苦荞<bold>FtEIN3</bold>基因的克隆及其抗立枯病功能分析

李光胜; 卢翔; 刘洋; 张凯旋; 王海华; 唐新科; 周美亮; LI Guangsheng; LU Xiang; LIU Yang; ZHANG Kaixuan; WANG Haihua; TANG Xinke; ZHOU Meiliang

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1. 湖南科技大学生命科学与健康学院，湘潭 411201； 2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081

最近更新：2023-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230222002

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摘要

为了了解苦荞抗立枯病的分子机制，以苦荞代表性品种川荞1号为材料，克隆出FtEIN3基因。生物信息学分析表明，FtEIN3基因的CDS序列长度为1623 bp，编码540个氨基酸，FtEIN3蛋白二级结构由α-螺旋（33.52%）、延伸链（6.67%）、β折叠（2.41%）和无规则卷曲（57.41%）组成。系统进化树显示，苦荞FtEIN3蛋白与棉花GhEIN3、榴莲DzEIN3蛋白亲缘关系较近。通过对108份苦荞种质资源EIN3编码区序列比对，检测到5种不同的单倍型，其中Hap3为优异单倍型。qRT-PCR结果表明，FtEIN3基因在苦荞中的表达受立枯丝核菌侵染的诱导。激光共聚焦显微镜观察下，苦荞FtEIN3基因定位在细胞核上。为进一步验证FtEIN3基因的功能，本研究构建了FtEIN3的转基因拟南芥并分析其抗病性。结果显示，相对于野生型拟南芥，过表达FtEIN3基因显著提高了转基因拟南芥株系的抗立枯病能力。以上结果表明FtEIN3基因参与苦荞麦抗立枯病的防御过程，为进一步研究FtEIN3调控苦荞抗立枯病的分子机制奠定了一定的工作基础。

关键词

苦荞; FtEIN3; 克隆; 拟南芥; 抗立枯病

苦荞（Fagopyrum tataricum（L.）Gaertn.）属蓼科荞麦属，是一种营养均衡且富含类黄酮的作物^［

1］。苦荞营养丰富，具有消炎、杀菌、抗氧化等功能，是一种重要的“药食两用”作物^{［参考文献 2

百度学术}2］。目前人们健康观念加强，越来越多人认识到苦荞的营养价值及重要性^{［参考文献 3

百度学术}3］，由苦荞作为原料的食品也被广泛定义为健康主食^{［参考文献 4

百度学术}4］。近年来，苦荞种植面积逐步扩增，苦荞病害的发生却极大破坏了苦荞的质量和产量^{［参考文献 5

百度学术}5］。在我国昆明、贵阳、通辽、凉山等多个荞麦产区，苦荞立枯病的发生较为严重^{［参考文献 6

百度学术}6］。

苦荞立枯病由立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）引起^［

6］。目前，防治苦荞立枯病一般选用抗病品种为基础，以生物防治为主，化学药剂为辅^{［参考文献 7

百度学术}7］，然而苦荞病害方面缺乏系统而深入的研究^{［参考文献 7-8}7-8］。抗病基因的择取在植物抗病性的遗传改良中具有应用潜力^{［参考文献 9

百度学术}9］。激素在植物抗病和防御体系中起着重要作用，通过研究激素调控网络可预测关键抗病基因^{［参考文献 10

百度学术}10］。基因家族的生物信息学分析有利于证明抗病基因在抗病和抗逆中的作用^{［参考文献 11

百度学术}11］，苦荞立枯病的发生与自身抗病基因也密切相关。

Ethylene-insensitive3（EIN3）转录因子在植物乙烯信号途径中扮演了重要的角色^［

12］。高等植物中，EIN3转录因子存在于细胞核，激活乙烯信号途径下游的乙烯响应基因，以启动乙烯信号转导^{［参考文献 13

百度学术}13］。拟南芥中AtMYC2和AtEIN3基因共同参与损伤反应以及调节防御基因表达^{［参考文献 14

百度学术}14］。此外，EIN3基因还可以增强植物的耐盐性^{［参考文献 15

百度学术}15］。因此，本研究从苦荞中克隆FtEIN3基因，进行了一系列功能分析，最后将FtEIN3过表达至拟南芥，分析了转基因植株的抗病性，为进一步研究抗病基因调控苦荞抗立枯病的分子机制奠定了一定的工作基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料选择川荞1号，该品种在苦荞麦中具有通用性和代表性。选取饱满、大小均匀的苦荞种子，剥去种皮，用75%乙醇消毒10 min，然后用无水乙醇消毒10 min，在超净工作台里晾干。将种子接种在MS固体培养基上，于22 ℃、16 h光照/8 h黑暗循环、湿度75%~80%的温室中培养。

立枯丝核菌菌株（RS，Rhizoctonia solani）、大肠杆菌菌株DH5α、转化农杆菌菌株GV3101、植物过表达载体pCAMBIA1307，亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GFP、细胞核maker载体p2300（p2300-35S-H2B-mCherry-OCS）均由中国农业科学院荞麦基因资源创新研究组提供。

1.2 苦荞总RNA的提取及cDNA的合成

取苦荞幼苗100 mg左右，按照植物组织RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，中国北京）说明书提取苦荞总RNA。测定RNA的OD_260/280值，用1.2%琼脂糖凝胶电泳对RNA进行检测后，对检测合格的RNA进行反转录得到cDNA，将cDNA保存于-20℃冰箱。

1.3 苦荞FtEIN3基因的克隆与生物信息学分析

利用Primer 5设计FtEIN3基因全长扩增引物对FtEIN3-F/R（表1），以反转录后的cDNA为模板进行PCR反应扩增。PCR反应总体系为50 μL：2×Phanta Max Master Mix 25 μL、正反向引物各2 μL、cDNA模板200 ng、ddH₂O补充至50 μL。反应条件为94℃预变性2 min；94℃变性30 s，55℃退火60 s，72℃延伸1 min，30个循环；最后72 ℃延伸7 min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后，回收纯化。纯化产物连接至pTOPO-Blunt Simple Vector并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，挑选单菌落，经菌液PCR鉴定后送公司进行测序，得到FtEIN3-T载体的质粒。

表1 引物序列汇总

Table 1 Summary of primer sequences

引物名称 Primer name	引物序列（5’-3’） Primer sequence（5’-3’）	用途 Function
FtEIN3-F	ATGTCAGGGATGAACTTTTTCG	基因克隆
FtEIN3-R	TTAAATGAACCAAACAGAAGAATCC	基因克隆
FtEIN3-qPCR-F	TCGGCTTGGGTTTATC	qRT-PCR
FtEIN3-qPCR-R	TAAGGGAAGTGGTAGTTTG	qRT-PCR
FtH3-qPCR-F	GAAATTCGCAAGTACCAGAAGAG	qRT-PCR苦荞内参基因
FtH3-qPCR-R	CCAACAAGGTATGCCTCAGC	qRT-PCR苦荞内参基因
1302-FtEIN3-F	ACGGGGGACTCTTGACCATGGTAATGTCAGGGATGAACTTTTTCGA	构建亚细胞定位载体
1302-FtEIN3-R	AAGTTCTTCTCCTTTACTAGTAATGAACCAAACAGAAGAATCCT	构建亚细胞定位载体
1302-F	GCCCAGCTATCTGTCACTTTATTG	1302通用引物
1302-R	TAAGAGAAAGTAGTGACAAGTG
1307-FtEIN3-F	GACTTGAACTCGGTATCTAGAATGTCAGGGATGAACTTTTTCGA	构建过表达载体
1307-FtEIN3-R	CTTGATATCGAATTCCTGCAGTTAAATGAACCAAACAGAAGAATCCT	构建过表达载体
TLF	CTCAAGCAATCAAGCATTCTAC	1307通用引物
1307-R	TATCTGGGAACTACTCACACATTA	1307通用引物
Actin7-F	TCCATGAAACAACTTACAACTCCATCA	qRT-PCR拟南芥内参基因
Actin7-R	CATCGTACTCACTCTTTGAAATCCACA	qRT-PCR拟南芥内参基因

对测序得到的正确序列进行生物信息学分析，应用PSIPRED Workbench（ucl.ac.uk）、SWISS-MODEL Interactive Workspace（expasy.org）网站对FtEIN3蛋白二级结构和三级结构进行预测，利用Plant CARE（http：//bioinformatics.psb.ugent. be/webtools/plantcare/html/）在线网站对基因启动子序列进行分析；再通过NCBI（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）中BLASTP搜索与该基因同源性较高的序列，并利用MEGAX软件构建进化树。

1.4 FtEIN3基因在苦荞材料中的多样性分析

通过分析课题组前期重测序工作所建立的数据库（未发表），选择108份苦荞材料对苦荞FtEIN3基因（苦荞数据登录号：FtPinG0707941400.01）进行单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphism）分析，其由7份喜马拉雅野生群体、78份北方群体和23份南方群体组成。

1.5 立枯丝核菌的培养和活化

1.5.1 PDB培养基的制备

称取马铃薯葡萄糖液体培养基Potato Dextrose Broth（PDB）（北京酷来博科技有限公司，中国北京）粉末26 g于蒸馏水中充分溶解，定容至1 L，摇匀后分装到250 mL锥形瓶中，封口，121℃高压灭菌20 min，4℃冰箱中保存备用。

1.5.2 PDA培养基的制备

称取马铃薯葡萄糖琼脂培养基Potato Dextrose Agar（PDA）（北京酷来博科技有限公司，中国北京）粉末11.5 g于蒸馏水中，充分溶解后定容至250 mL，高压灭菌锅灭菌，倒板，每板25 mL左右，待凝固后4 ℃保存备用。

1.5.3 菌株的活化

将立枯丝核菌接种于PDA上，置于28 ℃恒温培养箱中活化，暗培养3~5 d，得到立枯丝核菌菌株。取PDA上2块长势一致的立枯丝核菌菌株分别接种于PDB中，28 ℃恒温摇床暗培养2~3 d，过滤，得到立枯丝核菌菌液。

1.6 FtEIN3的表达分析

1.6.1 苦荞FtEIN3基因的表达分析

选取生长15 d的长势良好的苦荞麦川荞1号无菌苗，用立枯丝核菌菌液侵染，于28 ℃恒温培养箱培养，待侵染0、6、12、24、48 h时取样，提取样品的叶、茎、根组织中的总RNA，测定FtEIN3基因在苦荞不同组织中的相对表达量。

将FtEIN3转基因拟南芥OE3株系和野生型拟南芥在同一条件下正常培养25 d。4株拟南芥为一组、种在同一盆内，选取3组拟南芥进行立枯丝核菌侵染，每3组分别侵染0、6、12、24、48 h。提取野生型拟南芥和OE3各个侵染时间段的RNA，反转录得到cDNA。采用qRT-PCR方法检测野生型拟南芥和OE3在不同侵染时间段下的表达模式。

1.6.2 实时荧光定量PCR

根据FtEIN3基因的非保守区间，设计荧光定量引物对FtEIN3-qPCR-F/R（表1）。荞麦组成型表达基因FtH3作为内参基因，引物名称为FtH3-qPCR-F/R（表1）。采用南京诺唯赞生物技术有限公司Taq Pro Universal SYBR qPCR Master Mix 荧光定量试剂盒和7500 Real Time PCR System仪器进行qRT-PCR检测和分析。相对表达量计算使用2^-∆∆Ct法。

1.7 转基因拟南芥的构建

1.7.1 pCAMBIA1307-FtEIN3过表达载体的构建

根据基因克隆测序结果正确的FtEIN3序列和过表达载体 pCAMBIA1307 图谱设计引物对1307-FtEIN3-F/R，以FtEIN3-T质粒为模板，进行PCR扩增反应；同时，用限制性内切酶Xba Ⅰ、Pst Ⅰ酶切pCAMBIA1307载体。两者均用琼脂糖凝胶电泳检测，纯化回收，再进行同源重组连接，然后转化于DH5α感受态细胞，挑取单克隆菌落，经菌液PCR检测及测序结果比对正确，即得到过表达载体pCAMBIA1307-FtEIN3（简称1307-FtEIN3）。同理也得到亚细胞定位载体pCAMBIA1302-GFP-FtEIN3（简称1302- FtEIN3）。

1.7.2 转化农杆菌GV3101及侵染拟南芥

pCAM BIA1307-FtEIN3重组质粒转化至农杆菌GV3101感受态细胞中，挑取单克隆菌落，筛选鉴定得到阳性克隆。将阳性菌液摇至吸光度OD₆₀₀到0.6~0.8，使用蘸花法对野生型拟南芥进行侵染试验。收取转基因植株T₀种子，使用潮霉素抗性MS固体培养基筛选获得T₁转基因拟南芥。提取T₁幼苗叶片基因组DNA为模板，以pCAMBIA1307载体通用引物TLF作为正向引物，基因特异性引物1307-FtEIN3-R为反向引物进行PCR反应，检测后获得单株阳性过表达拟南芥植株（OE，overexpression）。

1.8 FtEIN3的亚细胞定位

应用多个亚细胞定位预测网站（https：//wolfpsort.hgc.jp、http：//cello.life. nctu. edu.tw、http：//www.csbio.sjtu.edu. cn/bioinf/Cell-PLoc-2、http：//linux1.sofcn/bioinf/Cell-PLoc-2、http：//linux1.softberry.com/berry.phtml？topic=protcomppl&subgroup=proloc）预测FtEIN3基因的亚细胞定位。

播撒烟草种子于营养土中，温室培养25~30 d。将细胞核标记载体p2300（全称为p2300-35S-H2B-mCherry-OCS）、1302空载体（全称为pCAMBIA 1302-GFP）和1302- FtEIN3转化至农杆菌GV3101，PCR鉴定为阳性后，接种于10 mL培养基中，摇至OD₆₀₀值为0.6~0.8，8000 rpm，离心5 min集菌，用重悬液重悬菌体（重悬液配方（现用现配）为1mol/L MgCl₂ 1 mL、0.2mol/L MES 5 mL、100 μmol/L乙酰丁香酮100 μL、ddH₂O定容至100 mL）。挑选生长状况良好的本氏烟草叶片，用去针头的注射器从下表皮注射，并做好标记。将注射好的植株暗培养12 h，再正常培养12~24 h，将叶片制成玻片并于激光共聚焦显微镜（ZEISS，LSM 900）观察拍照。

1.9 转基因拟南芥株系抗病性的鉴定

将转基因拟南芥株系和野生型拟南芥种子经消毒晾干后点播在MS固体培养基上。将生长7 d的幼苗转到蛭石∶营养土为1∶1的培养盆中，16 h光照/8 h黑暗，22 ℃培养3周。为了鉴定FtEIN3过表达转基因株系的抗病性，用立枯丝核菌侵染转基因株系和野生型拟南芥的离体叶片：在培养皿中放置滤纸，用水润湿，以保持叶片湿度，取叶片置于滤纸上，50%叶片用病菌侵染，50%叶片不做处理，注意分开已侵染与未侵染的培养皿，用保鲜膜封住，放置于28 ℃培养箱暗培养，24 h后观察其病害情况。进一步做二氨基联苯胺（DAB，diaminobenzidine）染色试验以观察病斑情况。在野生型拟南芥和FtEIN3转基因拟南芥正常发育到苗期时，为了研究其体内超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、过氧化物酶（POD，peroxidase）和丙二醛（MDA，malondialdehyde）的活性变化，对野生型拟南芥和转基因拟南芥均进行立枯丝核菌侵染处理，不侵染的为对照组。24 h后，取样进行活性检测。

运用Excel软件和Origin 2019b 64Bit等生物信息学软件对数据进行计算、处理和统计分析。

2 结果与分析

2.1 苦荞抗病基因FtEIN3的序列扩增与生物信息学分析

提取川荞1号幼苗的RNA，经反转录得到cDNA。以该cDNA为模板进行PCR扩增，利用1%琼脂糖凝胶电泳检测。如图1显示，目的基因条带大小在1500~2000 bp之间，与FtEIN3基因大小一致。

图1 苦荞FtEIN3基因CDS序列扩增

Fig.1 CDS sequence amplification of FtEIN3 in tartary buckwheat

Maker：DL2000 maker；1：FtEIN3基因的PCR扩增目的条带

Maker：DL2000 marker；1：The PCR amplification target band of FtEIN3 gene

生物信息学分析表明，FtEIN3基因的CDS序列长度为1623 bp，编码540个氨基酸。应用ExPASy网站对其蛋白性质进行分析，结果表明，FtEIN3蛋白的理论相对分子质量为61.10 kDa，理论等电点为5.87，预测的分子式为C₂₆₈₇H₄₁₇₅N₇₅₁O₈₃₄S₃₁，不稳定指数为56.84>40，亲水性平均值为-0.774（负值代表亲水），由此表明FtEIN3蛋白是不稳定的亲水性蛋白。

FtEIN3蛋白二级结构（图2A）由α-螺旋（33.52%）、延伸链（6.67%）、β折叠（2.41%）和无规则卷曲（57.41%）组成。对其三级结构模型进行作图，结果与二级结构一致（图2B）。

图2 FtEIN3蛋白的二级结构和三级结构预测

Fig.2 Secondary structure and tertiary structure prediction of FtEIN3 protein

A：FtEIN3蛋白二级结构；蓝色：α-螺旋；红色：延伸链；绿色：β折叠；紫色：无规则卷曲；B：FtEIN3蛋白三级结构

A：Secondary structure of FtEIN3 protein； Blue： Alpha helix； Red： Extended chain； Green： Beta fold； Purple： Random curl；B：Tertiary structure of FtEIN3 protein

应用PlantCare网站对FtEIN3基因进行启动子区分析，发现FtEIN3基因启动子中存在大量TATA-box和CAAT-box核心启动子元件，除此之外，还包含一系列顺式作用元件，包括病原菌诱导响应元件W-box、低温响应元件LTR、MeJA反应响应元件CGTCA-motif 和TGACG-motif、厌氧诱导响应元件ARE等（表2）。这些顺式作用元件预示了FtEIN3基因可能会参与苦荞的各种调控途径，以及对生物与非生物的胁迫响应。

表2 FtEIN3基因启动子序列中的顺式作用元件

Table 2 Cis-acting elements in FtEIN3 gene promoter sequence

元件名称	序列	数目	功能
Cis-acting elements	Sequence	Number	Function
TATA-box	TATA	3	TATA框，转录起始必须元件
	TACAAAA	1
	ATTATA	1
	TATAA	1
CAAT-box	CAAT	17	CAAT框，转录增强元件
	CCAAT	2
	CAAAT	5
W-box	TTGACC	1	病原菌诱导响应元件
LTR	CCGAAA	2	低温响应元件
CGTCA-motif	CGTCA	1	MeJA反应响应元件
ARE	AAACCA	1	厌氧诱导响应元件
MYC	CATGTG	3	逆境胁迫响应元件
	CATTTG	2
	TCTCTTA	2
MYB	CAACCA	1	逆境胁迫响应元件
	CAACAG	1
GARE-motif	TCTGTTG	1	赤霉素反应响应元件
I-box	CGATAAGGCG	1	光照响应元件
TGACG-motif	THACG	1	MeJA反应响应元件

2.2 FtEIN3蛋白同源比对与进化树分析

通过NCBI在线网站将FtEIN3蛋白序列与不同物种进行比对，得到拟南芥（Arabidopsis thaliana）、日本晴水稻（Oryza sativa Japonica Group）、棉花（Gossypium hirsutum）、烟草（Nicotiana tabacum）、榴莲（Durio zibethinus）、番茄（Solanum lycopersicum）、玉米（Zea mays）、大麦（Hordeum vulgare）、小麦（Triticum aestivum）、木薯（Manihot esculenta）、茶树（Camellia sinensis）的蛋白序列。利用MEGA6.0软件构建系统进化树（图3），结果表明，苦荞FtEIN3与棉花GhEIN3、榴莲DzEIN3亲缘关系较近。

图3 FtEIN3及其同源蛋白的系统进化树

Fig.3 Phylogenetic tree of FtEIN3 and its homologous proteins

2.3 立枯丝核菌处理下苦荞中FtEIN3基因的表达

采用qRT-PCR的方法检测FtEIN3在立枯丝核菌侵染条件下的响应模式（图4）。结果表明，苦荞FtEIN3基因受立枯丝核菌胁迫而诱导表达。

图4 苦荞在立枯丝核菌侵染条件下FtEIN3的相对表达量

Fig.4 Relative expression of FtEIN3 in tartary buckwheat infected by Rhizoctonia solani

*表示在0.05水平上有显著性差异；**表示在0.01水平上有显著性差异；下同

* indicates significant difference at the 0.05 level； ** indicates significant difference at the 0.01 level； The same as below

FtEIN3基因在苦荞幼苗的根、茎、叶中均有不同的表达模式。立枯丝核菌菌液处理达到6 h时，FtEIN3基因在茎和叶中的表达量均高于根的表达量；而在24 h时，根的表达量达到最高。随着立枯丝核菌侵染时间的增长，FtEIN3基因在不同组织中的表达量也随之变化。在根中，0~6 h期间FtEIN3基因表达下调，在6~24 h期间表达上升后又在48 h时降低；在茎中，0~6 h期间FtEIN3基因表达量显著上升，而在6~48 h期间持续降低；在叶中，0~6 h FtEIN3基因表达量显著上升，6~48 h表达趋势基本不变。在立枯丝核菌侵染期间，根、茎、叶中的FtEIN3基因表达量均有不同的变化。由此可推测，在立枯丝核菌侵染苦荞幼苗时，苦荞FtEIN3基因受到胁迫而诱导表达。在一定时间内，FtEIN3 基因表达上调，随着立枯丝核菌侵入时间增长，苦荞幼苗体内可能发生了其他生理反应导致FtEIN3基因表达的下调，且植物不同组织对于立枯丝核菌的胁迫响应也不完全相同。

2.4 苦荞FtEIN3基因的亚细胞定位

多个亚细胞定位预测网站预测结果均表示FtEIN3基因可能定位在细胞核上。将构建好的亚细胞定位融合载体1302-FtEIN3细胞核标记载体p2300采用农杆菌介导法通过注射使其瞬时共转化到本氏烟草叶片背面，采用空载体1302作为对照组，用激光共聚焦显微镜观察。结果显示：对照组空载体1302荧光信号定位在细胞膜和细胞核上，试验组1302-FtEIN3荧光信号定位于细胞核上（图5）。由此表明，苦荞FtEIN3基因定位在细胞核上，与预测结果一致。

图5 苦荞FtEIN3基因的亚细胞定位

Fig.5 Subcellular localization of FtEIN3 in Tartary buckwheat

p2300：细胞核标记载体；1302：亚细胞定位空载体；1302- FtEIN3：含有目的基因的亚细胞定位融合载体

p2300：Nuclear maker vector；1302：Subcellular localization of empty vectors；1302- FtEIN3：Subcellular localization of fusion vectors containing target gene

2.5 FtEIN3基因的多样性分析

FtEIN3基因在苦荞麦7号染色体编码区存在5个SNP位点45303553、45303556、45303724、45303860、45303876，对其进行简单分析，结果详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230222002，附表1，5个位点的多样性表现为45303553（T/A）、45303556（A/G）、45303724（C/T）、45303860（A/G）、45303876（A/G），说明FtEIN3基因存在多样性。FtEIN3基因在108个苦荞品种中有5种单倍型：Hap1~Hap5，其中，Hap1包含的苦荞种质资源最多，为64个（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230222002，附表1）。图6所示，感病指数越高，说明该品种越易感病。Hap3感病指数最低，为优异单倍型，包含8份苦荞种质资源（JX252、JPN333、GZ414、SC213、GZ253、SX-342、sx137、HB58）。推测这8份苦荞种质资源可能具有更高的抗病性。

图6 苦荞FtEIN3基因不同单倍型分析

Fig.6 Different haploid analysis of FtEIN3 in tartary buckwheat

Hap1~Hap5：分别表示5种不同的单倍型；不同小写字母表示差异显著性（P<0.05）

Hap-Hap5：Respectively represent 5 different haplotypes；Different lowercase letters indicate significant difference （P<0.05）

2.6 异源转化拟南芥验证基因FtEIN3的功能

2.6.1 FtEIN3转基因拟南芥植株的获得及鉴定

图7A所示，FtEIN3转基因拟南芥的条带单一且与1307-FtEIN3重组质粒大小一致。提取野生型拟南芥与FtEIN3转基因拟南芥的RNA，反转录成cDNA后进行qRT-PCR，结果表明（图7B），FtEIN3在3个转基因拟南芥株系中确实超表达，有显著差异。综上，成功获得FtEIN3转基因拟南芥植株，可获取纯合后代，单株收取以进行后续试验。

图7 FtEIN3转基因拟南芥阳性株系的鉴定（A）和表达分析（B）

Fig.7 Identification of positive lines（A） and expression analysis（B） in FtEIN3 overexpression（OE） Arabidopsis Thaliana lines

Maker：DL2000 maker；WT：野生型拟南芥；OE1~OE3：转基因拟南芥阳性株系；下同

Maker：DL2000 maker；WT：Wild type Arabidopsis thaliana；OE1-OE3：Overexpression Arabidopsis thaliana positive lines； The same as below

2.6.2 FtEIN3转基因拟南芥的抗病性鉴定

2.6.2.1　转基因拟南芥离体叶片侵染试验　将野生型拟南芥与FtEIN3转基因拟南芥正常培育3周，分别取大小相近的叶片作为两组。试验组用于立枯丝核菌离体侵染，对照组不做处理。如图8所示，24 h后，对照组的转基因株系与野生型拟南芥没有任何差别；试验组野生型拟南芥离体叶片上病斑面积明显大于另外3个转基因株系。因此，在立枯丝核菌侵染条件下，FtEIN3转基因拟南芥株系的离体叶片对于立枯病的抗病性明显高于野生型拟南芥。

图8 FtEIN3转基因拟南芥的抗病性表型验证

Fig.8 Phenotypic validation of disease resistance in FtEIN3 transgenic Arabidopsis thaliana

2.6.2.2 DAB染色试验

选取野生型拟南芥和FtEIN3转基因拟南芥的离体叶片，一组进行立枯丝核菌侵染处理，一组不做处理。28 ℃培养箱处理24 h后，用DAB染色液对离体叶片染色20 min，再用叶绿体脱色液脱色3次以上至叶片无色。如图9所示，试验组被立枯丝核菌侵染的叶片均有明显病斑，呈棕褐色，对照组则无明显差别，且FtEIN3转基因拟南芥株系离体叶片上的病斑面积明显小于野生型拟南芥，说明在立枯丝核菌侵染24 h之内，FtEIN3转基因拟南芥离体叶片的抗病性显著强于野生型。

图9 FtEIN3转基因拟南芥的抗病性DAB染色验证

Fig.9 DAB staining verification of disease resistance in FtEIN3 transgenic Arabidopsis thaliana

2.6.3 立枯丝核菌侵染FtEIN3转基因拟南芥的表达模式

如图10所示，野生型拟南芥和OE3随着立枯丝核菌侵染时间的增加，FtEIN3基因相对表达量也逐渐升高。在24 h时，OE3中相对表达量达到野生型拟南芥的3.5倍，48 h达到野生型拟南芥的3.2倍。综上，在立枯丝核菌侵染拟南芥时，相对于野生型拟南芥，转基因拟南芥OE3株系中的FtEIN3基因相对表达量显著提高。

图10 立枯丝核菌侵染WT和OE3时FtEIN3的相对表达量

Fig.10 Relative expression of FtEIN3 in WT and OE3 infected by Rhizoctonia solani

2.6.4 FtEIN3转基因拟南芥抗病性相关生理生化指标分析

如图11所示，SOD活性检测结果说明，与未接种处理组相比，野生型拟南芥被立枯丝核菌侵染24 h时，SOD活性上升了2.87 U/g；3个FtEIN3转基因拟南芥株系中，在侵染24 h后，OE1、OE2、OE3的SOD活性分别上升了19.01 U/g、17.38 U/g、19.87 U/g，约为野生型增长量的6~7倍。

图11 FtEIN3转基因拟南芥抗病性相关生理生化指标分析

Fig.11 Analysis of physiological and biochemical indexes related to disease resistance of FtEIN3 transgenic Arabidopsis Thaliana

WT-RS：被立枯丝核菌侵染24 h的野生型拟南芥； OE1~OE3-RS：被立枯丝核菌侵染24 h的转基因拟南芥株系

WT-RS：Wild type Arabidopsis thaliana infected with Rhizoctonia solani for 24 h；OE1-OE3-RS：Overexpression Arabidopsis thaliana lines infected with Rhizoctonia solani for 24 h

POD活性检测结果表明，野生型拟南芥和FtEIN3转基因拟南芥被立枯丝核菌侵染24h后，POD活性均有显著上升。与未接种处理组相比，野生型拟南芥、OE1、OE2、OE3的POD活性分别上升了212.33 U/g、294.00 U/g、179.67 U/g、490.00 U/g，其中FtEIN3转基因拟南芥株系OE3的上升幅度约为野生型的2倍。

MDA活性检测结果表明，与未接种处理组相比，立枯丝核菌侵染野生型拟南芥24 h，MDA活性上升了4.39 nmol/g；而FtEIN3转基因拟南芥株系OE1、OE2、OE3在被侵染后， MDA活性分别上升了2.60 nmol/g、2.42 nmol/g、1.43 nmol/g，约为野生型的0.5倍。

在受到立枯丝核菌侵染时，FtEIN3转基因拟南芥的SOD和POD活性相较于野生型拟南芥上升幅度更大，表明FtEIN3转基因拟南芥可能通过SOD和POD调控活性氧（ROS，reactive oxygen species）发挥功能。MDA活性的上升体现了细胞膜的损伤程度，立枯丝核菌侵染拟南芥时，野生型拟南芥体内的MDA活性更高，表明野生型拟南芥细胞膜损伤程度更高，FtEIN3转基因拟南芥则与之相反，说明FtEIN3转基因拟南芥相较于野生型拟南芥细胞膜损伤更轻。

3 讨论

立枯丝核菌是广泛存在于世界各地的植物土传病原真菌，能够感染多种作物，引起种子腐烂、幼苗萎蔫、根腐病等，严重危害植物的生长进而影响产量和质量^［

16-17］。转录因子在作物抵御生物胁迫时发挥着重要作用，促进植物抗逆能力^{［参考文献 18-19}18-19］。本研究从苦荞中克隆得到一个转录因子FtEIN3，氨基酸序列比对发现FtEIN3与棉花GhEIN3、榴莲DzEIN3亲缘关系较近，棉花GhEIN3基因具有一定的耐盐性^{［参考文献 20

百度学术}20］，且在棉花抗枯萎病的过程中起积极作用^{［参考文献 21

百度学术}21］。因此推测FtEIN3基因可能参与植物的抗逆/病反应。

宁小萌等^［

22］对白桦Trihelix家族进行表达模式分析，发现8个家族成员基因在根、茎、叶中均有不同程度的表达，且在立枯丝核菌感染白桦幼苗根部24 h时3个基因（BpTrihelix3、BpTrihelix4和BpTrihelix7）相对表达量显著上调。FtEIN3在苦荞根、茎、叶中立枯丝核菌侵染的各个时间点也均有表达，且在立枯丝核菌侵染6 h时苦荞麦茎与叶中诱导程度最高，24 h时苦荞麦根中的基因表达量达到最高。FtEIN3转基因拟南芥中，FtEIN3基因相对表达量随着立枯丝核菌侵染时间的增加而升高。因此推测FtEIN3基因受立枯丝核菌的诱导，且基因的表达与立枯丝核菌的侵染时间密切相关，从而调节植物自身抗病性。PR1基因被广泛认为是防卫基因，大蒜体内的AsPR1基因表达量明显增加，是因为植物本身形成了一定的防御机制^{［参考文献 23

百度学术}23］，因此，推测在立枯丝核菌侵染苦荞时，苦荞自身也形成了防御机制，导致FtEIN3基因表达量增加，从而提高苦荞的抗病性。转基因拟南芥中的抗病表型和DAB染色结果也证实了这一点。

生物多样性和单倍型分析对于优异单倍型的发掘和基因功能的研究有着重大意义^［

24］。杨辉等^{［参考文献 25

百度学术}25］利用51份不同类型水稻种质资源对SKC1基因编码区进行测序分析，共得到9种不同的单倍型，且Hap2是粳稻中的一个稀有耐盐单倍型。Liu等^{［参考文献 26

百度学术}26］利用单倍型分析鉴定出与高蔗糖合成效率潜在相关的甘蔗单倍型。Huang等^{［参考文献 27

百度学术}27］对抗病基因的研究鉴定出一种新型Pm21单倍型，可以限制病菌菌丝的生长，为小麦育种提供了新的基因资源。本研究中，对108份苦荞种质资源进行单倍型分析，检测到了5种不同的单倍型，其中Hap3为优异单倍型，可能具有更高的抗立枯病能力，为今后研究苦荞对于立枯病或其他病害的抗性提供了新的遗传资源参考价值。

进一步研究了拟南芥中FtEIN3基因的生理生化性质，在不同处理下，对野生型拟南芥和FtEIN3转基因拟南芥株系OE1、OE2、OE3中的POD、SOD和MDA活性进行了测定，试验结果显示，相较于野生型拟南芥， OE1、OE2、OE3中在立枯丝核菌侵染后的SOD活性显著增加；OE3中的POD活性上升幅度也比野生型拟南芥中大。POD和SOD均可以降低自由基对细胞膜的损伤^［

28］。李易初等^{［参考文献 29

百度学术}29］发现大豆菌核病菌致病力的强弱与POD和SOD活性相关。因此，POD和SOD活性可能与立枯丝核菌致病性相关。MDA是衡量氧化胁迫程度的常用指标之一，能反映植物膜脂过氧化的程度^{［参考文献 30

百度学术}30］。通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性^{［参考文献 31

百度学术}31］。在病菌侵染后，野生型拟南芥中MDA活性相较于OE1、OE2、OE3升高更加显著，因此野生型拟南芥受立枯病侵染更高。综上，FtEIN3转基因拟南芥在受立枯丝核菌侵染后，其体内POD和SOD活性增加，MDA活性减弱，从而提高植物的抗病性。

4 结论

从苦荞中克隆得到FtEIN3基因，FtEIN3基因受立枯丝核菌诱导表达，立枯丝核菌侵染24 h 时，FtEIN3基因在苦荞根、茎、叶中表达量均有显著变化，且在根中的表达量最高。FtEIN3基因定位在细胞核。通过对108份苦荞种质资源EIN3编码区进行分析，发现有5种不同的单倍型，其中Hap3为优异单倍型，包含的苦荞种质资源可能具有更高的抗病性。转基因拟南芥离体叶片侵染试验和DAB染色试验结果说明FtEIN3基因具有一定的抗病性。在立枯丝核菌侵染条件下，FtEIN3转基因拟南芥体内的POD和SOD活性较野生型拟南芥显著提高，MDA活性则显著减少，说明其抗病能力显著高于野生型拟南芥。

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