材料的炭疽病抗性进行评价。结果表明，柿炭疽病原菌主要浸染嫩枝、果实及叶片。通过对柿枝条及果实炭疽病表型的田间调查，将479份常见柿资源材料分为高抗、抗病、中抗、感病、高感5种抗性等级，其中高抗和抗病种质分别有66和35份（占比分别为13.8%和7.3%），代表种质分别为郧阳火柿和黄边小鸡心等；中抗种质有119份（24.8%），包括富有、次郎等；感病及高感种质分别有209和50份（占比分别为43.6%和10.4%），代表种质分别为富平尖柿和骏河等。从叶片、枝条、果实中分离出病原菌，综合菌落、菌丝、孢子形态特征及多基因序列比对，发现其为哈锐炭疽病原菌（Colletotrichum horii）。

关键词

柿; 种质资源; 炭疽病; 抗性调查; 鉴定

柿（Diospyros kaki Thunb.； 2n = 6x = 90）系柿科（Ebenaceae）柿属（Diospyros L.）的重要代表种，属于双子叶植物纲，为我国特色传统果树。中国柿属植物资源十分丰富，国家柿种质资源圃目前保存柿资源约1200份^［

1］，为其遗传改良和新品种培育提供了充足的材料。

柿炭疽病是危害柿栽培生产的一种严重的真菌性病害，随着柿栽培面积的不断扩大，其危害日益严重，成为制约柿产业发展的重要影响因素。其主要为害柿树果实、叶片、新梢、柿蒂等^［

2］，轻者树势衰弱，重者整株枯死，严重影响柿果实的质量和产量^{［参考文献 3

百度学术}3］。不同品种对炭疽病的抗性存在差异，同一品种的不同部位对炭疽病的敏感性也有差异。炭疽病爆发的主要影响因素有高温、高湿、降雨、光照、pH、品种抗性等，最新研究发现炭疽病的发作与树龄存在关系^{［参考文献 4

百度学术}4］。陕西地区一般在5月中下旬观察到新梢开始发病，雨季发病较为严重，在6月下旬至7月中下旬可观察到果实发病^{［参考文献 5

百度学术}5］。

柿炭疽病是由柿树炭疽病原菌（Colletotrichum horii）引起，是危害柿产业的主要病害之一。柿树炭疽病原菌最先被命名为柿盘长孢菌G. kaki Hori^［

6-8］，并在一段时间内得到普遍使用。Weir等^{［参考文献 9

百度学术}9］对前人报道的炭疽病原菌进行了整理，根据形态学及核酸序列将柿树炭疽病菌命名为柿树炭疽菌C. horii nom. nov.，成为胶孢炭疽病原菌（C. gloeosporioides）复合种的成员之一，并得到了广泛认可^{［参考文献 10

百度学术}10］，柿属植物中绝大多数炭疽病均由此类病原菌引起^{［参考文献 11

百度学术}11］。柿炭疽病在中国^{［参考文献 11-12}11-12］、韩国^{［参考文献 10

百度学术}10，13］、日本^{［参考文献 14

百度学术}14］、巴西^{［参考文献 15

百度学术}15］、西班牙^{［参考文献 16

百度学术}16］等国家均有发生，受限于抗性资源，柿炭疽病抗性育种研究进展缓慢。导致柿炭疽病的病原菌种类主要包括C. gloeosporioiders、C. horri、C. karstii、C.fructicola、C .cliviicola、C. siamense。其中C. horii在采集地区均有分布，为主要病原菌，C. karstii、C. cliviicola、C. siamense是我国新发现的柿树炭疽病病原菌^{［参考文献 17-19}17-19］。C. nymphaeae和C. melonis在巴西引起的柿炭疽病为首次报道^{［参考文献 20

百度学术}20］。

关于柿炭疽病抗性种质田间调查的系统研究目前报道较少，根据田间表型观察，王孟珂等^［

21］将抗病性分为5级，具体为病斑20%以下，20%~49%，50%~74%，75%~89%，90%以上；车庆辉^{［参考文献 22

百度学术}22］将抗病性分为4级，具体为无病斑，病斑小于30%，31%~59%，大于60%；Guan等^{［参考文献 23

百度学术}23］在对43份种质资源的调查中将抗病性分为4级，具体为病斑2%以下，2%~5%，5%~20%，20%以上。但在实际研究中发现，部分种质在不同年份观察的抗性表现差异较大，可能受温度、水分、枝条部位等因素影响较大。因此，本研究将综合前人研究结果，根据具体试验结果对柿炭疽病田间抗性等级制定分类标准。

为更好地研究柿各品种对炭疽病的抗性水平，挖掘炭疽病抗性基因，本研究对国家柿种质资源圃479种柿资源材料开展炭疽病田间自然发病率调查，并制定柿炭疽病抗性分类标准，对柿种质资源的抗性进行分级，筛选出抗炭疽病种质资源，同时对病原菌进行分离鉴定，从而为柿炭疽病的防治及抗性育种提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 田间调查材料

试验依托于西北农林科技大学国家柿种质资源圃，选用常见柿资源材料479份，具体信息详见2.2。

1.2 发病率田间调查

依据病枝数、病果数占调查总数的百分比推测全树的感病情况。由于气候、鸟类蜜蜂取食等其他不确定因素影响，会出现果实掉落损毁等情况，所以将病枝比例作为判断炭疽病抗感性的主要依据，将病果比例作为判断炭疽病抗感性的次要依据。根据计算公式：柿树炭疽病发病率=病果率×40%＋病枝率×60%，计算出柿树炭疽病发病率（如若树上无果，则发病率等于病枝率），将调查到的所有柿种质资源分为5个等级，分别为高感、感病、中抗、抗病及高抗。由于田间调查具有一定的不准确性，故发病率为0的情况可能由病枝病果脱落等因素导致，在此均统计为高抗种质。

于2020年对国家柿种质资源圃内柿种质进行病枝及病果调查，对照种质资源抗性鉴定标准，筛选出不同抗性的种质。病枝率统计调查：选用树龄15~20年、长势良好的柿树，在树体东西南北4个方向各选5个3~5年生健壮的枝条，调查不同柿种质枝条的发病率情况；病果率统计调查：分别从东西南北4个方向各取10个果实，调查统计病果率。病枝（果）率=感病枝条或果实/调查总枝条或果实×100%。种质资源抗性鉴定标准如下：发病率在20%以上为高感，发病率在5%~20%之间为感病，发病率在2%~5%之间为中抗，发病率在0~2%之间为抗病，发病率为0为高抗。

1.3 炭疽病病原菌分离鉴定

1.3.1 病原菌的分离与纯化

采集炭疽病发病症状典型的柿叶、嫩枝和果实，放入采样袋内带入实验室进行分离。参考方中达^［

24］、杨佳文等^{［参考文献 25

百度学术}25］常规组织分离法进行病原菌的分离纯化，具体方法如下：用流动自来水将带病样本冲洗2~3 min洗落表面灰尘；选取病健交界处切取5 mm ×5 mm的矩形小块组织；用75%酒精浸泡30 s，进行消毒处理；用浓度为1%的次氯酸钠浸泡3 min；用无菌水冲洗4~5次，用灭菌滤纸吸干水分，接种在PDA培养基（配方：去皮马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂粉20 g，蒸馏水1000 mL）上，25 ℃倒置培养。待菌落边缘长出菌丝后挑取少许病原菌边缘菌丝接入新的PDA培养基。分离纯化5代后，得到病原菌菌株。

1.3.2 病原菌的形态学鉴定

将纯化后的菌株在25 ℃恒温培养箱培养7 d后，观察菌落形态，挑取菌丝制成临时玻片，在显微镜下观察菌丝形态。压取5个5 mm大小菌饼置于50 mL CMC液体培养基（配制：先将400 mL水微波沸腾15 min左右，加入7.5 g CMC，磁力搅拌至完全溶解，再加入0.5 g NH₄NO₃、0.5 g KH₂PO₄、0.25 g MgSO₄·7H₂O和0.5 g Yeast Extract，补水至500 mL）中，放在摇床上28 ℃，200 r/min摇菌48 h，孢子诱导后，在显微镜下进行孢子形态的观察，依据菌落形态、菌丝、分生孢子梗和分生孢子的形态进行初步鉴定。

1.3.3 病原菌的多序列基因比对

将分离纯化的菌株培养7 d后，将菌丝用牙签刮入2 mL 离心管中烘干12 h，放入小钢珠进行研磨，使用真菌DNA提取试剂盒（OMEGA试剂盒）提取基因组DNA，使用内部转录间隔区（IFS1， intelnal transcribed spacer 1）、3-磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）、肌动蛋白（ACT，Actin）、β-微管蛋白（TUB2， beta-tubuLin）、几丁质合成酶（CHS， Chitin synthetase）的对应引物进行PCR扩增。扩增引物由北京奥科鼎盛生物科技有限公司合成（表1）。

表1 病原菌鉴定引物

Table 1 Primers for pathogen identification

基因名称 Gene name	引物名称 Primer name	引物序列（5'→3'） Primer sequences（5'→3'）	参考文献 References
ITS	ITS-1	TCCGTAGGTGAACCTGCGG	［26］
ITS	ITS-4	TCCTCCGCTTATTGATATGC	［26］
ACT	ACT-512F	ATGTGCAAGGCCGGTTTCGC	［27］
ACT	ACT-783R	TACGAGTCCTTCTGGCCCAT	［27］
CHS-1	CHS-79F	TGGGGCAAGGATGCTTGGAAGAAG	［28］
CHS-1	CHS-345R	TGGAAGAACCATCTGTGAGAGTTG	［28］
GAPDH	gpd1	CAACGGCTTCGGTCGCATTG	［29］
GAPDH	gpd2	GCCAAGCAGTTGGTTGTGC	［29］
TUB2	T1	AACATGCGTGAGATTGTAAGT	［30］
TUB2	Bt2b	ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC	［31］

PCR反应条件为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共38个循环；72 ℃延伸5 min。50 μL反应体系：2×Reaction Mix 25.4 μL，DNA模板 2 μL，引物1（F） 2 μL，引物2（R） 2 μL，无菌水18.6 μL。最后经1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物条带亮度后，送往奥科（北京）科技有限公司测序。将所测序列在NCBI官网进行BLAST相似性比对，并用MEGA 7软件以最大似然法构建系统发育树，循环1000次。

1.4 致病性分析

基于柯赫氏法则（Koch postulates），从红光辉中分离的HGH-1孢子悬浮液进行浸染验证及表型观察。于7月份温度高、雨水天气较多、湿度大的条件下，利用HGH-1孢子悬浮液对树势强壮、无病虫害的富平尖柿当年生嫩枝进行无伤接种，孢子悬浮液浓度为1×10⁶ 个/mL。选择3个不同方位生长状况一致的新生幼嫩枝条，每个枝条以1.5 cm为间隔划分5个区域，每个区域中心部位用移液器加5 μL孢子悬浮液点滴法接种，套袋处理，于次日摘除。接种后3 d开始观察并记录发病情况，记录发病时间以及15日内病斑生长情况，以无菌水涂刷枝条为对照组。并对发病嫩枝再次进行病菌分离，待菌落长出后进行形态学和分子生物学鉴定。

2 结果与分析

2.1 柿炭疽病表型性状表现

2.1.1 柿枝条发病症状

柿炭疽病主要危害嫩梢，发病严重可致幼苗及枝条枯死（图1）。当年生嫩枝发病可以分为4个阶段^［

32］：第一阶段为新梢上出现小黑点；第二阶段小黑点会逐渐呈同心圆式扩大，最终可能成为直径10~20 mm中间下凹的圆形斑或椭圆形斑或形状不确定的病斑；第三阶段分生孢子盘中会溢出粉红色孢子团，孢子团呈黏状，含水量较大；第四阶段则可能导致病斑以上全部落叶，枝梢枯死。当病菌侵染处的枝条严重受损呈黑色腐朽状，会极易折断，如若病斑不断扩大，不利于病原菌生长时，病原菌的保护机制会让其寄主枝梢进入休眠状态。

图1 炭疽病侵染枝梢症状

Fig.1 Symptoms of anthracnose infestation

A：当年生嫩梢；B：木质化后枝梢；C：多年生枝干

A： Tender shoots in the same year； B： Branch after lignification； C： Perennial branches

2.1.2 柿果实发病症状

果实发病可以分为4个阶段^［

33］：第一阶段为在青绿色果面上出现深色小点；第二阶段为小斑点逐渐扩大成为大的圆形病斑，进一步扩大至5 mm以上时，其中部会下凹并出现密集环状排列的小黑粒（图2A）；第三阶段为病斑中部溢出粉红色分生孢子团（图2B）；第四阶段为发病后期，随着病原菌侵入皮层以下，表面出现黑色凹陷斑点，切开后内部形成了黑色结块（图2C）。每个柿果上的病斑数目会因柿果的敏感性和发病程度的不同而产生差异，范围一般在1~20个左右。随着病斑的不断扩大，有的病斑之间会彼此相连形成不规则形状，造成柿果迅速变软，并提前脱落。

图2 炭疽病侵染果实症状

Fig.2 Symptoms of fruit infection by anthracnose

A：发病初期；B：发病中期；C：发病后期

A： Early stage； B： Middle stage； C： Late stage

2.1.3 柿叶片发病症状

叶片发病部位主要是叶脉和叶柄，叶脉以主脉发病较为明显，侧脉发病较轻。发病部位起初为黑色斑点，然后逐渐扩大，形成不规则形或长条形的坏死病斑（图3），发病严重时会影响到叶片的光合作用，导致叶片脱落，从而影响树体正常生长。夏季高温高湿的天气更有利于炭疽病的传播，因此夏梢嫩叶相对更易感病，最初显现深褐色小斑点，病斑多且发病严重时，会出现嫩叶扭曲、畸形，最终脱落。

图3 炭疽病侵染叶片症状

Fig.3 Symptoms of Petiole infection by anthracnose

A：发病初期；B：发病中期；C：发病后期

A： Early stage； B： Middle stage； C： Late stage

2.2 柿种质资源炭疽病抗性评价

2.2.1 柿炭疽病抗性种质田间调查

依据种质资源抗性鉴定分级标准及各个材料的病枝率和病果率（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20230110001，附表1）对炭疽病抗性等级进行划分。结果显示在调查的479份柿常见材料中高抗的种质有66份（占比13.8%，下同），代表品种有郧阳火柿、三原烧柿等；抗病的种质有35份（7.3%），代表品种有黄边小鸡心、大红柿等；中抗的种质有119份（24.8%），代表品种有富有、次郎等；感病的种质有209份（43.6%），代表品种有富平尖柿等；高感的品种有50份（10.4%），如骏河等。调查结果与前人研究部分品种抗性相符，具有较好的准确性，柿种质资源圃中炭疽病发病较为普遍，不同品种之间炭疽病抗性差异较大，易感品种一旦发病由于抗性较弱必须尽快采取合理防治措施，否则树势会快速衰弱，并且加大翌年发病的可能性。调查结果显示，炭疽病主要危害当年生嫩枝及成熟期的果实。柿种质资源具体抗性等级如表2所示。

表2 柿种质资源抗性调查分级表

Table 2 Investigation on the resistance of anthracnose

序号 No.	品种 Species	抗性 Resistance	序号 No.	品种 Species	抗性 Resistance	序号 No.	品种 Species	抗性 Resistance	序号 No.	品种 Species	抗性 Resistance
1	曲靖水柿1	高抗	4	新昌牛心柿	高抗	7	六合柿	高抗	10	富平小尖顶	高抗
2	襄阳牛心柿	高抗	5	华阴重台柿	高抗	8	曹县牛心	高抗	11	木兰草原	高抗
3	洛阳镜面柿	高抗	6	绕天红	高抗	9	五里江牛心柿	高抗	12	泗洪牛心柿	高抗
13	云架山2号	高抗	60	历城绵柿	高抗	107	四瓣柿	中抗	154	铜盆柿	中抗
14	花县牛心柿	高抗	61	浙江农大水柿	高抗	108	洛阳鬼脸青	中抗	155	大狮头柿	中抗
15	石榴柿	高抗	62	彬县水柿	高抗	109	黑柿	中抗	156	德阳水柿	中抗
16	满城牛心柿	高抗	63	杂3-2	高抗	110	河北莲花柿	中抗	157	黎城绵柿	中抗
17	曹县牛心柿	高抗	64	杂5	高抗	111	秸山蜜罐	中抗	158	荥阳八月黄	中抗
18	泗洪大牛心柿	高抗	65	金灯柿	抗病	112	华中雄株10号	中抗	159	洛阳小红柿	中抗
19	河北农大牛心柿	高抗	66	长安烧柿	抗病	113	富平升底尖柿	中抗	160	凤山无核柿	中抗
20	长兴无名柿	高抗	67	户县火罐	抗病	114	阳朔牛心柿	中抗	161	早秋	中抗
21	藁城无名柿	高抗	68	花县小柿	抗病	115	大平顶柿	中抗	162	临潼尖顶柿	中抗
22	随洲早熟柿	高抗	69	上虞方柿	抗病	116	小柿（郑49）	中抗	163	秋艳	中抗
23	淄博大方柿	高抗	70	华中雄株9号	抗病	117	蜜蜜罐	中抗	164	富有	中抗
24	皇冠柿	高抗	71	胆柿	抗病	118	玉环长柿	中抗	165	晋城小柿	中抗
25	红灯笼	高抗	72	黄边小鸡心	抗病	119	祁阳盘柿	中抗	166	山柿	中抗
26	郧阳火柿	高抗	73	花御所	抗病	120	五河牛心柿	中抗	167	昌邑无名柿	中抗
27	大方柿	高抗	74	紫云团水柿	抗病	121	容县方柿	中抗	168	西条	中抗
28	嵊县方柿	高抗	75	七月鲜	抗病	122	抗病尖柿	中抗	169	康定	中抗
29	花县方柿	高抗	76	盐边渔门小柿花	抗病	123	圃杂4号	中抗	170	火晶	中抗
30	九华大方柿	高抗	77	眉县锅板柿	抗病	124	大丰牛心	中抗	171	新昌牛心	中抗
31	砧木小果	高抗	78	蓝田小干柿	抗病	125	古田水柿	中抗	172	小蒂柿	中抗
32	鲁山盖柿	高抗	79	铜山牛心柿	抗病	126	老门礅	中抗	173	苍山牛心柿	中抗
33	盐边和爱小柿花	高抗	80	大红柿	抗病	127	圃杂8号	中抗	174	溆浦腰带柿	中抗
34	西昌兴胜小柿花	高抗	81	杂2	抗病	128	台湾红柿	中抗	175	方柿	中抗
35	宿县牛心	高抗	82	圃杂1号	抗病	129	长沙盖柿	中抗	176	松本早生	中抗
36	合阳小牛心	高抗	83	宁波高方柿	抗病	130	正阳牛心柿	中抗	177	缙云黄柿	中抗
37	双肩重台柿	高抗	84	伏牛心	抗病	131	小广扁柿	中抗	178	都江堰干柿	中抗
38	长安重台柿	高抗	85	诏安水柿	抗病	132	尖顶小面糊	中抗	179	株洲水柿	中抗
39	华中雄株2号	高抗	86	徽县尖尖柿	抗病	133	长安火罐柿	中抗	180	松阳扁柿	中抗
40	华中雄株3号	高抗	87	潼关莲花	抗病	134	定远无名柿	中抗	181	东洋一	中抗
41	华中雄株8号	高抗	88	果糖柿	抗病	135	皇宝柿	中抗	182	泗洪方柿	中抗
42	朱罐罐	高抗	89	澄江无核柿	抗病	136	稷山蜜蜜罐	中抗	183	圆顶小面糊	中抗
43	东皋红柿	高抗	90	曲靖牛奶柿	抗病	137	辉县水柿	中抗	184	爱知早生	中抗
44	永嘉红柿	高抗	91	商城冬柿	抗病	138	会理青皮柿	中抗	185	正月	中抗
45	三原烧柿	高抗	92	杭州牛心柿	抗病	139	松阳水柿	中抗	186	杭州高方柿	中抗
46	兰田烧柿	高抗	93	保山大方柿	抗病	140	杂08	中抗	187	五花柿	中抗
47	留坝莲花柿	高抗	94	广州牛心柿	抗病	141	兰田火罐	中抗	188	兰田水柿	中抗
48	广州鸡心柿	高抗	95	峨眉板柿	抗病	142	雁过红	中抗	189	长沙火柿	中抗
49	成县尖尖柿	高抗	96	贡柿	中抗	143	晋城盖柿	中抗	190	大扁柿	中抗
50	小尖柿芽变	高抗	97	临潼青柿（92）	中抗	144	富平板柿	中抗	191	重台柿	中抗
51	富平辣椒尖柿	高抗	98	德阳方柿	中抗	145	宿迁扁柿	中抗	192	兴津	中抗
52	内丘台柿	高抗	99	洛阳鸡心柿	中抗	146	临潼板柿	中抗	193	青杵头	中抗
53	博爱八月黄	高抗	100	华中雄株11号	中抗	147	火罐	中抗	194	猪皮水柿	中抗
54	揭阳柿	高抗	101	凤翔水柿	中抗	148	南漳尖柿	中抗	195	西畴水柿	中抗
55	十月黄	高抗	102	大长柱柿	中抗	149	南靖扁柿	中抗	196	满城莲花柿	中抗
56	鲁山四瓣柿	高抗	103	华中雄株1号	中抗	150	宁波铜盆柿	中抗	197	面柿	中抗
57	句容柿	高抗	104	荥阳火罐	中抗	151	邢台台柿	中抗	198	老皮革	中抗
58	寻甸水柿	高抗	105	甜柿-1	中抗	152	方山柿	中抗	199	杂4	中抗
59	兰田社黄柿	高抗	106	博爱鬼脸青	中抗	153	兰田大方柿	中抗	200	面糊柿	中抗
201	海库曼	中抗	248	荷泽八月黄	感病	295	斤柿	感病	342	礼泉红柿	感病
202	甜宝盖	中抗	249	晚御所	感病	296	黎城方柿	感病	343	垣曲八月红	感病
203	夕红	中抗	250	大荔七月黄	感病	297	小红柿	感病	344	双沟柿	感病
204	牛头柿	中抗	251	舟曲牛心柿	感病	298	王后柿	感病	345	小方柿	感病
205	次郎	中抗	252	四沟柿	感病	299	番茄柿	感病	346	句容扁柿	感病
206	偃师牛心柿	中抗	253	富平大尖柿	感病	300	九月青	感病	347	大丰牛心柿	感病
207	郑29（升柿）	中抗	254	平山七月红	感病	301	凤阳无名柿	感病	348	洛阳水牛心	感病
208	荥阳陈沟灰柿	中抗	255	青果	感病	302	富贵柿	感病	349	会理红柿	感病
209	杵头柿	中抗	256	圃杂5号	感病	303	延津小水柿	感病	350	井陉盖柿	感病
210	火晶	中抗	257	甲洲圆	感病	304	圃杂11号	感病	351	富平尖柿	感病
211	怀胎柿	感病	258	西村早生	感病	305	鸡心黄	感病	352	缙云大柿	感病
212	胎里红	感病	259	壁山牛心柿	感病	306	正阳牛心	感病	353	黄冠柿	感病
213	平陆平顶柿	感病	260	兴义水柿	感病	307	大二糙	感病	354	小宝盖柿	感病
214	平核无	感病	261	稷山水柿	感病	308	新安牛心	感病	355	邳县牛奶柿	感病
215	澄江牛心	感病	262	杨嘴柿	感病	309	血柿	感病	356	黑熊	感病
216	舟曲火柿	感病	263	壶平柿	感病	310	泰安镜面	感病	357	长沙牛心柿	感病
217	甲洲百目	感病	264	临潼挂干柿	感病	311	荥阳平顶水柿	感病	358	井陉小柿	感病
218	圃杂3号	感病	265	临猗火柿	感病	312	保山水柿	感病	359	圃杂7号	感病
219	蜜罐柿	感病	266	天水方柿（苗）	感病	313	灯笼柿	感病	360	合阳牛心柿	感病
220	临潼鸡心黄	感病	267	柿砧-1	感病	314	四棱盖柿	感病	361	大火罐	感病
221	牛心柿	感病	268	宿县牛心柿	感病	315	岐山火罐	感病	362	海阳旗杆顶	感病
222	岐山水柿	感病	269	荥阳水柿	感病	316	红光辉	感病	363	保山烘柿	感病
223	大鳖盖柿	感病	270	十月红	感病	317	七月早	感病	364	眉县齐镇小牛心柿	感病
224	树头红	感病	271	阳丰	感病	318	怀抱月	感病	365	册亨水柿	感病
225	杂样景	感病	272	阳谷无名柿	感病	319	西畴火柿	感病	366	八月黄	感病
226	半夜甜	感病	273	孝义尖顶柿	感病	320	隆回软早	感病	367	沙谷2号	感病
227	荥阳八核柿	感病	274	户县马奶头	感病	321	鲁山牛心柿	感病	368	襄汾八月红	感病
228	三原鸡心黄	感病	275	堂上蜂屋	感病	322	华县帽盔柿	感病	369	刀根早生	感病
229	桔蜜柿	感病	276	花垣火柿	感病	323	新秋	感病	370	大面糊	感病
230	摘家烘	感病	277	冬丹柿	感病	324	裂御所	感病	371	改良牛心柿	感病
231	会津身不知	感病	278	新津柿	感病	325	秋尖顶	感病	372	孝义牛心	感病
232	实生柿-1	感病	279	水柿	感病	326	黎城小面糊	感病	373	长沙腰带柿	感病
233	荥阳灰柿	感病	280	盖柿（郑27）	感病	327	古桑柿	感病	374	杭州火柿	感病
234	藤八	感病	281	新安牛心柿	感病	328	砀山牛心柿	感病	375	车头柿	感病
235	伊豆	感病	282	沙河大方柿	感病	329	上西早生	感病	376	洋县尖顶柿	感病
236	旬阳牛心柿	感病	283	眉县青化马奶头	感病	330	四盘柿	感病	377	锅盖柿	感病
237	伏尖顶	感病	284	三原木柿	感病	331	五里江方柿03	感病	378	稷山板柿	感病
238	临潼社黄柿	感病	285	满堂红	感病	332	御所	感病	379	火柿	感病
239	临潼方柿	感病	286	永济木柿	感病	333	成县水柿	感病	380	凤台柿2号	感病
240	澄江牛心柿	感病	287	长沙莲花柿	感病	334	吊柿	感病	381	日本红柿	感病
241	兴隆柿	感病	288	小四瓣柿	感病	335	襄汾扁柿	感病	382	孝义牛心柿	感病
242	市田柿	感病	289	峨眉牛奶柿	感病	336	四方柿	感病	383	麻田方柿	感病
243	南京水柿	感病	290	小萼子	感病	337	沙谷1号	感病	384	金钱柿	感病
244	德阳盘柿	感病	291	偃师驴奶头	感病	338	曹县早四瓣	感病	385	闻喜平顶柿	感病
245	舟山长柿	感病	292	禅寺丸	感病	339	大秋	感病	386	红杵头	感病
246	大四瓣柿	感病	293	富阳方柿（03）	感病	340	正阳八核柿	感病	387	洛阳老杵头	感病
247	金瓶柿	感病	294	石家庄莲花柿	感病	341	都江堰水柿	感病	388	闻喜尖顶柿	感病
389	永济青柿	感病	412	新红柿	感病	435	郑1	高感	458	兰田水尖顶	高感
390	圃杂10号	感病	413	富平盘柿（唐陵）	感病	436	沙河火柿	高感	459	盘县水柿	高感
391	石杂1号	感病	414	德阳绵柿	高感	437	圃杂9号	高感	460	南漳杵头柿	高感
392	红柿	感病	415	丘北水柿	高感	438	柿某种	高感	461	眉县马奶头	高感
393	曲靖水柿2	感病	416	曹县水柿	高感	439	金堂干柿	高感	462	韩城牛心柿	高感
394	河西火罐	感病	417	郧阳罐罐	高感	440	郧阳大火罐	高感	野生近缘种
395	大叶水柿	感病	418	圃杂6号	高感	441	圃杂12号	高感	463	野柿子	抗病
396	老柿沟	感病	419	临潼牛心柿	高感	442	升柿	高感	464	江阴野柿	中抗
397	辉县小柿	感病	420	水镜面	高感	443	巴东牛心柿	高感	465	野柿	中抗
398	保康柿	感病	421	长安罐罐柿	高感	444	长沙水柿	高感	466	伏山野柿-01	感病
399	襄汾七月红	感病	422	凤翔尖顶柿	高感	445	长安伏尖顶	高感	467	石林软枣	高抗
400	晋城四瓣柿	感病	423	德阳冬柿	高感	446	眉县牛心柿	高感	468	富有软枣砧	中抗
401	望漠水柿	感病	424	户县尖顶柿	高感	447	华县白旋柿	高感	469	君迁子	感病
402	彬县尖顶柿	感病	425	月柿	高感	448	干帽盔	高感	470	油柿	高抗
403	长安秋蒸饼	感病	426	韩国盘柿	高感	449	贵秋	高感	471	油柿	抗病
404	扁塌塌	感病	427	老杵头	高感	450	藤原御所	高感	472	安溪油柿	中抗
405	大萼子	感病	428	乾县火柿	高感	451	眉县怀胎柿	高感	473	盘县油柿	感病
406	磨盘柿	感病	429	临猗平顶牛心柿	高感	452	清州无核	高感	474	杭州小油柿	感病
407	圃杂2号	感病	430	红富	高感	453	富平三角尖柿	高感	475	油柿子	感病
408	泾川尖顶柿	感病	431	骏河	高感	454	安溪牛心柿	高感	476	长果油柿	高感
409	辉县大柿	感病	432	长沙八月黄	高感	455	文县尖尖柿	高感	477	金枣柿	抗病
410	长安水柿	感病	433	户县大柿	高感	456	正阳尖顶柿	高感	478	缙云金枣柿	抗病
411	茅村牛心柿	感病	434	板柿	高感	457	旬阳牛柿	高感	479	松阳金枣柿	感病

序号462以后的种类为柿属野生近缘种，将其按顺序单独排列

Species after No. 462 are wild relatives of persimmon and will be listed separately in order

2.3 柿炭疽病病原菌分离及鉴定结果

从病叶、病枝和柿果中分离获得的菌株菌落形态相似，菌落均呈同心圆状生长，背面为灰色或灰褐色，还会伴有黑色斑点出现，正面大多为白色或灰色絮状绒毛型菌丝。显微镜下观察菌丝具隔膜，分支。分生孢子大小长×宽的范围为7.64~25.58 μm × 3.43~6.19 μm（n=100），呈圆柱形，两端钝圆，光滑透明。根据形态学特征观察分析，推测菌株为胶孢属炭疽病原菌（图4）。

图4 炭疽病菌落及孢子形态观察

Fig.4 Colonies and spore morphology of anthracnose disease

A、B：炭疽菌株在PDA平板上的形态特征；C：分生孢子形态；D：菌丝形态

A， B： Morphological characteristics of anthrax strains on PDA plates； C： Conidial morpho； D： Mycelium morphology

将纯化的菌株进行提取和检测，使用ITS、ACT、CHS、GAPDH、TUB2的引物进行PCR扩增，将测序结果提交至NCBI网站进行同源性比较分析，结果表明，5对引物扩增所获得的基因序列与C. horii炭疽菌相似度达99%以上，利用phylosuite软件进行序列串联，MEGA 7软件进行聚类分析，结果表明所分离菌株与C. horii C11801菌株关系最近（图5），表明分离的HGH-1菌株为C. horii炭疽菌。将代表性菌株HGH-1扩增序列上传至NCBI，序列号分别为ITS：OP946450、CHS：OP956549、TUB2：OP970834、ACT：OP956551、GAPDH：OP956550。

图5 系统发育树构建

Fig.5 Phylogenetic tree construction

图中斜体为菌株的种属，正体字母和数字为发现菌株者对其的命名

The italic in the diagram indicate the genera of the strains， and the block letters and numbers indicate the names given to the strains by the people who found them

2.4 致病性分析

选取从红光辉中分离出的3个菌株对富平尖柿进行田间致病性测定，结果表明，3株菌株接种的枝条均在接种后第5天开始发病，发病率为100%。接种的枝条发病初期出现小黑点，后呈同心圆式扩大，最终长成中间略微下凹的病斑，与田间自然发病症状相同，而对照组枝条未发病（图6）。从菌株接种发病枝条上再次进行病菌分离，经镜检后其形态与分离的哈锐（C. horii）菌株形态一致，根据科赫氏法则^［

34］，证明所分离菌株为哈锐炭疽菌C. horii。

图 6 致病性测试

Fig.6 Pathogenicity test

A~C：接种菌株枝条；D：对照

A‒C： Branches of the inoculation strain； D： Control

3 讨论

柿炭疽病由柿树炭疽病原菌（C. horii）引起，是危害柿果、枝条的主要病害之一，炭疽病的发生极大地影响柿产量，是柿产业发展中亟须解决的一个重要问题。目前对柿炭疽病的田间调查还缺乏系统的研究，本研究通过对国家柿种质资源圃内479份柿资源材料的抗性调查研究，制定了柿炭疽病抗性种质分类标准，总结了炭疽病的发病规律及特点，可为柿炭疽病抗性育种提供理论支持和实践依据。常见柿资源中，多数不抗炭疽病。本研究479份柿资源中高抗及抗种质分别有66和35份，如郧阳火柿、黄边小鸡心均较为抗病；中抗种质有119份；感病及高感资源合计达259份，占比较高。优异资源如华中雄株10号、成县尖尖柿等对于炭疽病有较强抗性，可以作为抗性育种的亲本，加速柿炭疽病抗性育种。对骏河等高感品种进行观察，发现在相同的管理条件下，甜柿品种多为高感品种或感病品种。根据前人研究，对柿果甜涩性状与转录组的关联分析得到32个SNP位点，其中DKsnp234075、DKsnp90928和DKsnp482415与植物抗性蛋白有关^［

35］，可能是导致甜柿多感病的原因，目前有关的研究还相对较少，若能较好的解决甜柿抗性问题，将会大大推动柿产业发展。通过对柿病原菌进行分离，综合菌落、菌丝、孢子形态特征及多基因序列比对，发现其为哈锐炭疽病原菌（C. horii），为柿炭疽病抗病机理的研究与防治奠定基础。

本研究在对柿炭疽病的抗性调查中，初步总结了炭疽病的发病规律：柿炭疽病主要侵染嫩枝，其次为果实，发病严重时叶片、萼片也会感染（资料未显示），并造成落叶及果实软化。柿炭疽病的防治应多方面共同进行，但总原则在于“防重于治”，从日常的果园栽培管理方面开始注意，及时清园，清除病原菌，增强修剪管理措施，控制果园通风透光条件，加强肥水管理，合理用药。本研究观察得出的病原菌特性、发病规律及不同部位的病原菌发病特征，可以为炭疽病防治提供参考借鉴，可依据炭疽病特性对发病柿树果园进行阶段性集中防治。

目前许多抗病品种尚未大面积推广栽培，在之后柿产业发展壮大过程中，可以优先筛选高抗品种进行推广；或将抗性品种作为育种亲本，进行杂交育种改良；对于易感品种，如富平尖柿等，也可以采用抗病砧木第二年嫁接，注意果园通风透光，可以较好地防控苗期炭疽病的蔓延，并缩短缓苗期增强树势。本研究制定了柿炭疽病抗性种质分类标准，对常见柿品种进行了抗性评价，筛选出一批高抗柿品种，为柿炭疽病抗性育种奠定资源基础。

4 结论

本研究依托国家柿种质资源圃，制定了柿炭疽病抗性种质分类标准，并通过田间调查统计的方式，初步对柿圃内479份柿资源的炭疽病抗性进行鉴定，共筛选出高抗种质66份（13.8%）、抗病种质35份（7.3%）、中抗种质119份（24.8%）、感病种质209份（43.6%）、高感种质50份（10.4%）。本研究分离了红光辉上的病原菌，通过形态比对和多基因序列比对，发现其为哈锐炭疽病原菌（Colletotrichum horii）。此外，在田间调查时对柿炭疽病的发病症状进行总结，为柿炭疽病的防治及抗性育种提供理论依据。

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