摘要
水稻种子粒型是影响产量的重要因素。GS3基因是水稻第一个被克隆的粒型基因，主要调控籽粒的粒长和粒重。GS3蛋白包含N端的OSR（Organ size regulation）和C端的Cys-rich功能结构域。GS3基因主要存在4种自然变异类型，分别为GS3-1至GS3-4。其中，GS3-1编码全长GS3蛋白；GS3-2编码的蛋白质插入1个氨基酸；GS3-3导致GS3完整蛋白缺失，表现为籽粒变长；GS3-4编码N端的OSR结构域，表现为籽粒明显变短。截至目前，在水稻自然变异中仍未发现仅编码C端的Cys-rich结构域的GS3变异类型，其对籽粒大小的调控也不清楚。本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在DNA序列两侧设计靶点删除大片段序列，创制出仅编码C端Cys-rich功能结构域的突变类型gs3-5，并获得纯合突变株系。与受体背景中花11相比，gs3-5纯合突变株系表现为粒长和千粒重增加。上述结果表明OSR结构域是GS3蛋白作为籽粒大小的负调控因子所必需的，为进一步解析OSR结构域对籽粒大小的调控以及探索新的育种改良方法提供了参考。
关键词
水稻（Oryza sativa L.）是世界上主要粮食作物之一，高产、稳产是水稻育种工作的主要目标。水稻产量由亩穗数、穗粒数和粒重三要素构成。粒重与籽粒大小正相关，因此籽粒大小影响着水稻产量。籽粒大小由粒长、粒宽、粒厚等因素决定。据报道，在分子水平上，籽粒大小主要受G蛋白信号、MAPK信号、泛素-蛋白酶体途径、激素信号和转录因子等在转录水平、转录后水平和翻译后水平等多层面精细调
G蛋白在细胞信号转导过程中发挥重要作用，参与植物一系列生长发育过程。因此，G蛋白相关研究一直是植物生长发育关注的热
在水稻中，Fan
图1 GS3蛋白自然变异类型结构示意图
Fig.1 Schematic structure of the natural variant type of GS3 protein
图形上方的数字表示在此处的氨基酸排列顺序； 白色斜框表示缺失氨基酸；下同
The number above the graphic indicates the order of the amino acids in this domain；The white diagonal boxes indicate the missing amino acids； The same as below
CRISPR/Cas9基因编辑技术的快速发展和应用为植物功能基因组研究和作物遗传改良提供了重要的技术保障。CRISPR/Cas9基因编辑技术具有操作简单、效率高等优势，目前已在拟南芥、水稻、小麦等多个植物中得到应用，可以实现基因敲除、染色体重组以及基因定点插入或替换
截止目前，GS3蛋白在转录水平、转录后水平和翻译后水平调控水稻籽粒大小的研究得到深入解
本研究以中花11（ZH11）为遗传转化受体，开展GS3基因编辑试验。ZH11的GS3基因单倍型属于GS3-2的类型，即在GS3基因3'末端插入3 bp，蛋白功能未受影响。获得的基因编辑后代材料于2021年和2022年种植于淮阴师范学院生命科技园试验田，种植管理同常规田间。其中，用于进行表型分析的遗传材料gs3-5不含Cas9等转基因元件。
根据水稻数据网站（https：//www.ricedata.cn/gene/）中GS3（Os03g0407400）的基因序列，在CRISPR-GE网站（http：//skl.scau.edu.cn/home/）设计一对靶
图2 靶点序列与位置信息
Fig.2 Target sequence and location information
浅灰色框代表5'UTR和3'UTR；深灰色框代表5个外显子，连接外显子的黑色线条表示内含子；PAM代表Cas9蛋白复合体结合位点
Light gray boxes represent 5'UTR and 3'UTR； Dark gray boxes represent 5 exons， black lines connecting exons indicate introns； PAM represents Cas9 protein complex binding sites
引物名称 Primer name | 引物序列（5'-3'） Primer sequences（5'-3'） | 用途 Application |
|---|---|---|
| SP1 | CCCGACATAGATGCAATAACTTC | 载体序列检测 |
| SP2 | GCGCGGTGTCATCTATGTTACT | |
| gs3-F | GATCATCTCCATTATCGGAAC | GS3靶位点变异分析 |
| gs3-R | CGAAGGAGTATGAATGGTAGTG | |
| M13F | TGTAAAACGACGGCCAGT | 单克隆测序检测 |
| M13R | CAGGAAACAGCTATGACC | |
| pGADT7-GS3-F | GGAATTCCATATGATGGCAATGGCGGCGGCGCC | 构建载体pGADT7-GS3 |
| pGADT7-GS3-R | CGAGCTCGTCACAAGCAGGGGGGGCAGC | |
| pGADT7-GS3.2-F | GGAATTCCATATGATGGCAATGGCGGCGGCGCC | 构建载体pGADT7-GS3.2 |
| pGADT7-GS3.2-R | CGAGCTCGTCAAGAAGTGGTGAGAATGATCAT | |
| pGADT7-GS3-5-F | GGAATTCCATATGATGGCAATGGCGGCGGCGCC | 构建载体pGADT7-GS3-5 |
| pGADT7-GS3-5-R | CGAGCTCGTCACAAGCAGGGGGGGCAGC | |
| pGBKT7-RGB1-F | GGAATTCCATATGATGGCGTCCGTGGCGGAG | 构建载体pGBKT7-RGB1 |
| pGBKT7-RGB1-R | GCGTCGACTCAAACTATTTTCCGGTGTCCGCT | |
| T7 | TAATACGACTCACTATAGGG | 菌体PCR鉴定 |
| 3-AD | AGATGGTGCACGATGCACAG |
参照TIANGEN的植物基因组DNA提取试剂盒（Cat.#DP305-03）说明书提取ZH11和基因编辑后代幼苗DNA。参照TIANGEN多糖多酚植物总RNA提取试剂盒（Cat.#DP441）说明书提取水稻幼苗总RNA。参照TaKaRa的PrimeScrip
设计靶位点检测引物gs3-F和gs3-R（
根据GS3基因CDS序列并结合多克隆位点及酵母载体阅读框，通过软件OMIGA分析设计引物对pGADT7-GS3-F/pGADT7-GS3-R、pGADT7-GS3.2-F/pGADT7-GS3.2-R、pGADT7-GS3-5-F/pGADT7-GS3-5-R、pGBKT7-RGB1-F/pGBKT7-RGB1-R（
将重组质粒pGADT7-GS3、pGADT7-GS3.2、pGADT7-GS3-5分别与pGBKT7-RGB1共转酵母感受态细胞，并将转化产物均匀涂布在SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基上，于30 ℃生化培养箱倒置培养5 d，至菌落长出。挑取SD/-Trp/-Leu营养缺陷型培养基上单克隆酵母菌落划线于SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade营养缺陷型培养基生长，观察生长情况。随后，挑取SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade生长的酵母菌落接种于SD/-Trp/-Leu液体培养基中，30 ℃ 200 rpm摇床中震荡培养16 h，调菌液OD≈0.6进行梯度稀释生长观察。
根据单奇伟
选取10株T0代基因编辑株系分别命名为gs3-1至gs3-10，提取其DNA并以此为模板，利用引物gs3-F和gs3-R扩增T0代基因编辑株系的靶位点序列，发现gs3-1、gs3-6、gs3-8、gs3-9和gs3-10株系扩增的条带大小接近野生型ZH11中GS3基因大小（198 bp），gs3-2、gs3-3、gs3-4和gs3-7扩增片段不单一，gs3-5扩增片段明显小于目的片段（
图3 gs3突变体株系靶位点变异分析
Fig.3 Analysis of target locus variation in gs3 mutant strains
A：10株基因编辑阳性水稻靶位点PCR电泳图，1~10分别对应gs3-1至gs3-10，M为DNA marker 2000；B：gs3-1~gs3-10突变株系测序结果示意图，红色字体表示靶点序列，蓝色字体表示插入碱基，—表示缺失碱基，ZH11表示水稻品种中花11的GS3序列，10株基因编辑株系均以ZH11为转化背景
A：PCR detection of the target loci in 10 editing lines， 1‒10 represent gs3-1 to gs3-10 respectively， M： DNA marker 2000； B： Sequencing results of gs3-1~gs3-10 mutant strains，red font indicates target sequences， blue font indicates insertion bases， - indicates deletion bases ， ZH11 represents the GS3 sequence of the rice variety Zhong Hua 11， and all 10 editing lines were transformed with ZH11 as the background
上述靶位点突变均位于GS3蛋白的OSR结构域。值得注意的是，gs3-5突变体植株缺失57 bp，不会造成移码突变（
图4 GS3-5新型变异蛋白功能验证
Fig.4 Functional validation of GS3-5 novel variant protein
A：GS3、GS3.2和GS3-5蛋白结构示意图；B：酵母菌落在四缺培养基划线生长5 d情况，标尺：1 cm；C：OD值均为0.6的酵母菌在四缺培养基生长2 d情况，标尺：1 cm
A： Schematic structure of GS3， GS3.2 and GS3-5 proteins；B： Yeast colonies in four-deficient medium delineated for 5 days of growth， Bar： 1 cm； C： Saccharomyces cerevisiae with OD values of 0.6 were grown in four-deficiency medium for 2 days， Bar： 1 cm
混提gs3-5突变体的水稻幼苗叶片DNA进行PCR鉴定，结果显示gs3-5突变体的扩增片段明显小于对照，表明gs3-5突变体为纯合突变（
图5 gs3-5表型鉴定
Fig.5 Identification of gs3-5 phenotype
A：gs3-5纯合体鉴定胶图；1：gs3-5电泳条带；2：ZH11电泳条带；M：DNA Maker 2000；B：gs3-5纯合体测序图，Y字型标志表示缺失碱基位置，Y字型标志上方表示缺失碱基序列；C：gs3-1纯合体测序图，黑色框处表示插入碱基及所在位置；D：gs3-6纯合体测序图，Y字型标志表示缺失碱基位置，Y字型标志上方表示缺失碱基序列，黑色框处表示插入碱基及所在位置；E：ZH11和gs3-1、gs3-6、gs3-5粒长表型观察，标尺：1 cm；F~M：利用t检验对ZH11和gs3-1、gs3-6、gs3-5在粒长、粒宽、千粒重、分蘖数、每穗粒数、单株产量、株高和抽穗期进行统计分析；ns：差异不显著；*，**，***：分别在P<0.05，P<0.01，P<0.001水平上差异显著
A： gs3-5 homologous mutant identification gel chart； 1： gs3-5 electrophoresis bands； 2： ZH11 electrophoresis bands； M：DNA Maker 2000； B： Sequencing diagram of gs3-5 homologous mutant， the Y marker indicates the position of the missing base， and above the Y marker indicates the sequence of the missing base； C： Sequencing diagram of the gs3-1 homologous mutant， black boxes indicate inserted bases and their locations； D： Sequencing diagram of gs3-6 homologous mutant， the Y marker indicates the position of the missing base， above the Y marker indicates the sequence of the missing base， the black box indicates the inserted base and its location； E： ZH11 and gs3-1， gs3-6， gs3-5 grain length phenotype observation， Bar：1 cm； F-M： Statistical data of ZH11 and gs3-1， gs3-6 and gs3-5 in terms of grain length， grain width， 1000-grain weight， tiller number， grain number per panicle， grain yield， plant height and days to heading； ns：Not significant； *， * *， * *： Significant differences at the levels of P<0.05， P<0.01， and P<0.001， respectively
综合上述结果，表明GS3蛋白OSR结构域功能丧失突变体gs3-5与ZH11相比，其粒长和千粒重均明显增加，表明OSR结构域是GS3发挥负调控功能的必要条件。
GS3基因是水稻中第1个被克隆的控制粒型和千粒重的主效位点，编码植物特有的Gγ亚基。GS3蛋白由N端的OSR结构域和C端的Cys-rich结构域组
本研究利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在第1个外显子区域设计靶点创制GS3功能结构域新种质（
通过生物工程手段创制新型种质已获得广泛认可。基因编辑CRISPR/Cas系统的发现和应用为高效基因敲除提供了有力工具。随着CRISPR/Cas系统的发展，基因敲除、定点突变、大片段删减等编辑方式也被广泛应用，使得种质创新更为稳定、精准、高效和安全。为有效地删除大片段碱基序列，可以在目标DNA序列的两侧分别设计靶点，以达到将目标序列删除的目
本研究通过在DNA片段两端设计靶位点，利用CRISPR/Cas9基因编辑技术成功删除了目的基因大片段碱基序列，证实了该方法的可操作性。同时，利用该方法创制了GS3蛋白N端OSR结构域功能丧失、C端Cys-rich结构域功能保留的新种质，证明了OSR结构域是GS3发挥负调控功能的必要条件，丰富了GS3负调控水稻粒型的分子机理的理论知识。
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