摘要
虾脊兰属（Calanthe R. Br.）植物物种多样性丰富，但在全球变暖的环境影响下，极端高温天气频繁出现，加剧了非生物胁迫对该属物种生存和繁殖的危害。本研究以兰科（Orchidaceae Juss.）6种虾脊兰属植物作为研究对象，通过高温半致死生理实验初步确定不同虾脊兰属植物的耐热性，并挑选耐热型银带虾脊兰（Calanthe argenteostriata C. Z. Tang & S. J. Cheng）和热敏感型三棱虾脊兰（C.tricarinata Lindl.）进行转录组测序，以筛选热胁迫相关基因，并分析其表达差异及功能。同时利用实时荧光定量PCR技术检测其基因在不同温度下的表达模式，分析相关基因与耐热性的关系。结果表明：（1）6种虾脊兰属植物的耐热性由弱至强排序：三棱虾脊兰<钩距虾脊兰<三褶虾脊兰<西南虾脊兰<中华虾脊兰<银带虾脊兰。（2）在耐热型银带虾脊兰和热敏感型三棱虾脊兰中鉴定到响应热胁迫的基因家族包括HSP、HSF、LEA、XTH、TIL。（3）三棱虾脊兰耐热相关基因表达的上限温度为30 ℃，超过该温度则对三棱虾脊兰造成伤害；银带虾脊兰9个耐热相关的差异基因在40 ℃下依然保持较高的表达量，可能因此获得了对高温胁迫较高的耐受性。本研究从分子水平上探究虾脊兰属植物对高温的响应，为筛选耐热性关键基因及培育耐热性较强的园林植物提供重要的线索，对现代园林育种具有重要的指导意义和应用价值。
热胁迫（HS，heat stress）以不同方式影响细胞内的蛋白质、细胞膜和骨架结构的稳定性等，从而对生物体造成伤害，极端高温的胁迫可以在几分钟之内导致细胞损坏或死
植物虽不能通过移动避开高温，但可通过各种热响应基因的表达以减少变构蛋白质带来的危害，以维持自身正常的生理活动和新陈代谢反应。目前有大量基因被证明受逆境诱导，如胚胎发育后期丰富蛋白（LEA，late embryogenesis abundant）、热激蛋白（HSP，heat stress protein）、木葡聚糖内转葡糖基酶/水解酶（XTH，xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase）、温度诱导载脂蛋白（TIL，temperature induced lipocalins）等，当耐热型和热敏感型植物受到胁迫时，这些基因呈现出差异表
虾脊兰属植物属于热带起源，后因全球气候变冷逐渐向低海拔区域扩
本研究以6种虾脊兰属植物钩距虾脊兰（Calanthe graciliflora Hayata）、三棱虾脊兰（C. tricarinata Lindl.）、西南虾脊兰（C. herbacea Lindl.）、三褶虾脊兰、中华虾脊兰（C. sinica Z. H. Tsi）和银带虾脊兰（C. argenteostriata C. Z. Tang & S. J. Cheng）为研究对象，均为人工繁育苗，种源的原生分布地带分别为福建省福州市晋安区寿山乡（海拔295 m）、陕西汉中（海拔1800 m）、云南景东（海拔11159 m）、云南芒市（海拔2377 m）、云南文山（海拔1278 m）和福建省福州市晋安区（海拔560 m）。
于2020年10月在福建农林大学兰科植物保护与利用国家林业和草原局重点实验室进行取样。选取生长情况基本一致、健康且无病虫害的植株，每种各取3株用于试验。具体步骤：取植株第二叶片，剪去主脉，以0.5 cm × 0.5 cm大小均匀剪取叶片，准确称量0.2 g，放入含20 mL去离子水的离心管中浸泡20 min。将离心管置于水浴锅加热，加热温度分别设定为35 ℃、40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃、65 ℃、70 ℃，各水浴20 min。取出置于25 ℃室温下自然冷却，测其电导率（Ct）。再将所有离心管置于100 ℃高温下煮沸15 min，测其电导率（Cm）。以室温下叶片的电导率（CCK）作为对照。每个温度处理重复3次。细胞伤害率=（Ct-CCK）/（Cm-CCK）］×100
利用Logistic回归方程y=k/（1+a
耐热型银带虾脊兰和热敏感型三棱虾脊兰的染色体倍性均为二倍体。将耐热型银带虾脊兰和热敏感型三棱虾脊兰置于温度为25 ℃/20 ℃、光周期为12 h光照/12 h黑暗的光照培养箱中同步培养7 d，每个物种取3个生物学重复作为对照组（未热激）。在高温试验组中，为方便高温处理后快速取样，先用超纯水将全株冲洗3遍，清除病叶，再放入37 ℃下热激2 h，每个物种取3个生物学重复作为高温试验组。分别剪取对照组和高温试验组的叶片组织，迅速放入液氮中冷冻，并置于-80 ℃超低温冰箱内保存，用于提取RNA，后在Illumina测序平台进行转录组测序，3个生物学重复中，取重复性较高的2个进行下一步试验。银带虾脊兰对照组品种为CARG25、高温组品种为CARG37，来自福建省福州市晋安区；三棱虾脊兰对照组品种为CTRI25、高温组品种为CTRI37，来自陕西汉中。
转录组测序文库构建与测序：该部分工作均由深圳华大基因股份有限公司完成。试验步骤如下：
（1）用带有Oligo（dT）的磁珠对银带虾脊兰和三棱虾脊兰的mRNA进行富集，用DNA探针杂交rRNA，RNaseH选择性消化DNA/RNA杂交链，再用DNaseI消化掉DNA探针，纯化后即得到所需RNA。之后加入buffer将mRNA打断，获得若干mRNA短片段。
（2）以得到的短片段为模板，加入六碱基随机引物（random hexamers）进行反转录，再合成第一条cDNA链。加入缓冲液、dNTPs和DNA聚合酶I合成第二条cDNA链，获得双链cDNA。
（3）使用AMPure XP beads纯化双链cDNA后进行末端修复，加poly（A）并连接测序接头，用AMPure XP beads选择片段大小，最后进行PCR扩增。
（4）建好的cDNA文库用Agilent 2100对文库插入的片段进行质检，基于Sequencing By Synthesis技术使用Illumina HiSeqTM2000进行cDNA文库测序。
组装和分析：在正式分析之前，去除包含接头的Reads（接头污染），去除未知碱基N含量大于5%的Reads和低质量Reads（质量值低于15的碱基占该Reads总碱基数的比例大于20%的Reads为低质量的Reads），获得高质量片段（Clean reads），使用Trinity对Clean reads（去除PCR重复以提高组装效率）进行de novo组装，然后使用Tgicl将组装的转录本进行聚类去冗余，得到单基因（Unigene）。获得不含未知碱基的长片段，作为组装得到的Unigene，去除冗余Unigene，进行拼接，进一步得到三棱虾脊兰和银带虾脊兰的All-Unigene。
利用Blastn将三棱虾脊兰和银带虾脊兰的Unigene序列在公共数据库进行相似度比较搜索比对。样本分别在非冗余蛋白数据库（NR，non-redundant protein sequence database）、去冗余的蛋白序列数据库（Swiss-Prot，swiss-prot protein sequence database）、基因功能分类数据库（GO，gene ontology）、真核生物蛋白相邻类的聚簇数据库（KOG，clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes）、基因功能和代谢途径数据库（KEGG，kyoto encyclopedia of genes and genomes）和Pfam数据库（Protein family）中进行功能注释，获得Unigene的功能注释信息。
为了评估三棱虾脊兰和银带虾脊兰高温处理前后的每个Unigene的表达水平，采用FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript per Million fragments mapped）方法对Unigene表达进行归一化，消除不同Unigene长度与测序量差异对计算表达量的影响，从而准确地反映基因表达水平。计算得到的基因表达量可直接用于比较不同样品间的基因表达差异，后续就可以通过基因注释的结果来分析这些差异表达基因的表达模式聚类。3个生物学重复中，取重复性较高的重复组，使用TBTOOL软件绘制基因表达量聚类热
如
图1 6种虾脊兰属植物的细胞伤害率与处理温度间的关系
Fig. 1 Relationships between cell injured rates and treatment temperatures in six species of Calanthe
半致死温度排序 The ranking of LT 50 | 物种 Species | 拟合方程 Logistic regression equation | 拟合优度 | 半致死温度（℃） LT50 |
|---|---|---|---|---|
| 6 | 三棱虾脊兰 | 1 / （1 + 141000.3696565343 × 0.7980207651328805） | 0.966 | 52.55 |
| 5 | 钩距虾脊兰 | 1 / （1 + 43405204.75575818 × 0.7187973424541392） | 0.975 | 53.26 |
| 4 | 三褶虾脊兰 | 1 / （1 + 62446.29407705086 × 0.8159509727357598） | 0.966 | 54.29 |
| 3 | 西南虾脊兰 | 1 / （1 + 1265806.297312976 × 0.7739439690629499） | 0.978 | 54.83 |
| 2 | 中华虾脊兰 | 1 / （1 + 5783869.219598142 × 0.7539797508609049） | 0.967 | 55.14 |
| 1 | 银带虾脊兰 | 1 / （1 + 552163.749038476 × 0.7882123099069534） | 0.969 | 55.56 |
由
样品编号 Samples ID | 过滤后序列 Clean reads | 总数量 （bp） Total number | 总长度 （bp） Total length | 平均长度 （bp） Mean length | N50 |
|---|---|---|---|---|---|
| CARG25-01 |
6.41×1 | 38，941 | 38，952，215 | 1，000 | 1，546 |
| CARG25-02 |
6.41×1 | 37，885 | 38，802，465 | 1，024 | 1，570 |
| CARG25-03 |
6.39×1 | 39，435 | 40，083，628 | 1，016 | 1，574 |
| CARG37-01 |
6.39×1 | 34，925 | 33，151，051 | 949 | 1，440 |
| CARG37-02 |
6.39×1 | 35，847 | 35，123，325 | 979 | 1，498 |
| CARG37-03 |
6.41×1 | 34，783 | 34，687，345 | 997 | 1，522 |
| 单基因总数All-Unigene | / | 63，736 | 71，658，251 | 1，124 | 1，753 |
| CTRI25-01 |
6.40×1 | 37，409 | 37，361，153 | 998 | 1，548 |
| CTRI25-02 |
6.38×1 | 41，482 | 35，790，967 | 862 | 1，328 |
| CTRI25-03 |
6.40×1 | 36，604 | 37，312，025 | 1，019 | 1，561 |
| CTRI37-01 |
6.35×1 | 35，977 | 36，396，237 | 1，011 | 1，538 |
| CTRI37-02 |
6.40×1 | 35，650 | 36，646，585 | 1，027 | 1，570 |
| CTRI37-03 |
6.39×1 | 33，872 | 33，109，270 | 977 | 1，456 |
| 单基因总数All-Unigene | / | 76，176 | 77，818，498 | 1，021 | 1，637 |
样品编号命名规则：物种拉丁名首字母简称+处理温度+生物学重复编号
The sample number consists of Latin initials of species， processing temperature， and biological repeat number
将银带虾脊兰测序得到的单基因（Unigene）比对到GO数据库中（
图2 银带虾脊兰GO注释结果分类
Fig. 2 The category result of GO annotation of C. argenteostriata
将三棱虾脊兰测序得到的Unigene比对到GO数据库中（
图3 三棱虾脊兰GO注释结果分类
Fig. 3 The category result of GO annotation of C. tricarinata
在KEGG数据库中，银带虾脊兰的19，135个Unigene和三棱虾脊兰的40，807个Unigene分别被注释到135个通路中，富集最多的前5条通路分别为RNA转运（RNA transport）、核糖体（Ribosome）、内质网中蛋白加工（Protein processing in endoplasmic reticulum）、剪接体（Spliceosome）、植物-病原体互作（Plant-pathogen interaction）途径（
通路编号 Pathway ID | 通路名称 Pathway name | 银带虾脊兰中数目 Count in C. argenteostriata | 三棱虾脊兰中数目 Count in C. tricarinata |
|---|---|---|---|
| ko03013 | RNA转运 | 1，534 | 1，593 |
| ko03010 | 核糖体 | 1，135 | 1，562 |
| ko04141 | 内质网中蛋白加工 | 1，125 | 1，434 |
| ko03040 | 剪接体 | 1，098 | 1，392 |
| ko04626 | 植物-病原体互作 | 1，066 | 1，137 |
热激转录因子（HSF，heat stress factor）、脱水应答元件结合蛋白（DREB，dehydration-responsive element-binding protein）是近年来研究较多的与植物高温胁迫抗性相关的转录因子，同时也有一些较大的转录因子家族（WRKY、MYB、NAC等）参与热激响
将这5种转录因子的差异基因进行蛋白网络互作分析（图5），它们参与调控银带虾脊兰应答热胁迫的互作网络比三棱虾脊兰复杂。银带虾脊兰HSF（Unigene9645_All，命名为CARGHSF-1）与其他4种转录因子都存在网络互作调控，三棱虾脊兰HSF（CL8463.Contig8_All，命名为CTRIHSF-1）仅与AP2-EREBP存在网络调控关系。
当银带虾脊兰和三棱虾脊兰受到高温胁迫时，差异基因的KEGG富集结果一致显示出，内质网中蛋白加工的通路影响较大，且鉴定到物种中大量热激蛋白的差异基因富集于该通路中。如
图6 内质网通路中HSP基因家族响应热胁迫的表达量聚类热图
Fig. 6 The clustering heat map of the expression of HSP gene family in the endoplasmic pathway in response to heat stress
CK 1/2为对照组1/2，HT 1/2为高温组1/2。基因名称命名规则：物种拉丁名首字母+基因家族名称+基因排列序号；下同
CK 1/2 indicates control group 1/2， and HT 1/2 indicates high-temperature group 1/2. Gene name consists of Latin initials of species， gene family name， and gene sequence number； the same as below
银带虾脊兰共鉴定125个差异热激蛋白基因，包括37个HSP90、40个HSP70、21个HSP40和27个HSP20。受热胁迫后HSP90和HSP20全部上调，其中HSP90上调表达明显的数量较少，25个HSP20的差异倍数在5倍以上，1个在5倍以下，上调表达极为明显。36个HSP70上调差异基因，差异倍数5倍以上有18个，4个下调差异基因。8个HSP40差异基因表现为下调，上调差异基因13个，差异倍数5倍以上8个。
三棱虾脊兰共鉴定43个差异热激蛋白基因，包括12个HSP90、10个HSP70、3个HSP40和18个HSP20（
本研究在拟南芥数据库中搜索53个与耐热相关的基因，最终鉴定到XTH、TIL、LEA基因家族与2种虾脊兰属植物的高温响应相关。如
图7 LEA、XTH和TIL基因家族响应热胁迫的表达量聚类热图
Fig. 7 Clustering heat map of the expression of LEA， XTH and TIL gene family in response to heat stress
为探究在不同温度条件下的基因表达量变化，在鉴定的5个基因家族（HSF、HSP、LEA、XTH和TIL）中选取显著差异表达的基因用于实时荧光定量PCR实验，发现在2种虾脊兰中HSP的表达模式不同。银带虾脊兰中表达模式较复杂（
图8 HSP和HSF基因家族在不同温度下的表达量
Fig. 8 Expression level of HSP and HSF gene family at different temperatures
小写字母表示P<0.01，表达量达到极显著差异；大写字母表示P<0.05，表达量达到显著差异，下同
Lowercase letter indicated P<0.01， and the expression level showed a highly significant difference；Uppercase letter indicated P<0.05， and the expression level showed a significant difference， the same as below
在40℃高温处理时，LEA基因在2种虾脊兰中的表达量都达到显著或极显著水平，但在应对高温时其在2种虾脊兰中的表达模式不同（图9）。银带虾脊兰中CARGLEA-4基因呈先下降后增长的趋势；三棱虾脊兰内的表达量具有一定的维持性，呈间断性增高。如图10所示，XTH和TIL表达模式与
植物细胞膜对维持细胞正常代谢发挥着重要的作用，当超过临界温度时，细胞膜的蛋白结构被破坏，透性增加使得细胞内电解质泄露，导致电导率上
电导率法测定方法简便易行，可作为植物抗热性数量指标，是公认的耐热性鉴定方法。通过电导率法结合Logistic方程求得植物半致死温度，已经广泛得到应用，如杜鹃（Rhododendron spp.
植物的耐热性受多种因素的影响，其耐热生理过程错综复杂。本研究测定了6种虾脊兰属植物叶片的电导率，所得到的LT50只是比较耐热性的依据之一。若要更加精确地判断虾脊兰属植物的耐热性，还需结合抗热性相关的生理、生化指标，如叶绿素（Chl，chlorophyll）总量、丙二醛（MDA，malondialdehyde）含量、脯氨酸（Pro，proline）含量，特别是超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）、过氧化物酶（POD，peroxidase）及过氧化氢酶（CAT，catalase）活性等来综合评
本研究通过转录组测序分析2种不同温度适应型的虾脊兰属植物对高温胁迫的响应机制差异。GO富集分析可以更加有效地对差异表达基因进行生物学功能鉴定和识别，银带虾脊兰和三棱虾脊兰GO分类到3大类、39小类，且富集较多的功能分类均为细胞解剖实体（Cellular anatomical entity）、结合绑定（Binding）和催化活性（Catalytic activity）。这些研究结果与非洲菊（Gerbera jamesonii Bolus）和辣椒（Capsicum annum L.）的热胁迫响应相似，参与到结合绑定和催化活性功能相关的基因占主要地
KEGG通路富集分析有助于进一步了解基因的生物学功能。当细胞受到环境胁迫刺激时，内质网基质中错误折叠的蛋白质的积累会引起内质网应激，并激活称为“内质网应激反应”（ER stress response）的信号通路，从而启动BiP等基因的表达，促进蛋白折
转录组分析显示，HSP在虾脊兰属植物中都被高温诱导，主要被富集到内质网中的蛋白加工通路中，且该通路差异倍数较大的基因主要是HSP20。结合前人研究，小
HSP60表达量在2种虾脊兰中也呈现差异：在银带虾脊兰中随着温度上升呈上调趋势，而在三棱虾脊兰中则模式相反。茄子的耐热性品系中HSP60表达量高于热敏感品
综上所述，在高温胁迫中，HSP基因家族是虾脊兰属植物抵抗热胁迫的主要功能基因之一。银带虾脊兰分布区域的海拔高度比三棱虾脊兰更低，可能是因为大量的HSP同源基因相互协同作用为前者适应环境提供了更多的选择。
热激转录因子（HSF，heat stress factor）是植物受到环境胁迫后激活细胞内信号转导通路中的重要成员，可启动及调节HSP基因的表达，对增强植物的抗逆性具有重要作
大量研究证明LEA蛋白的表达能够增强植物对高温、低温和干旱的耐受性。当植物处于高盐或干旱等挑战性环境中，细胞内电解质外漏，细胞内浓度迅速升高，对细胞造成不可逆转的损
XTH广泛存在于植物体的各种组织和细胞中，参与细胞壁的合成、降解与重构过程，与细胞生长发育有关。近年来研究发现其与氧化、干旱、低温和热激等环境胁迫的响应密切相
在高温胁迫下，细胞膜脂发生过氧化作用，植物积累了高浓度的过氧化氢和活性氧，导致氧化应激反应。近年来研究发现植物温度诱导型脂钙素对不同非生物胁迫的响应具有重要作用，参与了各种压力因素和信号转导途
（1）6种虾脊兰属植物的耐热性由弱至强排序：三棱虾脊兰<钩距虾脊兰<三褶虾脊兰<西南虾脊兰<中华虾脊兰<银带虾脊兰。
（2）在耐热型银带虾脊兰和热敏感型三棱虾脊兰中鉴定到响应热胁迫的基因家族包括HSP、HSF、LEA、XTH、TIL；HSP和HSF表达量的高低与物种的耐热性呈正相关；高温胁迫下，银带虾脊兰中TIL和XTH的表达量更高，表明其细胞壁的抵抗或修复水平高于三棱虾脊兰。
（3）三棱虾脊兰的耐热相关基因对温度的反应具有一定范围，超过30 ℃时则可能造成植物的热害。
本研究只是初步在转录组数据库中筛选出了9个关键候选基因（HSF、HSP20、HSP40、HSP60、HSP70、HSP90、LEA、XTH和TIL），若要深入验证这些基因具体的作用机制，还需通过转基因进一步验证，同时也可对不同温度下基因作用时间的变化进行更深层次的探究。
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