玉米愈伤组织形成的转录组分析

贾思年; 魏倩涵; 苗蓉; 彭云玲; 刘允军; JIA Si-nian; WEI Qian-han; MIAO Rong; PENG Yun-ling; LIU Yun-jun

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玉米愈伤组织形成的转录组分析 PDF

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贾思年 ^1,2
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刘允军 ²
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1. 甘肃农业大学农学院 / 省部共建干旱生境作物学国家重点实验室 / 甘肃省作物遗传改良与种质创新重点实验室，兰州 730070； 2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081

最近更新：2023-06-14

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20221217002

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摘要

玉米遗传转化受体主要是未成熟幼胚，经过组织培养形成胚性愈伤组织，进而分化成苗。目前，对玉米胚性愈伤组织形成的分子机理的了解还不深入。为了挖掘调控玉米胚性愈伤组织形成的基因，本研究选取玉米自交系CAL28×郑58的F₃群体中不同表型的愈伤组织进行RNA-seq分析。与愈伤发生差的II型愈伤相比，愈伤发生好的I型愈伤中共检测到4419个差异表达基因，其中1571个基因上调，2848个基因下调。GO富集分析结果表明，差异表达基因主要富集在细胞过程、催化活性、细胞组分等通路中。KEGG富集分析表明，差异表达基因主要富集在苯丙烷生物合成途径和植物激素信号转导途径。在生长素早期响应基因中，8个AUX/IAA家族基因，如IAA23、IAA33、IAA41，和4个GH3家族基因在I型愈伤中上调表达。差异显著基因中共有隶属56个转录因子家族的2968个转录因子，其中与愈伤形成相关的AP2、WOX和LBD转录因子家族基因中的ZmEREB53、ZmEREB206、ZmEREB184、ZmLBD10、ZmLBD24、ZmLBD31、ZmLBD32、ZmWOX5b、ZmWOX9b等在Ⅰ型愈伤中的表达量显著上调，对这些靶标基因进行遗传操作有可能促进玉米愈伤组织形成。本研究发现的靶标基因具有较大的应用潜力，研究结果也为解析玉米愈伤组织形成的分子机理提供了理论参考。

关键词

玉米; 愈伤形成; 转录组测序; 激素信号转导; 转录因子

玉米是我国重要的粮食作物、工业原料和饲料作物，但随着我国畜牧业和玉米加工业的发展，常规玉米遗传育种已经不能满足我国社会和经济发展需求。转基因育种提供了一种新的解决方案，可以赋予玉米品种新的性状，促进玉米产业方式升级。高效遗传转化技术是转基因育种的前提，目前，农杆菌转化法和基因枪法是玉米遗传转化主要采用的技术，一般需要愈伤组织培养和植株再生过程。在玉米遗传转化过程中，基因型是限制愈伤形成的主要因素^［

1-3］。目前，转化受体主要是使用未成熟的胚^{［参考文献 4-6}4-6］，但只有少数的玉米自交系具有高效诱导愈伤的能力^{［参考文献 7-8}7-8］。解析玉米愈伤形成的分子机理，将为提升玉米遗传转化效率提供理论支撑。

在拟南芥等双子叶植物中的研究表明生长素和细胞分裂素在诱导愈伤形成过程中必不可少，生长素响应因子（ARF）下游的LBD16、LBD17、LBD18和LBD29在拟南芥愈伤组织形成中发挥着重要作用，4个LBD基因异位表达可以促进拟南芥愈伤发生^［

9-11］。组蛋白去甲基化酶JMJ30通过与ARF7和ARF19形成ARFs-JMJ30复合物，对LBD16和LBD29启动子区H3K9me3去甲基化，激活LBD16和LBD29的转录，促进愈伤组织形成^{［参考文献 12

百度学术}12］。体细胞胚胎发生由生长素诱导的WUSCHEL（WUS）基因所调控^{［参考文献 13-15}13-15］，WOX5主要的表达部位是拟南芥根干细胞区域，也在愈伤发生和植株再生中发挥重要作用^{［参考文献 16

百度学术}16］。B类拟南芥反应调节因子ARR1（Arabidopsis response regulators 1）基因的表达与细胞分裂素水平相关，过表达ARR1可以促进愈伤组织的形成^{［参考文献 17

百度学术}17］。miR160通过切割靶标基因ARF10，激活细胞分裂素响应因子ARR15的表达，抑制愈伤组织的形成^{［参考文献 18

百度学术}18］。在不含外源细胞分裂素的培养基中，过表达磷酸化结构域缺失的ARR1或ARR21基因可以直接诱导拟南芥愈伤组织的形成^{［参考文献 19

百度学术}19］。

目前对于玉米愈伤组织形成机理的研究相对较少，需要深入解析玉米愈伤形成机制。Armstrong等^［

20］通过回交转育将自交系A188的染色体片段导入到自交系B73和Mo17中，提高了B73和Mo17胚性愈伤组织的形成和植株再生能力。Krakowsky等^{［参考文献 21

百度学术}21］利用H99和Mo17杂交后的125个重组自交系作为群体，鉴定到胚性愈伤诱导率相关的8个主效QTL和3个上位性QTL。张红伟等^{［参考文献 22

百度学术}22］利用自交系黄早四和Mo17为亲本组配群体，构建101个SSR标记的玉米遗传连锁图谱，鉴定出8个与胚性愈伤组织诱导率和植株再生频率相关的QTL。Salvo等^{［参考文献 23

百度学术}23］将WCIC与B73回交，通过表型和分子标记选择，鉴定到1个位于玉米3号染色体上与胚胎发生相关的QTL，并选育出1个胚胎发生和再生能力比B73高50多倍的双单倍体材料WCIC2。玉米基因组中有91个SAUR（Small auxin-up regulated RNA）基因^{［参考文献 24

百度学术}24］，Wang等^{［参考文献 25

百度学术}25］发现ZmSAUR15启动子区变异造成不同玉米自交系胚性愈伤组织诱导率差异，ZmSAUR15通过调控内源生长素IAA的合成负向调控玉米胚性愈伤组织的形成。

为了解析玉米愈伤发生的分子机理，本研究利用RNA-seq技术，对两个愈伤诱导能力差异较大的自交系CAL28和郑58构建的分离群体F₃诱导的Ⅰ型（愈伤生长好）、Ⅱ型（无愈伤生成）愈伤进行转录组测序分析，鉴定到一些重要差异表达基因，研究结果将对解析玉米愈伤形成的分子机理提供重要理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究利用愈伤诱导能力好的自交系CAL28和愈伤诱导能力差的自交系郑58杂交，F₁植株于2020年冬种植于海南三亚，2021‒2022年在北京种植F₂植株，取自交授粉后的F₃果穗剥取幼胚，在诱导胚性愈伤组织培养基上继代3~4次（生长4~6周）后，对玉米幼胚生长表型进行鉴定。

1.2 玉米愈伤组织的诱导

取授粉后时间10~12 d的玉米穗，使用75%的酒精灭菌处理，去除玉米穗两端发育有差异的部位，在穗中间均匀取胚，幼胚大小约为1.2~1.5 mm。放置在NB培养基（4.1 g/L NB培养基（Phytotech，货号N492），1 mL/L 1000×维生素，0.7 g/L脯氨酸，0.5 g/L酪蛋白，10 g/L葡萄糖，20 g/L蔗糖，2 mg/L 2，4-D，10 mg/L硝酸银，3 g/L植物凝胶）中，28 ℃暗培养1周后，及时切除幼芽。每两周继代一次，继代2至3次。此时部分幼胚形成愈伤，生长状况较好。将诱导的愈伤分为3种类型，Ⅰ型（愈伤生长良好）、Ⅱ型（无愈伤生成）、Ⅲ型（部分愈伤生成）。取Ⅰ型、Ⅱ型愈伤进行后续试验。

1.3 总RNA提取

分别取30个I型和II型愈伤进行混池，共3个生物学重复，使用天根生化科技有限公司的植物总RNA提取试剂盒（DP452）提取愈伤组织总RNA。利用1%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000c型分光光度计检测检测RNA的质量及浓度。RNA高通量测序由安诺优达基因科技（北京）有限公司建库及测序。测序平台为Illumina NovaSeq 6000，测序数据量为6 G。

1.4 转录组数据分析

对原始数据进行处理，过滤低质量Reads，去除接头污染的Reads以及含N（高未知碱基）比例大于5%的Reads。使用HISAT2（转录本拼接比对的分层索引）将Clean reads比对到参考基因组B73 RefGen_v4（B73 RefGen_v4-Genome-Assembly-NCBI）。利用DESeq2进行基因差异表达分析，通过FPKM（Fragments per kilobase per million mapped fragments）值^［

26］计算基因的表达量，同时将基因表达量小于0.01的视为不表达。差异基因筛选主要参考差异倍数（Fold change值）以及q值（矫正之后的p-value值）作为相关指标，去除I型和II型两组中FPKM<2的转录本，使用VENNY2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）在线软件对I型和II型愈伤组织中特异表达的转录本进行分析，同时选取|log2 Fold change|≥1和q<0.05的差异基因作为显著差异基因。

1.5 GO和KEGG富集分析

为了了解差异表达基因（DEGs， differentially expressed genes）的生物学功能，本研究对差异显著基因进行了Gene Ontology（GO）富集分析和KEGG分析，应用超几何检验进行富集分析，通过计算得到p-value值，通过校正之后，以FDR<0.05为阈值，找出差异表达基因中显著性富集的GO条目和代谢通路，从而确定差异表达基因的生物学功能。

1.6 qRT-PCR验证

为验证转录组测序的可信性，随机选取10个差异显著基因进行验证，GADPH（Zm00001d049641）作为内源基因对照。使用Primer 3.0设计引物，引物列表见表1。将1.0 μL cDNA、10.0 μL 2× SYBR qPCR Master Mix、0.4 μL 0.4 μmol/L的正、反向引物、ddH₂O预混合至20.0 μL的反应体系中，各设3个生物学重复，3个技术重复。使用荧光定量7500PCR系统进行实时荧光PCR分析，以2^-ΔΔ^C^t方法计算基因的表达量。使用EXCEL对转录组测序数据及qRT-PCR进行相关性分析。

表1 用于qRT-PCR分析的10个差异表达基因及其引物

Table 1 Primers used for qRT-PCR analysis of ten maize DEGs

引物名称 Primer name	正向引物（5'-3'） Forward primer （5'-3'）	反向引物（5'-3'） Reverse primer （5'-3'）
Zm00001d028195	GACTACCGATGAACCCGAGT	TTCCTGTTGCCTCTCCCATT
Zm00001d020627	GACCTCAACTACCCGTCCTT	CTTGCCGGCTTGACTCTAAC
Zm00001d035323	CCAATTGCCCGGTCAAGAAA	CCTGATCTCTCTTGGCAGCT
Zm00001d020623	GCCGCTTTCTACCAGTACCT	GCGGGATGATGGAGGAGG
Zm00001d020622	CTGGGTTGGTTTGTGGACTG	CATCATGACCACCACCGTTC
Zm00001d020620	GCAGGGAAGAAAAGGAGCAC	AGGCACTCGTCGATCTCTTT
Zm00001d020618	GTCATCTATCGCCCATCCCA	GCGTTGCGATCAGATCACTT
Zm00001d020617	CTCTCCGATATGCTGCCTGA	CACTGGAGTCTTGGATGGGT
Zm00001d020615	ATACACGGCCAAGACCTGAA	GCAGTCGTACGTGTGAAGAG
Zm00001d020614	AGCTGACCATCTTCTACGGC	ACTGTCGTGTGAAGGCCTAG
GAPDH	CCCTTCATCACCACGGACTAC	AACCTTCTTGGCACCACCCT

2 结果与分析

2.1 表型鉴定

自交系CAL28与郑58的幼胚愈伤发生能力具有明显差异，CAL28×郑58的F₃幼胚诱导愈伤生成3种不同的表型，Ⅰ型（愈伤生长良好）、Ⅱ型（无愈伤生成）、Ⅲ型（部分愈伤生成）。本研究共取5000个玉米幼胚，在NB培养基上诱导愈伤组织形成。在诱导过程中，249个胚发生污染，形成的Ⅰ型、Ⅱ型愈伤数量分别为720和600个，Ⅲ型愈伤数量为3351个（图1）。

图1 CAL28×郑58 F₃幼胚愈伤发生类型

Fig.1 Callus formation of CAL28×Zheng58 F₃ embryos

玉米幼胚在NB培养基中诱导愈伤生成；A：Ⅰ型愈伤；B：Ⅱ型愈伤；C：Ⅲ型愈伤；D：不同类型愈伤组织数量

Callus was induced from maize embryos cultured on NB medium； A： Type Ⅰ callus； B： Type Ⅱ callus； C： Type Ⅲ callus； D： Numbers of different types of callus

2.2 转录组测序（RNA-seq）及分析

选取I型和II型愈伤，利用Illumina NovaSeq 6000进行转录组测序。测序共获得52.0 G数据量，Clean reads数量在41，308，494~80，526，076之间。Q30反应测序的碱基质量水平，6个样品的Q30平均为95.09%，表明测序质量良好。HISAT2将Clean reads比对到参考基因组B73 RefGen_v4，其比对率均大于80%以上（表2）。利用FPKM计算差异显著基因的表达水平，利用spearman相关系数评估样本各个重复之间的相关性系数均高于0.9，表明测序数据的可重复性良好。

表2 转录组数据统计表

Table 2 Statistics of all the samples of sequencing data

样品 Sample	原始序列数Raw reads	过滤后序列数 Clean reads	比对序列数 Mapped reads	未比对序列数 Unmapped reads	过滤Q30百分比（%） Clean Q30 bases rate	基因总数 Total gene number
I-1	43，892，928	41，308，494	37，512，326	3，796，168	95.10	29，467
I-2	51，276，054	47，596，956	40，316，465	7，280，491	94.87	29，091
I-3	48，142，508	45，440，942	41，309，275	4，131，667	94.45	29，232
II-1	47，081，186	44，782，888	39，157，345	5，625，543	94.92	29，391
II-2	86，039，832	80，526，076	72，712，609	7，813，467	95.37	30，231
II-3	70，264，984	64，305，656	57，970，103	6，335，553	95.09	30，012

I-1、I-2、I-3代表I型愈伤的3个生物学重复；II-1、II-2、II-3代表II型愈伤的3个生物学重复

I-1，I-2，I-3 indicate the three biological repeats of type I calli； II-1，II-2，II-3 indicate the three biological repeats of type II calli

2.3 玉米愈伤形成相关差异显著基因分析

为了研究影响玉米愈伤形成基因的表达情况，利用FPKM计算基因的表达量，对Ⅰ型、Ⅱ型愈伤中转录本表达进行分析，转录本表达量小于0.01视为不表达。共有28，661个转录本表达，其中在I型愈伤中有912个基因特异性表达，II型愈伤中共有1600个基因特异性表达（图2A）。同时去除I型和II型两组中FPKM<2的转录本，设定筛选标准为|log2 Fold change|≥1和q<0.05为差异显著基因的阈值。与II型愈伤相比，Ⅰ型愈伤共有4419个差异表达基因，其中1571个基因上调，2848个基因下调，下调的基因数量大于上调基因的数量（图2B）。

图2 愈伤中的转录本分析

Fig.2 Analysis of the transcripts in the calli

A：转录本数目韦恩图；数字表示Ⅰ型和Ⅱ型愈伤中特异转录本数量；B：差异表达基因火山图

A： Venn diagram of unigene numbers； Numbers indicate the specific transcript numbers in type I and II callus tissue； B： Volcano map of DEGs

2.4 qRT-PCR验证差异显著基因的可靠性

为了验证转录组测序的可靠性，随机选取10个参与不同生物学过程的差异显著基因进行qRT-PCR。检测在不同愈伤组织中基因的表达量，以Ⅰ型中基因的表达量为1，统计II型愈伤中各基因的相对表达，使用EXCEL软件分析RNA-seq的结果与qRT-PCR结果，结果表明R²大于0.9，RNA-seq的结果与qRT-PCR结果一致，RNA-seq的结果可用于后续分析（图3）。

图3 差异显著基因的RAN-seq和qRT-PCR结果相关性分析

Fig.3 Correlation analysis of the expression changes of ten DEGs as revealed by RNA-seq and qRT-PCR

散点表示基因相对表达量的 log2 转化值

Scatter plots indicate the log2 transformed gene expression values

2.5 玉米愈伤形成相关差异显著基因的GO富集分析

基于注释基因库，将鉴定到的差异显著基因进行GO富集分析，发现生物过程中GO富集到的差异显著基因主要参与细胞过程（Cellular process）和代谢过程（Metabolic process）等。分子功能中GO富集到的差异显著基因主要参与催化活性（Catalytic activity），结合（Binding）等。在细胞组分中GO富集到的差异显著基因主要参与细胞组分（Cell part），细胞器合成（Organelle）等途径（图4）。这些显著富集GO条目，对玉米愈伤组织的形成机制有着重要的意义。

图4 差异显著基因的GO富集分析

Fig.4 Gene Ontology enrichment analysis of DEGs

2.6 影响玉米愈伤形成差异显著基因的KEGG富集分析

为了挖掘影响玉米愈伤发生的候选基因，通过KEGG方法分析差异表达基因参与的生化代谢途径，以明确差异显著基因在愈伤形成过程中的功能。差异显著基因主要富集在植物激素信号转导（Plant hormone signal transduction）、苯丙烷类生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）、异黄酮生物合成（Isoflavonoid biosynthesis）、牛磺酸和次牛磺酸代谢（Taurine and hypotaurine metabolism）及类胡萝卜素生物合成（Carotenoid biosynthesis）等5个代谢通路中，表明这些代谢通路可能是调控玉米愈伤形成的重要代谢途径（图5）。

图5 差异显著基因的KEGG富集分析

Fig.5 Enriched KEGG pathways of DEGs

仅列出前10个显著富集的 KEGG pathway

Only top ten most enriched KEGG pathways are listed

2.6.1 植物激素信号转导相关差异表达基因

植物激素信号转导途径是差异显著基因富集数最多的途径，植物激素在植物体细胞胚诱导中发挥重要作用。在本研究中，共有87个差异显著基因参与植物激素信号转导途径，其中27个基因发生上调，60个基因发生下调，表明玉米愈伤发生与植物激素信号转导的关系密不可分。15个基因被注释为茉莉酸ZIM结构域蛋白（JAZ），1个呈上调表达，14个呈下调表达，其中ZIM29（Zm00001d014249）表达量上调4.50倍。11个基因注释为生长素响应蛋白（Aux/IAA），8个上调表达，3个呈下调表达，其中IAA23（Zm00001d016277）、IAA33（Zm00001d021279）和IAA41（Zm00001d045203）表达量分别上调7.53、23.75和7.73倍。9个基因被注释为SAUR生长素响应家族，均下调表达。4个基因为生长素响应基因GH3家族，均上调表达，其中Zm00001d010697表达量上调25.66倍。

2.6.2 苯丙烷类生物合成途径相关差异表达基因

苯丙烷类生物合成途径是差异显著基因富集程度最高的代谢通路，表明该调控途径对玉米胚性愈伤组织形成具有重要作用。有研究表明，苯丙类的生物合成会加速愈伤褐化，对愈伤生长和再次分化具有负向调节作用^［

27］。本研究中有69个基因参与到苯丙烷的生物合成途径，其中有15个基因发生上调、54个基因发生下调。过氧化物酶（POD，peroxidase）中，12个上调表达，30个下调表达，过氧化物酶PRX12（Zm00001d002898）和PX18（Zm00001d002899）表达量上调均大于6.0倍；4-香豆酸辅酶A连接酶（4CL， 4-coumarate：coenzyme A ligase）中，1个上调表达，4个下调表达；肉桂酰辅酶A还原酶（CCR， cinnamoyl CoA reductase）中4个差异表达基因均呈下调表达；3个咖啡酰莽草酸酯酶（CSE， caffeoylshikimate esterase），1个上调表达，2个下调表达；8个β-葡萄糖苷酶（β-D-Glucosidase）、2个莽草酸羟基肉桂酰基转移酶（HCT， shikimate O-hydroxycinnamoyltransferase）、2个阿魏酸-5-羟化酶（F5H， ferulate 5-hydroxylase）、1个香豆酸-3-羟化酶（C3H， coumarin-3-hydroxylase）、1个肉桂醇脱氢酶（CAD， cinnamoyl alcohol dehydrogenase）均下调表达；松柏醛脱氢酶（coniferyl-aldehyde dehydrogenase）只有1个，呈上调表达。

2.7 愈伤形成相关转录因子的鉴定

差异显著基因中共有2968个转录因子，隶属56个转录因子家族，其中1093个上调，1875个下调。包括310个bHLH（Basic helix-loop-helix）转录因子、193个WRKY转录因子、163个ERF（Ethylene responsive factor）、152个NAC（NAM、ATAF1/2、CUC1/2 NAC）、123个MYB（v-myb avian myeloblastosis viral oncogene homolog）和46个ARF转录因子等（图6A）。进一步对差异表达转录因子上下调基因数目进行分析，发现73%AP2家族转录因子上调表达，27%下调表达，WOX转录因子家族差异表达基因上下调比例相同，其余下调差异表达基因均大于上调（图6B）。与愈伤形成相关的AP2、WOX和LBD等转录因子家族基因显著富集，其中ZmLBD10、ZmLBD24、ZmLBD31、ZmLBD32表达量均显著上调6.0倍以上；ZmEREB53（ZmBBM2）、ZmEREB206（ZmBBM）和ZmEREB184表达量分别上调8.18、9.04和9.76倍，ZmEREB172在Ⅱ型愈伤中特异表达且表达量较高；ZmWOX5b、ZmWOX9b表达量上调均大于5.0倍（表3）。

图6 差异表达转录因子分析

Fig.6 Analysis of the differentially expressed transcription factors

A：转录因子家族种类和数量； B：转录因子上下调表达的比例

A： Pie chart showing the type and number of transcription factors； B： Up-down ratio of transcription factors

表3 AP2、LBD和WOX转录因子家族中重要基因的表达量变化

Table 3 Expression change of some genes belonging to AP2、LBD and WOX transcription factors

基因编号Gene ID	基因注释Gene annotation	基因表达量（平均） Gene expression （average）		上调/下调Up/Down
基因编号Gene ID	基因注释Gene annotation	Ⅰ	Ⅱ	上调/下调Up/Down
Zm00001d031796	ZmEREB172	0	82.00	下调
Zm00001d002025	ZmEREB24	149.47	65.05	上调
Zm00001d042492	ZmEREB53（ZmBBM2）	12.02	1.33	上调
Zm00001d034204	ZmEREB184	4.00	0.41	上调
Zm00001d017207	ZmEREB206 （ZmBBM）	54.30	6.64	上调
Zm00001d027678	ZmLBD1	6.89	2.87	上调
Zm00001d028721	ZmLBD4	7.76	2.37	上调
Zm00001d033335	ZmLBD10	3.46	0.54	上调
Zm00001d043036	ZmLBD20	6.82	1.82	上调
Zm00001d051891	ZmLBD24	11.16	1.81	上调
Zm00001d038013	ZmLBD31	8.58	0.77	上调
Zm00001d038197	ZmLBD32	2.95	0.49	上调
Zm00001d047921	ZmLBD42	7.76	2.37	上调
Zm00001d029506	ZmLBD5	22.44	153.82	下调
Zm00001d038717	ZmLBD33	10.34	251.78	下调
Zm00001d010751	ZmLBD38	4.64	129.69	下调
Zm00001d047752	ZmLBD41	1.78	3.37	下调
Zm00001d047559	ZmWOX11	1.80	4.03	下调
Zm00001d042821	ZmWOX5b	7.86	1.43	上调
Zm00001d043937	ZmWOX9b	2.67	0.53	上调

3 讨论

玉米转基因育种的困难之一是受体材料形成愈伤的能力^［

28］，目前只有少数玉米自交系可以高效诱导胚性愈伤组织的形成。本研究利用高通量RNA-seq技术对玉米自交系CAL28×郑58的F₃幼胚诱导的Ⅰ型、Ⅱ型愈伤进行转录组测序。通过转录组分析玉米愈伤组织形成相关基因表达及基因调控路径和网络，以挖掘控制玉米愈伤组织形成的候选基因，有助于解析玉米愈伤组织形成的分子机理。

植物激素信号转导途径在愈伤组织形成中起着重要的调控作用，研究表明植物胚性细胞的发生受植物生长素、细胞分裂素、茉莉酸等激素信号共同调节^［

29-30］。通过调控内源生长素IAA的合成，可以影响生长素信号转导，从而调节玉米愈伤组织中胚性细胞的诱导^{［参考文献 25

百度学术}25］。拟南芥中细胞分裂素主要通过B型ARR转录因子的调控影响愈伤生成，过表达ARR1可以增强拟南芥愈伤组织的形成^{［参考文献 17

百度学术}17，31］。茉莉酸（JA）在伤口诱导植株再生中也发挥着重要的作用，JA可以激活ERF109和下游基因CYCD6；1，从而促进植株再生^{［参考文献 32

百度学术}32］。在本研究中，共有15个茉莉酸ZIM结构域蛋白基因差异性表达，ZIM29在Ⅰ型愈伤中表达量上调4.50倍。植物信号转导途径在KEGG通路中显著富集，主要涉及参与生长素、细胞分裂素、茉莉酸等相关基因，表明激素信号的转导在玉米愈伤组织形成中发挥重要作用。

愈伤组织的褐化是组织培养体系中最大的阻碍，可能与POP（脯氨酰寡肽酶）和POD（过氧化物酶）酶活性相关^［

33-35］。在樟子松枝尖组织培养中发现POD的活性在培养期间开始增加，导致细胞膜的降解和叶绿素的减少，最终致使愈伤组织褐化后死亡^{［参考文献 36

百度学术}36］。胁迫诱导苯丙烷的生物合成^{［参考文献 27

百度学术}27，37］，愈伤中苯丙烷的生物合成基因显著富集是因为愈伤组织对胁迫的应激反应，阻碍愈伤组织的再生。本研究中，苯丙烷类生物合成途径是KEGG富集数目最显著的途径，共有69个基因被注释。共有42个POD基因差异表达，12个上调表达，30个下调表达。过氧化物酶PRX12（Zm00001d002898）和PX18（Zm00001d002899）在Ⅰ型愈伤表达量上调均大于6.0倍。本研究中，Ⅱ型愈伤在后期继代中活性下降、易褐化且无新生组织生成，这可能与苯丙烷生物合成途径相关基因的表达水平相关。通过在培养基中添加相关诱导剂来调控相关基因的表达，有可能促进玉米愈伤的生长。

AP2、WOX、LBD等转录因子家族与愈伤的发生相关，在不添加外源激素的条件下，过表达AP2转录因子家族基因ESR1（Enhanced shoot regeneration 1）或ESR2，能够提高其对细胞分裂素的响应能力，从而诱导愈伤组织的形成^［

38］。在玉米中，AP2家族的转录因子BBM（Baby boom）或包含homeodomain结构域的转录因子WUS均能促进胚性愈伤组织的形成^{［参考文献 29

百度学术}29］。生长素IAA可以显著快速地诱导AP2转录因子ZmBBM2，过表达ZmBBM2可以促进玉米自交系愈伤组织的诱导和增殖^{［参考文献 39

百度学术}39］。本研究中，ZmEREB53（ZmBBM2）和ZmEREB206（ZmBBM）在Ⅰ型愈伤中表达量显著升高，再次验证BBM转录因子在玉米愈伤发生中发挥重要作用。WOX5和WOX11（根尖分生组织调节基因）已经被证明在拟南芥和水稻愈伤组织发生中起重要的作用^{［参考文献 31

百度学术}31，40-41］。在本研究中，ZmWOX5b和ZmWOX9b表达量在Ⅰ型愈伤中上调5.50和5.03倍，表明这2个WOX转录因子在玉米愈伤发生过程中发挥重要作用。LBD转录因子家族是触发生长素诱导愈伤组织形成的主要调节因子，LBD29也参与愈伤组织形成过程中细胞重编程的调节^{［参考文献 42

百度学术}42］。在本研究中，ZmLBD10、ZmLBD24、ZmLBD31和ZmLBD32在Ⅰ型愈伤中表达量显著上调。上述结果表明，转录因子是植物生长发育重要的网络调控开关，在调控玉米愈伤发生中也发挥至关重要的作用。

4 结论

本研究对Ⅰ型（愈伤生长良好）和Ⅱ型（无愈伤生成）愈伤组织进行RNA-Seq分析，筛选出差异表达基因4419个，其中上调表达基因1571个，下调表达基因2848个。通过功能注释和富集分析发现，差异基因主要参与植物激素信号转导、苯丙烷的生物合成等代谢通路。发现转录因子在愈伤诱导的过程中起着重要的调控作用，共有2968个转录因子参与愈伤组织发生的调控过程，其中AP2、WOX和LBD转录因子家族显著富集，可能在玉米愈伤发生中发挥关键作用。

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