摘要
小麦籽粒硬度是影响小麦商品分类分级、小麦制粉工艺和小麦面粉最终加工用途的重要指标，分子标记辅助选择可以有效提高小麦籽粒硬度的选育效率。为了发掘和开发更多与小麦籽粒硬度紧密连锁的分子标记，本研究采用硬质小麦扬麦158与软质小麦西风配制重组自交系群体，利用55K SNP芯片分析群体基因型并构建了群体遗传连锁图，结合4年群体籽粒硬度的表型资料对影响小麦籽粒硬度的QTL进行了分子定位。结果显示，构建的遗传连锁图覆盖2784.9 cM，含有3830个非共分离的SNP标记；除PIN基因外，共定位到12个可重复的QTL位点，分别位于1A、1B、1D、2A（2个）、3A、4D、5A、5D、6B、6D和7A染色体，单个QTL可解释3.2%~15.2%籽粒硬度变异；11个QTL来自软质小麦西风，1个QTL由硬质小麦扬麦158贡献；7个QTL表现稳定，可在4年试验中重复，其中5个QTL未见报道，为新发现QTL，特别是5D染色体新发现的QTL最高可解释15.2%表型变异。与这些稳定QTL紧密连锁的SNP标记将为今后开展长江中下游麦区软质小麦的分子标记辅助选择提供帮助。
小麦籽粒硬度是指破坏小麦籽粒所受到的阻力，是影响小麦商品分类分级、小麦加工制粉工艺以及小麦面粉最终加工用途的重要指
遗传分析发现，自然群体和双亲分离群体中的小麦籽粒硬度是呈连续分布的，表明该性状是受多基因控制的数量性状。位于5D染色体短臂的Hardness Locus（Ha）位点是决定小麦籽粒硬度的主效基因位点。分子生物学的解析表明，该位点包括Puroindoline a（Pina）、Puroindoline b（Pinb）以及Grain softness protein-1（Gsp-1）等基因，Pina和（或）Pinb基因的突变是导致小麦籽粒硬度增加的主要原
利用Ha位点相同的双亲配制的分离群体进行籽粒硬度分析发现，除了Ha位点外，还存在其他控制籽粒硬度的主效QTL位点，如Gross
本研究利用软质小麦西风与硬质小麦扬麦158配制重组自交系群体，采用55K芯片进行基因型分析，结合4年的群体籽粒硬度表型资料，定位影响小麦籽粒硬度的QTL，以期为今后开展长江中下游麦区软质小麦的选育提供帮助。
硬质小麦扬麦158为江苏里下河地区农业科学研究所培育的品种，曾在长江中下游麦区大规模种植。软质小麦西风引自日本，是优质弱筋小麦宁麦9号的父本。以扬麦158为母本，西风为父本，杂交后采用单粒传的方法构建重组自交系群体，至2017年已达F6，该群体包括281个家系，其中270个家系用于本研究基因型和QTL定位分析。
重组自交系群体及其亲本基因型检测由中玉金标记生物技术有限公司（北京）采用55K SNP芯片（Axio
重组自交系群体及其亲本分别于2017-2018年度（2018）、2018-2019年度（2019）、2019-2020年度（2020）以及2021-2022年度（2022）种植于江苏省农业科学院六合试验基地（南京市竹镇镇金磁村），行长1.6 m，行距0.25 m，每行均匀播种40粒种子，田间管理按常规方法进行，成熟后收获晒干。亲本和群体每个家系随机取300粒，用SKCS 4100单籽粒谷物特性测定仪（Perten，瑞典）测定籽粒硬度指数，以籽粒硬度指数指示籽粒硬度，数字越大，预示籽粒越硬。
籽粒硬度遗传力（
群体籽粒硬度概况、分布、年度间相关分析以及方差分析均采用Excel软件进行。QTL定位采用MapQTL5.0软
采用WheatOmics网
采用55K芯片对重组自交系群体及其亲本进行基因型分析，数据经过滤，剔除基因型缺失超过10%的标记，共获得13482个SNP标记。用JoinMap软件计算标记间的相似性，将共分离的2077个标记去除，共11405个SNP标记用于遗传连锁图构建，其中3830个标记可以构建连锁群。共获得24个连锁群，分布于小麦21条染色体，其中3D染色体包含2个连锁群，6A染色体包含3个连锁群，其他染色体均为1个连锁群。遗传连锁图覆盖2784.9 cM，各染色体覆盖遗传距离和SNP标记数见
染色体 Chromosome | SNP标记数 Number of SNPs | 遗传距离（cM） Genetic distance |
|---|---|---|
|
1A 1B 1D 2A 2B 2D 3A 3B 3D-1 3D-2 4A 4B 4D 5A 5B 5D 6A-1 6A-2 6A-3 6B 6D 7A 7B 7D |
188 108 62 122 166 157 343 110 4 71 149 126 116 348 245 111 75 20 12 143 115 307 261 371 |
138.7 130.7 145.7 111.1 106.0 125.0 160.3 111.7 10.0 122.3 172.5 146.5 135.2 136.6 124.5 149.5 0.2 60.7 21.9 94.1 153.9 171.3 121.2 135.0 |
| 合计 Total | 3830 | 2784.9 |
目前常用的籽粒硬度测定主要采用3种方法：颗粒度指数法（PSI，particle size index）、近红外反射光谱法（NIRS，near-infrared reflectance spectroscopy）以及单籽粒谷物特性测定仪法（SKCS，single-kernel characterization system）。相对于前两种方法依赖于面粉的颗粒度，SKCS法直接对籽粒压碎测定，短时间可以处理大量样品且重复性好，因而被广泛使用。本研究采用该方法对4个年度的群体和亲本样品进行了籽粒硬度指数测定，发现年度间的相关性较高，相关系数在0.75~0.81 （
| 年份 Year | 2018 | 2019 | 2020 |
|---|---|---|---|
|
2019 2020 2022 |
0.81 0.77 0.78 |
0.81 0.75 |
0.80 |
年份 Year | 亲本 Parents | 重组自交系群体 Recombinant inbred lines | |||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|
西风 Xifeng | 扬麦158 Yangmai158 | 最小值 Min. | 最大值 Max. | 平均值 Average | 偏度 Skewness | 峰度 Kurtosis | |
|
2018 2019 2020 2022 |
27.66 22.28 24.76 17.06 |
60.18 49.05 56.66 46.16 |
9.17 0.45 7.22 0.26 |
86.66 67.26 80.60 81.94 |
44.36 32.24 39.23 34.47 |
0.36 0.38 0.30 0.38 |
-1.34 -0.72 -0.77 -1.05 |
控制小麦籽粒硬度主要基因Pina和Pinb分别位于中国春参考基因组（IWGSC RefSeq v1.0）5D染色体的3591526~3591972 bp和3609672~3610121 bp，但本研究所采用的SNP标记从3936601 bp开始，构建的5D染色体连锁图不包括Pina和Pinb基因所在染色体区域。对亲本的PIN基因分析发现，西风两个基因均为野生型，扬麦158的Pina基因为野生型，而Pinb基因为Pinb-D1b突变型。结合重组自交系群体Pinb基因型分析结果和4个年度的群体籽粒硬度指数对该基因的表型解释率进行了分析，发现Pinb基因可分别解释群体51.57%、39.52%、46.54%和58.08%的籽粒硬度变异，仍是影响小麦籽粒硬度的主效基因。
综合群体基因型、遗传连锁图信息和群体籽粒硬度指数测定结果，采用MapQTL软件对控制籽粒硬度的QTL进行定位，在11个染色体共发现12个可重复的QTL（
（图1）
斜体并下划线所示标记为QTL所在区域
Italic and underlined markers indicate the interval of QTL
图1 籽粒硬度相关QTL染色体分布图
Fig.1 Distribution of QTLs for grain hardness in chromosome
QTL名称 QTL name | 染色体 Chromosome | 连锁图位置（cM） Location in linkage map | 染色体位置 （Mb） Chromosome position | QTL区间 Interval of QTL | 2018 | 2019 | 2020 | 2022 | ||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| LOD | 解释率 （%） VE | 加性效应 Additive effects | LOD | 解释率 （%） VE | 加性效应 Additive effects | LOD | 解释率 （%） VE | 加性效应 Additive effects | LOD | 解释率 （%） VE | 加性效应 Additive effects | |||||
|
QGh·jaas-1A
QGh·jaas-1B
QGh·jaas-1D
QGh·jaas-2A.1
QGh·jaas-2A.2
QGh·jaas-3A
QGh·jaas-4D
QGh·jaas-5A
QGh·jaas-5D
QGh·jaas-6B
QGh·jaas-6D
QGh·jaas-7A |
1A
1B
1D
2A
2A
3A
4D
5A
5D
6B
6D
7A |
50.67~56.67
70.19~70.54
64.43~65.80
0.00~0.01
102.77~104.01
6.85~23.07
47.00~47.23
77.18~77.33
71.89~74.79
16.08~16.09
90.46~94.92
1.12~2.46 |
532.4~533.8
648.0~648.1
463.5
35.7~35.8
3.4~5.0
700.4~708.1
504.3~505.3
473.0~669.6
29.5
138.0~141.7
66.0
733.9~734.1 |
AX-111065926~ AX-111054747
AX-109483648~ AX-110994704
AX-111716200~ AX-109929813
AX-109405059~ AX-109900454
AX-111015252~ AX-108795428
AX-110035889~ AX-109932282
AX-89682227~ AX-111463890
AX-108801536~ AX-111535516
AX-94885634~ AX-109324087
AX-109356924~ AX-110199811
AX-109194293~ AX-109458881
AX-108912046~ AX-110597063 |
2.49
4.24
2.96
2.54
3.68
-
2.43
3.18
7.82
4.19
2.71
4.03 |
5.0
7.0
6.2
4.0
5.9
-
4.1
5.3
14.4
7.0
4.3
6.7 |
-5.41
-5.46
-5.59
-4.16
5.05
-
-4.17
-4.72
-8.33
-5.43
-4.35
-5.31 |
4.68
5.07
2.35
2.67
-
2.13
2.42
-
5.96
2.35
2.09
- |
10.5
8.5
4.8
4.6
-
4.9
4.1
-
8.7
4.0
3.6
- |
-5.55
-4.51
-3.72
-3.33
-
-3.80
-3.15
-
-4.58
-3.10
-2.92
- |
2.84
3.21
2.89
3.62
2.95
4.10
2.28
2.51
8.19
3.87
2.42
- |
5.1
5.4
5.9
6.1
5.7
9.2
3.7
4.1
15.2
6.4
3.9
- |
-3.33
-3.69
-4.23
-3.94
4.12
-5.36
-3.04
-3.25
-6.62
-4.01
-3.44
- |
3.14
4.60
2.76
2.15
2.00
-
-
3.61
6.67
3.49
2.85
4.19 |
6.7
7.6
4.6
3.5
3.2
-
-
6.0
11.4
5.8
4.8
7.0 |
-5.00
-4.80
-3.75
-3.28
3.12
-
-
-4.24
-6.06
-4.19
-3.79
-4.60 |
加性效应负值表示降低籽粒硬度指数，来自于亲本西风；正值表示增加籽粒硬度指数，来自于亲本扬麦158
The negative additive effect indicates the decrease of grain hardness index， which comes from the parent Xifeng. Positive values indicate increased kernel hardness index， which comes from parent Yangmai 158
群体中含有扬麦158 Pinb-D1b突变型基因家系的平均籽粒硬度指数为52.28，含有西风pinb野生型基因家系的平均籽粒硬度指数只有26.53，pinb野生型基因家系较突变型基因家系平均籽粒硬度指数降低49.25%。群体中含有Pinb-D1b突变型基因且不含来自西风的7个稳定QTL家系的平均籽粒硬度指数为62.76，含有7个稳定QTL且具有pinb野生型基因家系的平均籽粒硬度指数则为23.94，平均籽粒硬度指数降低了61.85%（
基因或QTL Gene or QTL | 2018 | 2019 | 2020 | 2022 | 平均 Average | ||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
| 含有Yes | 不含有No | 降低（%） Decrease | 含有Yes | 不含有No | 降低（%） Decrease | 含有Yes | 不含有No | 降低（%） Decrease | 含有Yes | 不含有No | 降低（%） Decrease | 含有Yes | 不含有No | 降低（%） Decrease | |
|
pinb野生型基因 pinb wild type gene pinb野生型基因+7个稳定的QTL pinb wild type gene + 7 stable QTL |
30.78
26.33 |
62.37
71.46 |
50.65
63.15 |
23.29
21.81 |
44.61
56.92 |
47.79
61.68 |
28.95
26.25 |
52.00
61.23 |
43.33
57.13 |
23.12
21.35 |
50.17
59.42 |
53.92
64.07 |
26.53
23.94 |
52.28
62.76 |
49.25
61.85 |
含有：含有基因或QTL；不含有：表示不含基因或QTL；7个稳定的QTL分别为：QGh·jaas-1A、QGh·jaas-1B、QGh·jaas-1D、QGh·jaas-2A.1、QGh·jaas-5D、QGh·jaas-6B和QGh·jaas-6D
Yes： Have gene or QTL； No： Have no gene or QTL； The seven stable QTL：QGh·jaas-1A，QGh·jaas-1B，QGh·jaas-1D，QGh·jaas-2A.1，QGh·jaas-5D，QGh·jaas-6B and QGh·jaas-6D
参考中国春基因组（IWGSC v1.0）注释基因位置信
小麦籽粒硬度主要由籽粒胚乳淀粉颗粒的表面、极性脂质、储藏蛋白基质和puroindolines蛋白等的相互作用所决定，影响到这些相互作用的基因都对小麦籽粒硬度有不同程度的影响。5D染色体的Pina和Pinb基因是控制小麦籽粒硬度的主要基因，本研究也验证了这一结论，4年的研究结果表明，Pinb突变基因可解释群体39.52%~58.08%的籽粒硬度变异，是影响籽粒硬度的主效基因。与先前的研究相似，除了Pina和Pinb基因，本研究还在小麦11条染色体上定位到12个可重复的影响籽粒硬度QTL，特别是位于1A、1B、1D、2A、5D、6B和6D染色体上来自西风的QTL非常稳定，受环境因素影响较小，在4年的定位中均能发现。
对控制小麦籽粒硬度QTL定位的早期研究，多以RFLP、SSR等分子标记进行基因型分析，由于标记数量少，基因组覆盖的范围有限，因而单次研究定位的QTL数量较少。近年来高密度与高通量的SNP等标记被用于基因分型分析，单次研究定位的QTL数量有所提高。迄今为止，已经在除3D以外的染色体上定位了数十个影响小麦籽粒硬度的QTL。随着中国春参考基因组的公布，更方便了比较不同研究获得的QTL的位置异同。
本研究发现的7个稳定QTL与已报道的影响小麦籽粒硬度QTL在染色体上的位置进行比对，发现其中2个QTL与已报道QTL位置接近，可能为相同QTL，其余5个与已报道QTL位置相差较远，为新发现影响小麦籽粒硬度的QTL。在1A染色体上，先后报道了6个QT
本研究在4年均能检测到的7个稳定QTL全部来自亲本西风，且均具有降低小麦籽粒硬度的作用，采用与这些QTL最紧密连锁的SNP 标记对重组自交系群体分析发现，基因型与亲本西风相同的家系，平均籽粒硬度指数只有23.94，基因型与亲本扬麦158相同的家系，平均籽粒硬度指数则高达62.76，表明这些标记组合可以在软质麦的筛选中发挥重要作用。西风是优质弱筋小麦宁麦9号的父本，宁麦9号继承了西风软质小麦的特性，长江中下游许多软质或弱筋小麦都是宁麦9号的后
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