大豆<bold>CMS-RN</bold>型不育系育性恢复基因<bold>GmRf1</bold>的初步鉴定及其分子标记开发

杨绪磊; 郭凤兰; 高萌萌; 张泽东; 林春晶; 孙妍妍; 张井勇; 彭宝; 赵丽梅; 张春宝; YANG Xu-lei; GUO Feng-lan; GAO Meng-meng; ZHANG Ze-dong; LIN Chun-jing; SUN Yan-yan; ZHANG Jing-yong; PENG Bao; ZHAO Li-mei; ZHANG Chun-bao

网刊加载中。。。

使用Chrome浏览器效果最佳，继续浏览，你可能不会看到最佳的展示效果，

确定继续浏览么?

复制成功，请在其他浏览器进行阅读

大豆CMS-RN型不育系育性恢复基因GmRf1的初步鉴定及其分子标记开发 PDF

- ORCID：
杨绪磊 ^1,2
✉
- ORCID：
郭凤兰 ^1,2
- ORCID：
高萌萌 ^1,2
- ORCID：
张泽东 ^1,2
- ORCID：
林春晶 ²
- ORCID：
孙妍妍 ²
- ORCID：
张井勇 ²
- ORCID：
彭宝 ²
- ORCID：
赵丽梅 ^1,2
- ORCID：
张春宝 ^1,2
✉

1. 吉林农业大学农学院，长春 130118； 2. 吉林省农业科学院大豆研究所 / 农业农村部杂交大豆育种重点实验室，长春 130033

最近更新：2023-06-13

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20221124001

摘要

在大豆杂种优势利用中，主要基于三系法进行杂交大豆品种选育。恢复系作为杂交种的父本，其所含的育性恢复（Rf，restorer-of-fertility）基因起决定作用。前期对大豆RN型细胞质雄性不育恢复系的育性恢复基因GmRf1进行了精细定位。本研究在此基础上，对GmRf1定位区间内的候选基因进行功能注释、亚细胞定位预测、序列比对和差异表达分析，明确了Glyma.16G161900基因在恢复系JLR230中所编码的1个576个氨基酸的PPR（Pentatricopeptide repeats）蛋白为GmRf1。进一步对含有GmRf1的对照材料Williams82与母本不育系JLCMS204A进行测交及F₁植株花粉育性鉴定，验证了GmRf1可以恢复CMS-RN型不育系育性。最后利用GmRf1在亲本间存在的单核苷酸突变位点，开发了功能性分子标记Rf1-dCAPS-2和Rf1-dCAPS-3。上述研究将为今后通过分子标记筛选或辅助选育含GmRf1基因型材料，以及通过基因工程手段创制新型恢复系奠定了理论和技术基础。

关键词

大豆; 细胞质雄性不育; 育性恢复基因; 分子标记辅助选育

大豆是我国重要的粮油饲兼用作物。近年来大豆缺口一直在8000万吨以上，供给压力逐年增大。因此，如何提高国产大豆的产量一直都是科研工作者的重点研究方向。杂种优势利用是大幅度提高大豆产量的有效途径之一，如2002年审定的世界上第一个大豆杂交种杂交豆1号，其区域试验两年平均产量比对照品种增产21.9%^［

1］；2017年审定的首个优质双高杂交种吉育612，区域试验平均产量也比对照增产16.0%^{［参考文献 2

百度学术}2］。目前，大豆杂种优势利用主要基于细胞质雄性不育（CMS，cytoplasmic male sterility）系统，其由不育系、保持系和恢复系构成。恢复系作为杂交种的父本，其所含育性恢复（Rf，restorer-of-fertility）基因起着决定作用，不同的恢复系材料含有的恢复基因的恢复能力不同，导致杂交种育性恢复效果也不尽相同。因此，强恢复系的选育是强优势杂交种创制的基础。然而强恢复系的传统选育方式非常繁琐，需与不育系测交，通过观察子代花粉育性来鉴定，既耗时又费力。而对现有恢复系进行改造和恢复基因聚合，若通过传统方法选育，很难对杂交后代的不同基因型进行快速、准确的选择，导致具有良好农艺性状的品系往往不含恢复基因，极大地限制了新型恢复系的快速有效创制。

为此，研究人员利用不同细胞质类型不育系与配套恢复系杂交，构建分离群体，开展育性恢复基因的定位与克隆工作，以期建立恢复系分子标记辅助育种体系或利用生物工程技术创制新型恢复系。早在2007年，赵丽梅等^［

3］首次以CMS-RN型不育系YA为母本，恢复系167为父本进行杂交获得F₂分离群体，将CMS-RN型不育系对应的基因成功定位于16号染色体的Satt547附近。Wang等^{［参考文献 4

百度学术}4］进一步将该Rf基因精细定位至Sctt_011和Satt547之间。之后，任良真^{［参考文献 5

百度学术}5］和王鹏年^{［参考文献 6

百度学术}6］均以RN型CMS材料为亲本对Rf基因进行了精细定位，并将Rf基因定位至500 kb左右的物理区间，其中有8个具有典型Rf基因特征的PPR（Pentatricopeptide repeats）蛋白家族基因。Yang等^{［参考文献 7

百度学术}7］利用SSR标记对CMS-N8855型不育系NJCMS1A与恢复系中豆5号杂交获得的F₂分离群体进行分析发现，位于7号染色体上的Satt626和5号染色体上的Satt300与Rf基因连锁，遗传距离分别为9.75 cM和11.18 cM。Wang等^{［参考文献 8

百度学术}8］进一步以NJCMS1A与恢复系NJCMS1C杂交后代分离群体为材料，将Rf基因定位于16号染色体上SSR标记BARCSOYSSR_16_1067和BARCSOYSSR_16_1078之间，遗传距离分别为1.1 cM和1.4 cM，并通过基因编辑技术及相关分析鉴定GmPPR576为CMS-N8855型不育系的Rf基因。汤复跃等^{［参考文献 9

百度学术}9］以CMS-M型不育系W931A和恢复系WR16构建分离群体，利用SSR分子标记技术将CMS-M型不育系对应的Rf基因定位到5号染色体上的Satt276和Satt545之间。然而在2016年，Wang等^{［参考文献 10

百度学术}10］同样利用W931A×WR16的后代分离群体对Rf基因进行了精细定位，但将其定位于16号染色体GmSSR1602和GmSSR1610之间的162.4 kb的区段内。焦东燕^{［参考文献 11

百度学术}11］则以两个CMS-ZD型不育系阜CMS5A和W931A与恢复系阜恢6号杂交构建的F₂和F_2∶3群体为材料，将CMS-ZD型不育系对应的Rf基因定位在BARCSOYSSR_16_1040和Satt547之间。之后Dong等^{［参考文献 12

百度学术}12］进一步将CMS-ZD型Rf基因定位在16号染色体SSR分子标记BARCSOYSSR_16_1064和BARCSOYSSR_16_1082之间，遗传距离分别为0.59 cM和0.83 cM。贾顺耕等^{［参考文献 13

百度学术}13］对以CMS-RN型不育系JLCMS82A为母本和恢复系JLR1为父本构建的F₂分离群体进行分子标记定位，发现了1个新恢复基因位点Rf3，将其定位于9号染色体的分子标记BARCSOYSSR_09_1151和BARCSOYSSR_09_1183之间，遗传距离分别为0.6 cM和0.5 cM。Sun等^{［参考文献 14

百度学术}14］则利用CMS-RN型不育系JLCMS5A为母本和恢复系JLR2为父本构建的F₂分离群体，将Rf3基因精细定位至9号染色体86.43 kb区间之内，并初步鉴定Glyma.09G171200可能是Rf3基因。

前期以大豆CMS-RN型不育系JLCMS204A与恢复系JLR230杂交获得的F₂分离群体为试验材料，将CMS-RN型育性恢复基因GmRf1精细定位在16号染色体上的分子标记dCAPS-1和BARCSOYSSR_16_1076之间，遗传距离分别为0.1 cM和0.3 cM^［

15］。本研究在此基础上对精细定位区间的基因进行分析，初步鉴定GmRf1基因，并开发功能性分子标记用于含GmRf1基因型恢复系的筛选和辅助选育。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆CMS-RN型不育系JLCMS204A、恢复系JLR230、对照品种Williams82均由吉林省农业科学院杂交大豆研究团队保存并提供，2021年种植于吉林省长春市范家屯镇杂交大豆核心育种基地（124°83′E，43°43′N）。

1.2 试验方法

1.2.1 GmRf1候选基因预测

以Williams82.a2.v1（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/info/Gmax_Wm82_a2_v1）为参考基因组，对GmRf1定位区间进行分析，初步筛选候选基因；在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上查询相关基因的功能注释，初步预测GmRf1候选基因。根据候选基因的编码序列，设计基因特异性引物（表1）。以Nu Clean Plant Genomic DNA Kit（北京康为世纪）提取的亲本初花期（R1）叶片基因组DNA为模板，利用2×Super Pfx Master Mix酶进行PCR扩增。PCR扩增程序如下：98 ℃预变性3 min；98 ℃变性10 s，退火温度为60~62 ℃，72 ℃延伸30 s~1 min，32个循环；72 ℃终延伸5 min。扩增后将得到单一的目的条带片段克隆至pEASY-T1 Blunt载体上，进行涂板培养，经过蓝白斑筛选后每个基因挑取5个白色克隆进行阳性克隆鉴定，之后选取3个阳性克隆样品送北京六合华大基因科技有限公司进行测序，利用Vector NTI 8.0软件进行序列比对分析。

表1 GmRf1候选基因扩增所用引物信息

Table 1 Primers information for amplification of GmRf1 candidate gene

引物名称 Primer name	正向引物序列（5'-3'） Forward primer sequence（5'-3'）	反向引物序列（5'-3'） Reverse primer sequence（5'-3'）	退火温度（℃） Annealing temperature	产物大小（bp） Product size
16G161900	TATGTCATTAGTCTCTTTCTCTCAATTTTATTGTT	CGGAACGCACAATCCGG	60	2357
16G162000	ATGATTATTTCCACAGTGCCTATAACA	TTACTTCATGGCCAAAGCTTCA	60	1490
16G162100	ATGTCATTCTCATTCTCATTGTCAAG	CTACAATAGGCCTTTAGCAATCATT	62	1659
16G163100	ATGTCATTCTCGAGAAGGTTAAGCT	TCACAATAACTTATTTGTAACTGGAGA	60	1698
Cons4	GATCAGCAATTATGCACAACG	CCGCCACCATTCAGATTATGT	60	105

1.2.2 GmRf1候选基因差异表达分析

利用NCBI网站中的Primer-BLAST程序设计实时荧光定量PCR（qRT-PCR，quantitative real-time PCR）引物并合成，利用EasyPure Plant RNA Kit（北京全式金）在盛花期（R2）提取JLCMS204A和JLR230顶端花序旁侧叶片总RNA，以HiFiScript cDNA Synthesis Kit（康为试剂）试剂盒合成cDNA第一链为模板进行PCR扩增。在扩增过程中，利用荧光信号检测定位区间内基因的表达量，选择Cons4（Genbank登录号：BU578186）作为内参基因，每个样品设置3个重复，引物序列见表1。

1.2.3 GmRf1蛋白质结构预测分析

使用Vector NTI 8.0软件分析基因序列，运用NCBI中的ORF Finder查找基因的开放阅读框，使用ExPASy平台（https：//web.expasy.org/protparam/）将目的基因的编码框翻译成蛋白质，并分析其理化性质、等电点、疏水性、跨膜结构域。使用SignalP 6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/service.php？SignalP-6.0）预测蛋白质信号肽，使用NCBI conserved domains预测蛋白质亚细胞定位位置。在PRABI（http：//www.prabi.fr）和SWISS-MODEL平台（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白质的二级和三级结构。

1.2.4 含GmRf1基因材料的测交鉴定

以含GmRf1候选基因的大豆品种Williams82与CMS-RN型不育系JLCMS204A进行测交，收获F₁种子种植于温室花盆，盛花期（R2）取成熟花苞，参照郭凤兰等^［

15］方法对F₁植株进行花粉育性鉴定。

1.2.5 功能性分子标记开发与验证

根据GmRf1基因上的突变位点设计衍生的酶切扩增多态性序列（dCAPS，derived cleaved amplified polymorphic sequences）分子标记，利用亲本及半不育单株DNA进行PCR扩增和多态性筛选；进一步利用特异性dCAPS标记对前期用于进行GmRf1基因定位的F₂分离群体典型单株进行酶切扩增多态性检测，验证dCAPS标记准确性。

2 结果与分析

2.1 候选基因的预测和筛选

通过对大豆参考基因组中前期定位的恢复基因GmRf1候选区间进行检索，发现该区间内含有27个基因，对其进行功能注释。根据已知文献报道，除水稻Rf2基因、Rf17基因和玉米Rf2基因等特殊情况外，所有恢复基因均属PPR家族基因。该家族基因编码的PPR蛋白是一个简并串联的蛋白，由自身携带的线粒体信号肽引导进入线粒体，通过剪接、编辑转录本或者改变CMS基因翻译产物的积累量，致使杂种F₁育性恢复。根据27个基因的功能注释，发现有7个为PPR蛋白家族基因（表2）；进一步通过亚细胞定位预测发现Glyma.16G161800、Glyma.16G162700、Glyma.16G162800这3个基因编码的蛋白定位于叶绿体中，而Glyma.16G161900、Glyma.16G162000、Glyma.16G162100、Glyma.16G163100这4个基因编码的蛋白定位于线粒体中，因此，初步预测这4个基因为GmRf1候选基因。

表2 恢复基因GmRf1定位区间内所有PPR家族基因及注释信息

Table 2 All PPR family genes and annotation information within the location range of the Rf gene GmRf1

基因名称 Gene name	基因描述 Gene description	亚细胞定位预测 Prediction of subcellular localization	编码区全长（bp） Length of coding DNA sequence	基因位置（bp） Gene location
Glyma.16G161800	TPR/PPR家族蛋白	叶绿体	1749	32105638~32107509
Glyma.16G161900	PPR家族蛋白	线粒体	1731	32108807~32115361
Glyma.16G162000	PPR家族蛋白	线粒体	1173	32113025~32114514
Glyma.16G162100	PPR家族蛋白	线粒体	1659	32118958~32120616
Glyma.16G162700	PPR家族蛋白	叶绿体	1518	32157331~32159914
Glyma.16G162800	PPR家族蛋白	叶绿体	1569	32167100~32168668
Glyma.16G163100	PPR家族蛋白	线粒体	1698	32180450~32183435

2.2 候选基因编码序列比对分析

以父本JLR230、母本JLCMS204A和对照品种Williams82为模板，对具有恢复基因典型特征的4个PPR蛋白家族基因Glyma.16G161900、Glyma. 16G162000、Glyma.16G162100和Glyma.16G163100进行克隆和测序，所用引物信息见表1。

利用Vector NTI 8.0软件对上述测序结果进行比对，分析各基因中亲本间的编码序列差异。通过序列比对分析发现，Glyma.16G161900的编码区发生3处单核苷酸变异，导致编码的氨基酸发生了变化；Glyma.16G162000的编码区发生2处变异，导致氨基酸发生移码突变，氨基酸翻译提前结束；Glyma.16G162100的编码区没有发生变异；Glyma. 16G163100的编码区发生20处变异，其中有8处为同义突变，12处为非同义突变，同样导致编码的氨基酸发生了变化。从序列差异比对情况分析判断，Glyma.16G162100可能不是GmRf1基因。

2.3 候选基因表达量分析

进一步利用qRT-PCR检测Glyma.16G161900、Glyma.16G162000和Glyma.16G163100在JLR230和JLCMS204A中的相对表达量。结果表明，3个基因在亲本间均有表达，Glyma.16G161900和Glyma. 16G163100均在恢复系JLR230中表达量较高，其中Glyma.16G161900在亲本间的表达量差异最为显著（图1）。因此，推断Glyma.16G161900可能为GmRf1基因。

图1 GmRf1候选基因表达量分析

Fig.1 Expression analysis of GmRf1 candidate gene

不同小写字母表示相对表达量差异显著

Different lowercase letters indicate significant differences in relative expression

2.4 Glyma.16G161900编码序列比对分析

Glyma.16G161900基因由两个外显子和一个内含子构成，通过对亲本间该基因编码序列的比对分析发现，恢复系JLR230在第一个外显子256 bp的碱基由T突变为C，翻译的氨基酸由丝氨酸（Ser）变为脯氨酸（Pro）；760 bp的碱基由G突变为A，翻译的氨基酸由甘氨酸（Gly）变为丝氨酸（Ser），在826 bp处碱基也由T突变为C，氨基酸由酪氨酸（Tyr）变为组氨酸（His）（图2）。上述3处碱基突变均导致氨基酸序列发生了变化，推测Glyma.16G161900基因因此发生了功能获得型变异，其编码的576个氨基酸的线粒体靶向蛋白可以影响不育基因转录或翻译产物的积累，从而使CMS-RN型不育系恢复育性。该结果与Wang^［

8］等发现Glyma.16G161900为CMS-N8855型不育系配套恢复系NJCMS1C的恢复基因的结果互相印证，明确了Glyma.16G161900为大豆CMS恢复基因GmRf1。

图2 GmRf1的氨基酸序列和基因结构比对

Fig.2 Amino acid and gene structural alignment of GmRf1

a：CDS氨基酸序列比对，红框位置为差异位点；b：基因结构和突变位点差异比对

a： Amino acid sequence alignment in coding region，the position in the red box is the difference point； b：Differential alignment in gene structure and mutation sites

2.5 GmRf1基因的蛋白质结构预测分析

使用ExPASy对GmRf1蛋白的一级结构进行预测，结果显示该蛋白质的分子式是C₂₈₉₆H₄₆₆₂N₇₆₄O₈₁₉S₄₆，编码576个氨基酸（图3a），亲水平均值0.48，蛋白质不稳定系数为30.14，等电点8.85，表明该GmRf1为稳定的碱性蛋白。利用PRABI进行蛋白质二级结构预测显示，该基因的α螺旋、延伸链和无规则卷曲的氨基酸残基数分别337、121和118，占比分别为58.51%、21%和20.49%（图3b）。根据SWISS蛋白质三级结构预测结果显示，其为五肽重复蛋白（图3c）。

图3 GmRf1基因的蛋白质结构预测

Fig.3 Protein structure prediction of GmRf1 gene

a：氨基酸组成；b：蛋白质二级结构预测；c：蛋白质三级结构预测

a： Amino acid composition； b： Protein secondary structure prediction； c： Protein tertiary structure prediction

2.6 GmRf1基因功能的辅助验证

通过对照品种Williams82和恢复系JLR230序列比对分析（图2a）发现，二者Glyma.16G161900碱基序列相同，因此，推测Williams82同样含有恢复基因GmRf1。为了进一步验证GmRf1的功能，以CMS-RN型不育系JLCMS204A为母本，Williams82为父本进行杂交，对F₁植株的成熟花苞进行花粉育性鉴定，花粉染色结果如图4所示，杂种F₁花粉育性结果为典型半不育，与JLCMS204A和JLR230杂种F₁花粉育性鉴定结果一致，进一步间接证明了Glyma. 16G161900具有育性恢复功能，为CMS-RN型不育系的恢复基因。

图4 不同材料花粉育性鉴定结果

Fig.4 Identification results of pollen fertility of different materials

a：JLCMS204A的花粉染色情况；b：F₁（JLCMS204A×Williams82）的花粉染色情况；c：F₁（JLCMS204A×JLR230）的花粉染色情况

a： Pollen staining of JLCMS204A； b： Pollen staining of F₁（JLCMS204A×Williams 82）； c： Pollen staining of F₁（JLCMS204A×JLR230）

2.7 GmRf1基因功能性分子标记开发

根据GmRf1基因上的3个突变位点，每个位点设计2个dCAPS标记，共计6个，详见表3。对亲本及半不育单株进行多态性筛选发现，Rf1-dCAPS-2和Rf1-dCAPS-3具有显著多态性。两个标记的退火温度均为60 ℃，扩增产物单一无杂带，且大小相符。经过对应的限制性内切酶EcoR I和Mbo I酶切，均可明显切出特异性条带。

表3 多态性dCAPS分子标记序列信息

Table 3 Polymorphic dCAPS molecular marker sequence information

dCAPS标记 dCAPS marker	正向引物序列（5'-3'） Forward primer sequence（5'-3'）	反向引物序列（5'-3'） Reverse primer sequence（5'-3'）	限制性内切酶 Restriction endonuclease	突变位置（bp） Positions	产物大小（bp） Product size
dCAPS-1	GATGGAGCATTATCCTACTGGCATG	TCTGTCTTCAATCCTTCTCAGCAAC	Sph I	256	367
dCAPS-2	GATGGAGCATTATCCTACTGGAATT	AAAAATCATAAGCCTCGTTTACAAG	EcoR I	256	452
dCAPS-3	ATTGAAGAACATCAACCCGGATGAT	ACTGTATGTCACTGTATCAGGAATC	Mbo I	826	352
dCAPS-4	GCATCAATCAATATACTAAAGGTTC	CCATAACCTTGACTACACTCCTGA	Taq I	826	448
dCAPS-5	TCTAATATGTGGCTTTTDCCTTCTC	ACCATTCTCTTCCATTTTTGACTTC	Dde I	760	811
dCAPS-6	TCTAAATGTGGCTTTTGCCTTTCG	CTGGTTGACCTCTGTGGTCCATCTC	Taq I	760	503

利用Rf1-dCAPS-2和Rf1-dCAPS-3对GmRf1基因定位群体部分单株进行验证。其中，Rf1-dCAPS-2经PCR扩增得到的扩增产物大小为452 bp，经过限制性内切酶EcoR I 酶切后得到特异性条带。其中，恢复系父本的扩增产物可以被切开一条带，片段大小为427 bp，不育系母本的扩增产物不能被切开，仍为452 bp，纯合可育单株的扩增产物可以被切开，带型与父本的扩增产物一致，杂合型单株的扩增产物出现427 bp和452 bp两条带（图5a）。而Rf1-dCAPS-3标记的扩增产物经过限制性内切酶Mbo I酶切后，父本与纯合可育单株的扩增产物可以被切开一条327 bp的条带，不育单株的扩增产物无法被切开，仍为352 bp，而杂合单株的扩增产物可以被切开为327 bp和352 bp两条明显的条带（图5b）。这表明Rf1-dCAPS-2和Rf1-dCAPS-3均可利用琼脂糖凝胶电泳明显区分纯合可育单株（RfRf）、杂合半不育单株（Rfrf）和纯合不育单株（rfrf）的基因型，未来可用于含GmRf1恢复系材料的筛选和分子标记辅助选育。

图5 限制性内切酶酶切得到的特异性条带

Fig.5 Specific bands obtained by restriction endonuclease digestion

A： Rf1-dCAPS-2扩增产物经EcoR I酶切后的条带； B： Rf1-dCAPS-3扩增产物经Mbo I 酶切后的条带；M： 100 bp DNA ladder；P1：父本；P2：母本；A：半不育单株；1~5：纯合可育基因型单株；6~10：杂合基因型单株；11~14：纯合不育基因型单株

A： The bands of amplified products of Rf1-dCAPS-2 digested by EcoR I； B： The bands of amplified products of Rf1-dCAPS-3 digested by Mbo I； M： 100 bp DNA ladder； P1： Male parent； P2： Female parent； A： Semi sterile plant； 1-5： Homozygous fertile plants； 6-10： Heterozygous plants； 11-14： Homozygous sterile plants

3 讨论

大多数植物的CMS与线粒体内调控能量代谢的基因转录异常有关，线粒体由于自身能量代谢紊乱，而花药发育需要大量能量供给，紊乱的能量代谢使得生殖细胞发育直接或间接受到影响，最终出现败育^［

16］。而很多PPR蛋白的靶点作用位点均在线粒体上，可以对线粒体内的RNA进行转录前或转录后的调控^{［参考文献 17

百度学术}17］。因此，很多学者认为Rf基因可能是由PPR蛋白进化而来的，能对很多RNA的异常转录进行调控，从而使育性得到恢复^{［参考文献 18

百度学术}18］。但是，也有极个别的Rf基因不是PPR蛋白，如水稻Rf2基因、Rf17基因^{［参考文献 19

百度学术}19］和玉米Rf2基因^{［参考文献 20

百度学术}20］。本研究鉴定的大豆CMS-RN型不育系的育性恢复基因GmRf1，可能是由于编码区出现的3个单碱基突变导致其编码氨基酸发生替换而形成新功能，通过自身的线粒体靶向肽引导进入线粒体影响不育基因转录或翻译产物的积累，从而使与不育系杂交的F₁植株恢复育性。前期Wang等^{［参考文献 8

百度学术}8］研究证实，Glyma.16G161900所编码的蛋白，也可以恢复CMS-N8855型不育系杂交F₁的育性。这表明GmRf1是一个适用于不同CMS类型不育系的广谱恢复基因。另外，本研究在进行候选基因差异表达分析时发现，与不育系JLCMS204A相比，Glyma.16G163100同样在恢复系JLR230中呈现出较高的表达水平。因此，Glyma.16G163100也可能与Glyma.16G161900形成串联PPR蛋白，在JLR230中协同行使育性恢复作用。

虽然目前已有30余个大豆杂交种通过审定^［

21］，但均由三系法育成。可用不育系均为配子体遗传模式，这导致其及其与恢复系杂交育成的杂交种均易受环境影响，育性不稳定，这与恢复系的恢复能力有很大关系。在杂交水稻品种选育中，明恢63是应用最广泛，也是杂交组配最稳定的CMS恢复系，这可能与明恢63中含有两个恢复基因Rf3和Rf1B有关^{［参考文献 22

百度学术}22］。蔡健等^{［参考文献 23

百度学术}23］对水稻CMS恢复基因Rf3和Rf4进行了聚合效应分析发现，双聚合片段系可以提高F₁杂种植株的花粉育性。Huang等^{［参考文献 24

百度学术}24］研究也发现，同时具有Rf5和Rf6基因的杂种F₁的花粉75%为正常可育，而不是单个恢复基因的50%。这表明同时聚合多个恢复基因可以提高恢复系的恢复能力，进而保证杂种F₁植株的育性稳定性。在大豆中目前已有GmRf1和GmRf3被成功克隆，Sun等^{［参考文献 14

百度学术}14］已开发了一个与GmRf3共分离的CAPS标记。而本研究则开发了两个与GmRf1紧密连锁的dCAPS标记并验证可用。这对今后利用上述功能性分子标记，进行不同基因型恢复系的筛选鉴定及多个Rf基因聚合恢复系的辅助选育和创制，加速杂交大豆品种选育和应用进程提供理论和技术支撑。

参考文献

赵丽梅，孙寰，王曙明，王跃强，黄梅，李建平. 大豆杂交种杂交豆1号选育报告. 中国油料作物学报， 2004， 26（3）：15-17 [百度学术]

Zhao L M， Sun H， Wang S M， Wang Y Q， Huang M， Li J P. Breeding report of soybean hybrid No. 1. Chinese Journal of Oil Crop Sciences， 2004， 26（3）：15-17 [百度学术]

彭宝，张春宝，张伟，张井勇，闫昊，林春晶，王鹏年，赵丽梅. “双高”大豆杂交种吉育612创制及高产制种技术研究. 大豆科学， 2019， 38（3）：501-502 [百度学术]

Peng B， Zhang C B， Zhang W， Zhang J Y， Yan H， Lin C J， Wang P N， Zhao L M. The creation and high-yield seed production technology of 'double high' soybean hybrid Jiyu 612. Soybean Science， 2019， 38（3）：501-502 [百度学术]

赵丽梅，王玉民，孙寰，赵洪锟，程延喜，彭宝，王曙明，张伟龙，董英山.大豆细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记. 大豆科学， 2007， 26（6）：835-839 [百度学术]

Zhao L M， Wang Y M， Sun H， Zhao H K， Cheng Y X， Peng B， Wang S M， Zhang W L， Dong Y S. Identification of SSR makers linked to the fertility restorer gene for the CMS in soybean. Soybean Science， 2007， 26（6）：835-839 [百度学术]

Wang Y M， Zhao L M， Wang X Z， Sun H. Molecular mapping of a fertility restorer gene for cytoplasmic male sterility in soybean. Plant Breeding， 2010， 129（29）：9-12 [百度学术]

任良真. 大豆细胞质雄性不育恢复基因的SSR标记. 长春：吉林大学， 2012 [百度学术]

Ren L Z. SSR makers of cytoplasmic male sterility restorer gene in soybean. Changchun： Jilin University， 2012 [百度学术]

王鹏年. RN型大豆细胞质雄性不育恢复基因的精细定位. 长春：吉林农业大学， 2016 [百度学术]

Wang P N. Fine mapping of restorer genes for cytoplasmic male sterility in RN soybean. Changchun： Jilin Agricultural University， 2016 [百度学术]

Yang S P， Duan M P， Meng Q C， Qiu J， Fan J M， Zhao T J， Yu D Y， Gai J Y. Inheritance and gene tagging of male fertility restoration of cytoplasmic-nuclear male-sterile line NJCMS1A in soybean. Plant Breeding， 2007， 26：302-305 [百度学术]

Wang T L， He T T， Ding X L， Zhang Q Q， Yang L S， Nie Z X， Zhao T J， Gai J Y， Yang S P. Confirmation of GmPPR576 as a fertility restorer gene of cytoplasmic male sterility in soybean. Journal of Experimental Botany， 2021， 72（22）：7729-7742 [百度学术]

汤复跃，周立人，程潇，张磊，陈培，江莹芬. 大豆M型细胞质雄性不育恢复基因SSR标记初步定位. 大豆科学， 2008， 27（3）：383-386 [百度学术]

Tang F Y， Zhou L R， Cheng X， Zhang L， Chen P， Jiang Y F. Preliminary mapping of SSR markers for restorer gene of soybean M-type cytoplasmic male sterility. Soybean Science， 2008， 27（3）：383-386 [百度学术]

Wang D G， Zhang L， Li J K， Hu Q， Jiang H Y， Huang Z P. The restorer gene for soybean M-type cytoplasmic male sterility， Rf-m is located in a PPR gene-rich region on chromosome 16. Plant Breeding， 2016， 135（3）：342-348 [百度学术]

焦东燕. 大豆杂种优势及细胞质雄性不育恢复基因的定位. 石家庄：河北师范大学， 2011 [百度学术]

Jiao D Y. Mapping of heterosis and cytoplasmic male sterility restorer genes in soybean. Shijiazhuang： Hebei Normal University， 2011 [百度学术]

Dong D K， Li Z，Yuan F J， Zhu S L， Chen P， Yu W， Yang Q H， Fu X J， Yu X M， Li B Q， Zhu D H. Inheritance and fine mapping of a restorer-of-fertility gene for the cytoplasmic male sterility in soybean. Plant Science， 2012， 188：36-40 [百度学术]

贾顺耕，郭凤兰，林春晶，孙妍妍，张颖，雷蕾，彭宝，赵丽梅，张春宝. 大豆细胞质雄性不育育性恢复基因Rf3的定位. 植物遗传资源学报， 2021， 22（5）：1411-1417 [百度学术]

Jia S G， Guo F L， Lin C J， Sun Y Y， Zhang Y， Lei L， Peng B， Zhao L M， Zhang C B. Mapping of fertility restoring gene Rf3 for cytoplasmic male sterility in soybean. Journal of Plant Genetic Resources， 2021， 22（5）：1411-1417 [百度学术]

Sun Y Y， Zhang Y， Jia S G， Lin C J， Zhang J Y， Yan H， Peng B， Zhao L M， Zhang W， Zhang C B. Identification of a candidate restorer-of-fertility gene Rf3 encoding a pentatrico peptide repeat protein for the cytoplasmic male sterility in soybean. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23（10）：5388 [百度学术]

郭凤兰，林春晶，王鹏年，杨绪磊，吴铮，彭宝，赵丽梅，张春宝. 大豆细胞质雄性不育恢复基因GmRf1的精细定位. 植物遗传资源学报， 2022， 23（2）：518-526 [百度学术]

Guo F L， Lin C J， Wang P N， Yang X L， Wu Z， Peng B， Zhao L M， Zhang C B. Fine mapping of a restorer-of-fertility gene GmRf1 for the cytoplasmic male sterility in soybean. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23（2）：518-526 [百度学术]

燕厚兴，林春晶，范亚军，张春宝. 植物细胞质雄性不育基因克隆及分子机制研究进展. 植物生理学报， 2022， 58（1）：61-76 [百度学术]

Yan H X， Lin C J， Fan Y J， Zhang C B. Research progress on cloning and molecular mechanism of cytoplasmic male sterility genes in plants. Plant Physiology Journal， 2022， 58（1）：61-76 [百度学术]

Bentolila S， Alfonso A A， Hanson M R. A pentatricopeptide repeat-containing gene restores fertility to cytoplasmic male-sterile plants. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America， 2002， 99（16）：10887-10892 [百度学术]

李鹏. 玉米S型细胞质雄性不育恢复基因Rf3的精细定位及其功能验证. 泰安：山东农业大学， 2014 [百度学术]

Li P. Fine-mapping and functional verification of the restorer Rf3 of CMS-S in maize. Taian： Shandong Agricultural University， 2014 [百度学术]

Itabashi E， Iwata N， Fujii S， Kazama T， Toriyama K. The fertility restorer gene， Rf2， for Lead Rice-type cytoplasmic male sterility of rice encodes a mitochondrial glycine-rich protein. The Plant Journal， 2011， 65（3）：359-367 [百度学术]

Cui X， Wise R P， Schnable P S. The rf2 nuclear restorer gene of male-sterile T-cytoplasm maize. Science， 1996， 272（5266）：1334-1336 [百度学术]

孙妍妍，赵丽梅，张伟，张春宝. 大豆杂种优势利用研究进展. 大豆科技， 2021， 6：26-35 [百度学术]

Sun Y Y， Zhao L M， Zhang W， Zhang C B. Research progress on utilization of soybean heterosis. Soybean Science and Technology， 2021， 6：26-35 [百度学术]

吴方喜，蔡秋华，朱永生，张建福，谢华安. 籼型杂交稻恢复系明恢63的利用与创新. 福建农业学报， 2011， 26（6）：1101-1112 [百度学术]

Wu F X， Cai Q H， Zhu Y S， Zhang J F， Xie H A. Application of indica restorer line， Minghui 63， for rice hybridization. Fujian Journal of Agricultural Sciences， 2011， 26（6）：1101-1112 [百度学术]

蔡健，范海燕，廖秋平，马同富，张桂权. 水稻恢复基因Rf3和Rf4聚合效应分析. 南京农业大学学报， 2014， 37（3）：20-26 [百度学术]

Cai J， Fan H Y， Liao Q P， Ma T F， Zhang G Q. Analysis of pyramiding effect of the Rf3 and Rf4 genes on fertility restoration in rice with cytoplasmic male sterility. Journal of Nanjing Agricultural University， 2014， 37（3）：20-26 [百度学术]

Huang W C， Hu J， Yu C C， Huang Q， Wan L， Wang L L， Qin X J， Ji Y X， Zhu R S， Li S Q， Zhu Y G. Two non-allelic nuclear gene restore fertility in a gametophytic pattern and enhance abiotic stress tolerance in the hybrid rice plant. Theoretical and Applied Genetics， 2012， 124（5）：799-807 [百度学术]

请使用 Firefox、Chrome、IE10、IE11、360极速模式、搜狗极速模式、QQ极速模式等浏览器，其他浏览器不建议使用!