金荞麦<bold>C2H2-ZFP</bold>家族基因分析及<bold>FdC2H2-2</bold>在芦丁合成积累中的功能表征

龙欧; 卢翔; 石亚亮; 李光胜; 张凯旋; 王俊珍; 周美亮; LONG Ou; LU Xiang; SHI Ya-liang; LI Guang-sheng; ZHANG Kai-xuan; WANG Jun-zhen; ZHOU Mei-liang

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金荞麦C2H2-ZFP家族基因分析及FdC2H2-2在芦丁合成积累中的功能表征 PDF

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龙欧 ¹
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李光胜 ^1,3
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张凯旋 ¹
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王俊珍 ⁴
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周美亮 ¹
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1. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081； 2. 贵州大学农学院，贵阳 550025； 3. 湖南科技大学生命与健康学院，湘潭 411100； 4. 凉山彝族自治州农业科学研究院，四川西昌 615000

最近更新：2023-06-13

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20221205003

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摘要

C2H2锌指蛋白转录因子在植物生长发育、胁迫响应和次生代谢合成调控等方面发挥重要作用。前期研究发现金荞麦根部类黄酮含量高于苦荞麦可能是由于FdCHI， FdF3H， FdDFR等与类黄酮生物合成相关的基因家族被扩增。然而，参与类黄酮生物合成的C2H2锌指蛋白转录因子家族基因在金荞麦中如何调控芦丁合成尚未见报道。本研究对金荞麦FdC2H2-ZFP转录因子进行了全基因组鉴定和表达谱分析。共鉴定出114个FdC2H2-ZFPs。在对RNA-Seq数据分析基础上，筛选并克隆C2H2锌指蛋白基因FdC2H2-2。该基因具有3个典型的C2H2锌指结构，与拟南芥AtTREE1、AtDAZ3同源性较高。qRT-PCR显示FdC2H2-2基因的表达显著受茉莉酸诱导。此外，过表达FdC2H2-2毛状根中芦丁含量显著高于对照，且其芦丁合成途径中关键酶基因黄酮醇合成酶（FLS）、苯丙氨酸解氨酶（PAL）与类黄酮3'，5'-羟化酶（F3'5'H）表达量显著提高。以上结果表明，金荞麦FdC2H2-2基因可能通过激活芦丁生物合成关键酶基因FLS、PAL以及F3'5'H的表达，从而正向调控芦丁的积累。本研究为今后解析金荞麦C2H2锌指蛋白基因的功能提供参考。

关键词

金荞麦; C2H2锌指蛋白; 全基因组鉴定; 系统进化; 基因克隆; 芦丁合成

锌指蛋白是植物中最大的转录因子家族之一，根据其保守的Cys和His基序的数量和位置可分为9个亚家族，分别为C2H2、C3H、C3HC4、C2HC5、C4HC3、C2HC、C4、C6和C8^［

1-3］。其中，C2H2-ZFP在锌指蛋白家族中含量最丰富且研究最广泛^{［参考文献 4

百度学术}4］。根据C2H2-ZFP中锌指的数量和分布，可将其分为单蛋白、三蛋白、多个相邻蛋白以及分离成对的C2H2-ZFP^{［参考文献 5

百度学术}5］。C2H2-ZFP已被证明具有识别DNA、结合RNA、蛋白相互作用和转录调节以及许多其他生物学功能^{［参考文献 3

百度学术}3］。迄今为止，已在拟南芥^{［参考文献 6

百度学术}6］、水稻^{［参考文献 7

百度学术}7］、小麦^{［参考文献 8

百度学术}8］和大豆^{［参考文献 9

百度学术}9］等多种植物中克隆获得C2H2型锌指蛋白基因，并且通过转基因研究与基因表达分析等，初步明确了该基因的功能。大量研究表明，C2H2型锌指蛋白基因在植物生长发育、逆境胁迫响应及次生代谢合成调控等过程中发挥重要作用。例如，在玉米中，C2H2-ZFP基因与玉米产量性状的形成密切相关，参与调控玉米的生长发育^{［参考文献 10

百度学术}10］。在番茄中，SlCZFP1基因可诱导COR（cold-regulated）或冷响应相关基因的表达，进而增加转基因拟南芥和水稻的耐寒性^{［参考文献 11

百度学术}11］。在对茶树C2H2型锌指蛋白基因家族的功能研究中发现，有几种C2H2-ZFPs与儿茶素含量呈显著相关性^{［参考文献 12

百度学术}12］。

金荞麦（Fagopyrum dibotrys）是蓼科荞麦属多年生草本植物，含有大量的类黄酮，特别是黄酮醇（如芦丁），因其具有丰富的药理活性和营养价值倍受人们瞩目。目前，在许多植物中已鉴定出大量参与类黄酮生物合成途径的酶基因，如C4H、CHS、CHI、F3H、F3'H和F3'5'H以及PAL、FLS、DFR、LAR、ANS、ANR和UFGT等^［

13-14］。此外，这些酶基因的表达还受R2R3-MYB、AP2/ERF、bHLH、bZIP等多种转录因子调控^{［参考文献 15-18}15-18］。对金荞麦和苦荞麦的比较基因组学研究发现，金荞麦中FdCHI、FdF3H、FdDFR等参与类黄酮生物合成的基因拷贝数增加，这些酶基因的表达可能是导致金荞麦根部黄酮类化合物积累高于苦荞麦的原因^{［参考文献 19

百度学术}19］。然而，参与类黄酮生物合成的C2H2锌指蛋白转录因子在金荞麦中却未见报道。因此，鉴定金荞麦C2H2锌指蛋白基因并探究其在类黄酮生物合成中的功能和分子调控机制，对今后高黄酮醇金荞麦品种改良具有重要意义。

本研究对金荞麦和苦荞麦C2H2-ZFP转录因子家族进行了全基因组鉴定，并进行系统发育分析、染色体分布和全基因组复制等综合分析。此外，通过比较金荞麦FdC2H2-ZFPs在不同组织中的表达模式，克隆了1个只在金荞麦花中显著高表达的C2H2锌指蛋白基因FdC2H2-2（Fd07G003220），对其进行生物信息学分析，利用qRT-PCR分析该基因在茉莉酸处理下的表达模式。为探索该基因在类黄酮代生物合成中的功能，通过农杆菌介导法诱导转基因毛状根，并采用HPLC法检测过表达FdC2H2-2基因毛状根的芦丁含量，同时检测芦丁合成途径中C4H、F3H、PAL、FLS和F3'5'H 5个关键酶基因的表达，以期为今后探究金荞麦C2H2-ZFP基因功能和植物生理作用机制提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

螺髻山金荞麦种子、双元载体pCAMBIA1302、大肠杆菌DH5α感受态和发根农杆菌A4感受态菌种均由中国农业科学院作物科学研究所荞麦基因资源创新研究组保存。T载体试剂盒购于北京艾德莱生物科技有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 金荞麦FdC2H2-ZFP家族基因的鉴定和系统发育分析

根据iTAK软件对金荞麦和苦荞麦基因组转录因子的预测结果，提取C2H2-ZFP家族基因，通过SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）网站对所有蛋白序列进行保守结构域验证。利用MEGA11软件中的Clustal W工具对114个金荞麦、45个拟南芥和93个苦荞麦的C2H2-ZFPs氨基酸序列进行多序列比对，并利用邻接法（NJ，neighbour-joining）构建系统发育树，设置1000次重复（Bootstrap：1000）。最后应用iTOL在线软件进行美化。

1.2.2 金荞麦FdC2H2-ZFP家族基因结构及基序组成分析

使用SMART和InterPro（https：//www.ebi.ac.uk/interpro/）网站对金荞麦FdC2H2-ZFP基因家族成员的保守结构域进行分析。通过MEME （http：//meme-suite.‍org/tools/meme）网站进行保守基序（Motif）分析，将识别的Motif数量设置为10。利用TBtools可视化外显子/内含子结构，并绘制基因结构及保守基序组图。

1.2.3 金荞麦FdC2H2-ZFP家族基因染色体分布与基因复制分析

根据金荞麦FdC2H2-ZFP家族基因的位置信息，以及FdC2H2-ZFP基因的拷贝数和基因组分布，使用TBtools可视化基因染色体分布和全基因组复制事件并计算非同义替换率Ka、同义替换率Ks及其比值。

1.2.4 金荞麦FdC2H2-ZFP家族基因的组织特异性表达

利用金荞麦不同组织（根、地下膨大茎、茎、老叶、幼叶、花）转录组数据^［

19］，使用TBtool软件绘制FdC2H2-ZFP家族基因的表达量热图。

1.2.5 金荞麦FdC2H2-2基因的克隆及序列分析

使用RNA提取试剂盒和反转录试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）提取金荞麦RNA并进行反转录。以反转录得到的cDNA为模板，利用基因特异性引物进行PCR扩增（表1）。将PCR纯化产物连接到T载体上，获得FdC2H2-2-T载体质粒。FdC2H2-2基因的启动子、编码蛋白的理化性质、二级结构以及亚细胞定位预测分别采用PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）、ExPASy-ProtParam（https：//web.‍expasy.‍org/protparam/）、SOPMA（https：//npsa-prabi.‍ibcp.‍fr/cgi-bin/）以及Cell-PLoc2.0（http：//www.‍csbio.‍sjtu.‍edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）在线软件完成；信号肽和跨膜结构域分析分别采用SignalP5.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP）和TMHMM Serverv.2.0（http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM）完成；同时，通过NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）在线网站进行同源氨基酸序列多重比对分析，并通过MEGA11.0采用邻接法（Neighbor-Joining）构建系统进化树。

表 1 引物序列

Table 1 Primers sequence

引物名称 Primer name	正向引物序列（5′→3′） Forward primer sequence （5′→3′）	反向引物序列（5′→3′） Reverse primer sequence （5′→3′）	用途 Function
C2H2-2-T	ATGGATGAACCTCACAGCTCG	CTAACATGGCGTCACTGCCA	基因克隆
C2H2-2-1302	ACGGGGGACTCTTGACCATGGATGGATGAACCTCACAGCTCGG	AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTCTAACATGGCGTCACTGCCA	过表达载体构建
Actin	GAGTTATGAGCTTCCTGATG	CCGCCACTCAACACAATGTT	qRT-PCR内参
C2H2-2-Q	CTCATGTGGCTATCCGGTGG	CCGACCCGTTCTTGGGTATG	qRT-PCR
C4H-Q	GCGAAGAAGTACGGCGAGAT	CCGACGCATCTTTCTCCAGT
PAL-Q	AGGGTGGTGCTCTCCAAATG	GGCGATGTAGGAGAGAGGGA
F3H-Q	GACCAGGTGGACGGAAAGAG	CACGATGAATCCGCCCTTCT
FLS-Q	CACGGTGCTTCTTCAGGACT	CTGGATGCGGACAACACAAC
F3'5'H-Q	CGAAGCTACTTACGGCGGAT	CGTCACCACGTTCATTGCTG

1.2.6 FdC2H2-2基因在茉莉酸甲酯处理下的表达模式分析

选取饱满的螺髻山金荞麦种子，浸泡20 min后，剥去种皮，用1%次氯酸钠溶液消毒20 min；无菌水清洗多次，用滤纸吸干水分后种于普通MS培养基中。于温度23 ℃、光周期16 h/8 h、湿度75%~80%的条件下培养。取3株大小一致、生长健壮的14 d苗龄无菌苗置于液体MS培养基中，室温震荡（120 r/min）黑暗预培养24 h。用50 µmol/L茉莉酸甲酯（MeJA）分别处理0、1、4、12 h后取样，以二甲基亚砜（DMSO）处理组为对照，其他条件均保持一致。吸干样品水分，液氮速冻后存于-80 ℃冰箱，RNA提取方法同1.2.5。

1.2.7 实时荧光定量PCR

以金荞麦Actin作为内参基因，根据金荞麦FdC2H2-2序列设计荧光定量引物（表1）。利用7500 Real Time PCR System和Vazyme® Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix荧光定量试剂盒（南京诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）进行实时荧光定量PCR，通过2^-ΔΔCT法分析计算相对表达量。

1.2.8 过表达FdC2H2-2毛状根的诱导及芦丁含量测定

根据FdC2H2-2基因序列和过表达载体pCAMBIA1302图谱设计引物pCAMBIA1302-FdC2H2-2-F/R（表1）。以FdC2H2-2-T质粒为模板，进行PCR扩增。以NcoI和SpeI酶切扩增产物与pCAMBIA1302载体，连接转化后，进行菌液PCR检测与序列比对，得到过表达载体pCAMBIA1302-FdC2H2-2。将含目的片段的过表达载体pCAMBIA1302-FdC2H2-2通过A4发根农杆菌介导法，诱导转基因毛状根，具体步骤同谈天斌等^［

20］的方法。以A4发根农杆菌、空载体pCAMBIA1302毛状根为对照，取主根系进行PCR鉴定。利用高效液相色谱法（HPLC）检测过表达FdC2H2-2毛状根的芦丁含量，具体测定方法参考范昱等^{［参考文献 21

百度学术}21］的方法。每份样品设置3次重复。同时挑选C4H、PAL、F3H、FLS及F3'5'H 5个芦丁生物合成途径中的关键酶基因进行qRT-PCR检测。qRT-PCR方法同1.2.7，引物序列见表1。

2 结果与分析

2.1 金荞麦、苦荞麦C2H2-ZFPs基因家族成员鉴定及系统发育分析

本研究分别从金荞麦和苦荞麦中鉴定出114个、93个C2H2-ZFPs。为进一步明确金荞麦、苦荞麦和拟南芥C2H2-ZFP转录因子间的进化关系，构建了系统进化树。根据拟南芥C2H2-ZFPs基因家族的分类，金荞麦、苦荞麦C2H2-ZFPs家族基因可聚为5个亚组，按照从Ⅰ到Ⅴ的顺序进行分类（图1）。FdC2H2-ZFPs在5个亚组上均有分布，其中亚组Ⅲ中的成员数目最多，其次为亚组Ⅴ，分别包含34、28个FdC2H2-ZFPs。亚组Ⅱ包含成员数量最少，为11个FdC2H2-ZFPs。金荞麦与拟南芥C2H2型转录因子在系统进化上的同源关系表明，两者可能在某些生物学过程中发挥相同或相似的作用。

图1 拟南芥、苦荞和金荞之间C2H2-ZFP的系统发育树

Fig.1 Phylogenetic tree of C2H2-ZFP among Arabidopsis thaliana， Tartary Buckwheat and Golden buckwheat

At：拟南芥；Ft：苦荞麦；Fd：金荞麦；下同；外圈不同标签代表不同拟南芥C2H2-ZFPs基因亚家族名称

At： Arabidopsis； Ft： Tartary buckwheat； Fd： Golden buckwheat； The same as below； Different tags in the outer ring represent different Arabidopsis C2H2-ZFPs gene subfamily names

2.2 FdC2H2-ZFPs的基因结构和基序组成分析

利用MEGA11软件构建金荞麦FdC2H2-ZFPs系统发育树，以明确金荞麦FdC2H2-ZFPs基因间的进化关系，结果如图2A所示。为进一步揭示金荞麦FdC2H2-ZFPs的多样性，利用MEME在线网站在FdC2H2-ZFPs中识别了10个保守基序，将其依次命名为Motif 1~Motif 10。由图2B可知，各分支由相似的保守基序构成。此外，Motif 1几乎分布在所有FdC2H2-ZFPs中，该基序含有Cys-X2-Cys-X12-His-X3-His典型锌指结构域，且该保守Motif包含QALGGH植物特异性序列。为了解金荞麦C2H2-ZFPs的结构多样性，进一步分析了所有FdC2H2-ZFPs的外显子和内含子的结构数量。由图2C可知，38个（33.3%）FdC2H2-ZFPs不含内含子，其他FdC2H2-ZFPs的内含子数在1~9之间。在同一进化树分支中，相邻的FdC2H2-ZFPs成员具有相似的内含子数量或外显子长度。

图2 FdC2H2-ZFP基因的结构和基序组成

Fig.2 Gene structures and motif compositions of FdC2H2-ZFP genes

A：FdC2H2-ZFPs的系统进化分析；B：FdC2H2-ZFPs的保守基序组成；C：FdC2H2-ZFPs的外显子/内含子结构

A： Phylogenetic analysis of FdC2H2-ZFPs ； B： Conservative motif composition of FdC2H2-ZFPs； C： Exon/intron structure of FdC2H2-ZFPs

2.3 FdC2H2-ZFPs的染色体分布和基因复制事件

根据金荞麦基因组数据和染色体注释，发现114个FdC2H2-ZFPs随机分布在金荞麦8条染色体上（图3A），且在不同染色体上的定位模式不同。其中，4号染色体上的FdC2H2-ZFP基因数量最多，有20个，其次为2号染色体，有18个。此外，1号和6号染色体上FdC2H2-ZFP基因数量相同，均为10个；3号和7号染色体上均含有12个FdC2H2-ZFP基因。

图3 FdC2H2-ZFPs的染色体分布和基因复制事件

Fig.3 Chromosome distribution and gene replication events in FdC2H2-ZFPs

A：FdC2H2-ZFPs的染色体分布；B：金荞麦FdC2H2-ZFPs共线性分析

A： Chromosome distribution of FdC2H2-ZFPs； B： Collinearity analysis of FdC2H2-ZFPs in golden buckwheat

为了进一步评估基因复制事件的选择压力，本研究计算了非同义替换率（Ka）、同义替换率（Ks）和Ka/Ks值。结果显示，金荞麦FdC2H2-ZFPs共有24对FdC2H2-ZFP基因被证实为片段重复（图3B）。片段重复的FdC2H2-ZFPs的Ka/Ks值在0~0.6208之间（表2），表明这些共线性基因是在纯化选择下进化的。

表2 FdC2H2-ZFP间共线关系的Ka/Ks比值

Table 2 Ka/Ks ratios of the syntenic relationships between FdC2H2-ZFP

编号 Number	基因1 Gene 1	基因2 Gene 2	非同义替换率 Ka	同义替换率 Ks	非同义替换率 / 同义替换率 Ka/Ks
1	Fd01G004630	Fd01G037840	0.275133779	0.983226634	0.279827427
2	Fd01G004630	Fd06G003320	0.322453092	0.831799009	0.387657461
3	Fd01G006380	Fd06G002360	0.159733064	0	/
4	Fd01G037840	Fd06G003320	0.451736074	1.585382226	0.284938273
5	Fd02G031200	Fd02G046130	0.190653453	1.392645964	0.136900158
6	Fd02G029560	Fd02G042460	0.154055514	1.727878937	0.089158743
7	Fd02G032840	Fd02G048180	0.498155349	0.802441347	0.620799702
8	Fd02G033010	Fd02G048120	0.268108068	0.952888503	0.281363525
9	Fd02G010850	Fd02G017580	0.088415159	1.278635257	0.069148069
10	Fd02G048120	Fd04G045640	0.342715559	1.559188794	0.219803759
11	Fd02G048120	Fd08G039460	0.307626972	2.227041224	0.13813259
12	Fd02G010850	Fd08G019890	0.086824343	0.802997949	0.108125236
13	Fd02G052140	Fd08G022020	0.182895163	1.653298657	0.110624395
14	Fd02G017580	Fd08G019890	0.168990641	0.776958719	0.217502729
15	Fd04G004510	Fd05G013400	0.551763098	2.007042713	0.274913481
16	Fd04G008780	Fd06G003320	0.507432713	1.347630862	0.376536875
17	Fd04G002130	Fd08G022020	0.265917924	1.739031335	0.15291152
18	Fd04G001880	Fd08G021270	0.302859215	0.860288308	0.352043859
19	Fd05G005020	Fd05G044310	0.242930067	1.433879038	0.169421591
20	Fd05G045500	Fd07G035260	0.157575369	0.703821884	0.223885293
21	Fd05G044010	Fd07G029490	0.234869659	1.429027963	0.164356237
22	Fd05G049060	Fd07G022940	0.193082342	0.959745578	0.201180757
23	Fd05G040350	Fd08G011390	0.663973651	0	/
24	Fd06G028970	Fd08G011990	0.191389144	1.144208133	0.167267771

/表示因同义替换率为零，不计算非同义替换率/同义替换率

/ indicates that the non-synonymous replacement rate/synonymous replacement rate is not calculated because the synonymous replacement rate is zero

2.4 FdC2H2-ZFPs基因家族组织表达模式

在金荞麦不同组织转录组数据中共检测到104个FdC2H2-ZFPs，利用TBtools可视化这些基因的表达模式。结果发现104个FdC2H2-ZFPs聚为6个分支。其中，A亚组共包含17个基因，且在6个组织中的表达谱各不相同。B亚组包括14个基因，在地下膨大茎和根中均有高表达。此外，C、D、E和F亚群分别在茎、花、老叶和根组织中表达量较高。FdC2H2-2（Fd07G003220）只在金荞麦的花中特异性表达，推测该基因可能参与调控花的生长发育（图4）。

图4 FdC2H2-ZFP在不同组织中的表达谱

Fig.4 Expression profile of FdC2H2-ZFP in different tissues

红色和浅蓝色分别表示基因表达水平高和低

Red and light blue indicate high and low gene expression levels， respectively

2.5 FdC2H2-2基因的克隆与序列分析

为探究FdC2H2-ZFPs在类黄酮生物合成途径中的功能，筛选并克隆了FdC2H2-2基因，该基因全长1056 bp，PCR扩增结果见图5A。该蛋白由351个氨基酸组成，分子式为C₁₇₀₈H₂₆₅₅N₅₀₁O₅₃₀S₁₉，蛋白分子质量为39.29705 kD，理论等电点为8.63。其原子总数为5413，脂肪指数为53.56，不稳定性指数为45.03，为不稳定蛋白。亚细胞定位预测为核蛋白。且无信号肽与跨膜结构。利用NCBI在线网站进行 Blastp 搜寻并下载同源蛋白序列，使用MEGA软件构建进化树。结果显示金荞麦FdC2H2-2与拟南芥AtTREE1、AtDAZ3亲缘关系较近（图5B）。FdC2H2-2蛋白α螺旋有79个氨基酸，占22.51%；无规则卷曲225个氨基酸，占64.10%；延伸链34个氨基酸，占9.69%；β转角13个氨基酸，占3.70%（图5C）。该蛋白含有3个C2H2锌指结构，分别位于31~53位、90~112位和279~301位（图5D）。

图5 金荞麦FdC2H2-2基因的克隆与序列分析

Fig.5 Cloning and sequence analysis of FdC2H2-2 gene in golden buckwheat

A：FdC2H2-2基因PCR扩增结果；M： DL 2000 DNA 标记；1：FdC2H2-2基因；B：FdC2H2-2与其他C2H2锌指蛋白的系统进化树；C：FdC2H2-2蛋白二级结构；蓝色：α-螺旋；绿色：β-折叠；粉色：无规则卷曲；红色：延伸链；D：FdC2H2-2蛋白结构域预测；蓝色：SAMRT结构域；粉色：低复杂度区域；E：FdC2H2-2基因的启动子分析

A：FdC2H2-2 gene PCR amplification result； M： DL 2000 DNA marker； 1 ：FdC2H2-2 gene ； B： Phylogenetic tree of FdC2H2-2 and other C2H2 zinc finger proteins； C： Secondary structure of FdC2H2-2 protein； Blue： α-helix； Green： β-folding； Pink： Random curling； Red： Extended chain； D： FdC2H2-2 protein domain prediction； Blue： SAMRT domain； Pink： Low complexity region；E： Promoter analysis of FdC2H2-2 gene

启动子分析结果表明，FdC2H2-2基因启动子序列中除了含有大量TATA-box、CAAT-box基本元件外，还包含多种与非生物胁迫及激素响应相关的顺式作用元件。其中，激素响应顺式作用元件包括1个脱落酸响应元件、1个茉莉酸甲酯响应元件、1个水杨酸响应元件；非生物胁迫响应顺式作用元件包括2个低温响应元件、2个厌氧诱导元件、1个干旱相关的MYB转录因子结合位点、2个光响应元件以及2个与光响应相关的MYB结合位点（图5E）。

2.6 FdC2H2-2基因在茉莉酸处理下的表达分析

对FdC2H2-2基因的启动子进行分析，发现该基因启动子上有响应茉莉酸的顺式作用元件（图5E）。使用50 µmol/L MeJA处理14 d无菌苗，分析该基因在MeJA胁迫处理下表达模式。qRT-PCR结果显示，FdC2H2-2基因的表达量在受到茉莉酸甲酯诱导后呈现先上升后下降的趋势，在1 h显著达到最高，4 h后有所下降（图6）。以上表明，金荞麦在对茉莉酸信号的应答反应过程中会影响FdC2H2-2基因的表达。

图6 MeJA 诱导下 FdC2H2-2基因的表达情况

Fig.6 Expression of FdC2H2-2 gene induced by MeJA

*表示与对照相比达到显著水平（P<0.05）；下同

* indicates the significant difference compared with the control （P<0.05）； The same as below

2.7 过表达FdC2H2-2基因对毛状根芦丁积累的影响

通过农杆菌介导法进行了野生型（A4）、转pCAMBIA1302空载体（A4-1302）和转pCAMBIA1302-FdC2H2-2（A4-1302-FdC2H2-2）毛状根的诱导，以探索FdC2H2-2在类黄酮生物合成途径中的作用，其诱导过程如图7A。利用PCR分子鉴定筛选转基因毛状根阳性根系，结果如图7B所示。

图7 过表达FdC2H2-2基因促进芦丁的合成积累

Fig.7 Overexpression of FdC2H2-2 gene promotes the synthesis and accumulation of rutin

A：金荞麦毛状根的诱导过程；a：培养 14 d 的金荞麦无菌苗；b：农杆菌侵染后 10 d 的毛状根；c：继代培养14 d的毛状根；d：MS 液体培养基中培养 14 d 的毛状根；B：转基因根系的鉴定；M：DL 2000 DNA 标记；1：pCAMBIA1302- FdC2H2-2质粒（阳性对照）；2：A4金荞麦根系（阴性对照）；3~6：转pCAMBIA1302-FdC2H2-2 阳性毛状根根系；C：芦丁含量的测定；D：芦丁合成途径关键酶基因的表达

A： Induction process of hairy roots of golden buckwheat； a： Cultured for 14 days of buckwheat seedlings without fungus； b： Hairy roots 10 days after Agrobacterium infection； c： Hairy roots cultured for 14 days subculture；d：Hairy roots cultured for 14 days in MS liquid medium； B： Identification of transgenic roots； M： DL 2000 DNA marker； 1： pCAMBIA1302-FdC2H2-2 plasmid （positive control）； 2： A4 golden buckwheat root （negative control）； 3~6： pCAMBIA1302-FdC2H2-2 positive hairy roots； C： Determination of rutin content； D： Expression of key enzyme genes in rutin synthesis pathway

分别选择3株生长状态一致的野生型A4、1302空载体和FdC2H2-2-1302过表达毛状根转基因株系进行芦丁含量的测定。结果显示，在过表达FdC2H2-2-1302毛状根株系中芦丁含量显著高于对照组A4，其芦丁含量高达2.35 mg/g（图7C）。表明FdC2H2-2基因可能参与芦丁的生物合成。qRT-PCR结果显示，在过表达毛状根中FLS、PAL与F3'5'H酶基因的表达量显著升高，而C4H、F3H酶基因的表达量无显著上调或是下调（图7D）。以上表明FdC2H2-2基因可能是通过提高芦丁合成途径关键酶基因FLS、PAL和F3'5'H的表达来促进金荞麦芦丁的合成积累。

3 讨论

大量研究表明，C2H2型锌指蛋白转录因子参与调控植物次生代谢物的合成积累。在拟南芥中，AtZAT6的表达正向调节花青素和总黄酮浓度^［

22］。在苹果愈伤组织中过表达MdZAT5，发现花青素生物合成相关基因的表达显著增加，该基因正向调节花青素积累^{［参考文献 23

百度学术}23］。柿果DkZF6基因通过抑制原花青素合成途径中的结构基因DkANR、DkF3'5'H和DKCHS的活性来降低柿果中原花青素的含量^{［参考文献 24

百度学术}24］。目前，关于金荞麦C2H2锌指蛋白基因在类黄酮生物合成调控上的研究少有报道。本研究在金荞麦、苦荞麦基因组中分别鉴定出114、93个C2H2-ZFP基因成员，与苦荞麦相比，金荞麦中C2H2-ZFP基因数目明显较多，说明C2H2锌指蛋白转录因子家族在金荞麦中发生了扩张。系统进化树结果显示：FdC2H2-ZFPs可分为5个亚组，并且处于同一分支的基因往往具有相似的功能。研究表明，拟南芥C1亚群与植物生长发育过程和应激反应有关，亚群C2的许多成员参与染色质重塑过程，而亚群C3的成员参与RNA代谢过程^{［参考文献 25

百度学术}25］。染色体定位分析显示：FdC2H2-ZFPs随机分布在金荞麦的8条染色体上，说明C2H2锌指蛋白基因具有广泛的作用。FdC2H2-ZFPs不同组织表达谱表明，FdC2H2-2在花中特异性表达，推测该基因可能调控花的生长发育。但其是否在花的生长发育过程中发挥作用还有待进一步研究。

本研究克隆了1个在花中特异高表达的C2H2型锌指蛋白基因FdC2H2-2。该基因全长为1056 bp，编码351个氨基酸，亚细胞定位预测为核蛋白。通过蛋白结构域分析发现FdC2H2-2含有3个典型的C2H2锌指结构。系统进化树显示FdC2H2-2与拟南芥AtTREE1、AtDAZ3亲缘关系较近，且这两个基因与EIN3相互作用，参与响应乙烯抑制芽生长的分子机制^［

26］。研究证明许多植物激素参与调控C2H2型锌指蛋白基因的表达。例如，在烟草中，PtrZPT2-1的表达受ABA胁迫的强烈诱导，过表达PtrZPT2能提高转基因烟草的耐寒、耐旱和耐盐性^{［参考文献 27

百度学术}27］。茉莉酸甲酯（MeJA）能诱导苹果C2H2型锌指蛋白基因MdZAT10的表达，从而加速茉莉酸甲酯诱导的叶片衰老^{［参考文献 28

百度学术}28］。拟南芥AtZAT6通过激活SA相关基因的表达，参与调控拟南芥逆境胁迫响应^{［参考文献 29

百度学术}29］。在对辣椒C2H2锌指蛋白转录因子的研究中发现，茉莉酸甲酯处理能显著诱导辣椒C2H2锌指蛋白基因（CaZFs），且可能在防御信号转导中发挥作用^{［参考文献 30

百度学术}30］。对FdC2H2-2进行启动子分析发现该基因具有脱落酸（ABRE）、茉莉酸（CGTCA-motif）、水杨酸（TCA-element）等多种激素相关元件。由此推测FdC2H2-2基因的表达可能受植物激素的调节。有趣的是，在本研究中发现FdC2H2-2在MeJA处理1 h后其表达量被显著诱导表达，这与前人研究结果相似，表明FdC2H2-2是1个受植物激素MeJA诱导的C2H2型锌指蛋白转录因子。

另有研究发现，黄酮类化合物的生物合成由多种植物激素介导，其中茉莉酸（JA）诱导多种转录因子，参与黄酮类化合物生物合成途径相关基因的表达^［

31］。MeJA参与芦丁的生物合成途径，它可以在蛋白或转录水平调控芦丁合成通路中的转录因子或关键酶^{［参考文献 15

百度学术}15］。作为JA与黄酮类生物合成基因之间的桥梁，许多转录因子被发现被JA激活，包括MYB、ERF、WRKY和bHLH转录因子^{［参考文献 32

百度学术}32］。在本研究中茉莉酸甲酯诱导FdC2H2-2转录因子的表达，猜测可能参与黄酮类化合物生物合成基因的调控。据报道参与芦丁生物合成途径中的关键酶基因主要包括苯丙氨酸解氨酶（PAL）、肉桂酸-4-羟化酶（C4H）、4-香豆酸-辅酶a连接酶（4CL）和查尔酮合成酶（CHS）、查尔酮异构酶（CHI）、黄酮-3-羟化酶（F3H）与类黄酮-3'-羟化酶（F3'H）、类黄酮3'，5'-羟化酶（F3'5'H）、黄酮醇合成酶（FLS）以及类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（UFGT）、类黄酮醇-3-O-葡萄糖苷-l-鼠李糖基转移酶（RT）等^{［参考文献 33-34}33-34］。为进一步研究C2H2锌指蛋白基因是否参与调控金荞麦类黄酮的合成积累，通过农杆菌介导法诱导过表达FdC2H2-2毛状根，并检测其芦丁含量及关键酶基因的表达。结果显示转基因毛状根的芦丁含量显著高于对照，并且芦丁合成途径关键酶基因FLS、PAL与F3'5'H表达量显著提高。综上表明FdC2H2-2基因受茉莉酸诱导并通过激活芦丁生物合成关键酶基因FLS、PAL与F3'5'H的表达来促进芦丁的合成积累。

4 结论

本研究对金荞麦C2H2锌指蛋白转录因子家族进行了全基因组鉴定和分析，共鉴定出114个FdC2H2-ZFPs。并利用不同组织转录组数据筛选并克隆出1个在金荞麦花中显著高表达的FdC2H2-2基因。通过分析FdC2H2-2在MeJA诱导下的表达模式，结果发现其被显著诱导表达。此外，在金荞麦毛状根中过表达FdC2H2-2基因，发现其芦丁含量显著高于对照，且芦丁生物合成关键酶基因FLS、PAL和F3'5'H的表达显著提高。表明FdC2H2-2与金荞麦中芦丁的合成积累呈正相关，其通过激活芦丁生物合成关键酶基因FLS、PAL和F3'5'H的表达，从而正向调控芦丁的生物合成。

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