基于<bold>SSR</bold>标记初步定位小豆驯化相关性状<bold>QTL</bold>

贾龙; 罗高玲; 陈燕华; 王素华; 陈红霖; 刘长友; 杜吉到; 王丽侠; JIA Long; LUO Gaoling; CHEN Yanhua; WANG Suhua; CHEN Hongling; LIU Changyou; DU Jidao; WANG Lixia

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基于SSR标记初步定位小豆驯化相关性状QTL PDF

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贾龙 ^1,2
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刘长友 ⁴
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杜吉到 ¹
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王丽侠 ²
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1. 黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319； 2. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081； 3. 广西农业科学院水稻研究所，南宁 530007； 4. 河北省农林科学院粮油作物研究所，石家庄 050035

最近更新：2023-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230224005

摘要

炸荚和籽粒硬实性是野生小豆的主要特性，严重制约着野生小豆资源的利用，解析这些性状的遗传机理，对培育优良小豆新品种具有重要意义。本研究基于中红5号和野生小豆（Vigna angularis var. n ipponensis）杂交衍生的重组自交系，开展炸荚和籽粒硬实等驯化相关性状鉴定及SSR标记分析。表型分析显示荚皮卷曲数、炸荚率及籽粒硬实率均不符合典型正态分布。构建了包含111个SSR标记、11个连锁群的小豆遗传连锁图谱，总长3813.5 cM，标记间平均距离为34.35 cM。连锁分析共发掘到与2021年炸荚率和荚皮卷曲数相关QTL 19个，与2022年炸荚率及荚皮卷曲数相关QTL 13个，其中不同年份重复检测到的荚皮卷曲数相关QTL 2个，重复检测到的炸荚率相关QTL 3个。籽粒硬实相关QTL 4个，其中位于LG11的QTL分别与炸荚率及2022年荚皮卷曲数相关QTL重叠。本研究结果为进一步开展小豆驯化相关基因的精细定位及机理解析奠定了基础。

关键词

小豆; SSR标记; 遗传图谱; 驯化性状; QTL

小豆（Vigna angularis）属于豆科（Leguminosae）蝶形花亚科（Papilionaceae）菜豆族（Phaseoleae）豇豆属（Vigna），富含蛋白质、淀粉及功能因子等，是典型的医食两用作物，随着人们对健康饮食意识的提升，其需求量逐步增加。小豆还具有生育期较短、抗旱耐逆、根系能固氮等特性，在填荒救灾、种植业结构调整等方面也有重要作用。然而，炸荚及籽粒硬实严重影响小豆的高产稳产和加工品质。随着现代农业发展，机械化收获是小豆产业提质增效的必然趋势，这就要求品种具备较强的抗炸荚特性，以减少收获时的产量损失。此外，小豆籽粒硬实性比较突出，可高达30%，平均在8%左右，且随着储藏时间硬实率逐渐提高^［

1］。籽粒硬实不仅影响其种子发芽率，还显著降低其加工利用及日常食用品质。

豆类的炸荚与禾谷类的落粒功能相似，益于物种的野外自行繁衍。对作物生产来说，炸荚或落粒则严重影响其产量稳定性。截至目前，炸荚性的报道以大豆居多。大豆炸荚为遗传和环境共同调控的数量性状，即主效+微效多基因，其中抗炸荚为隐性^［

2］，且陆续发掘出大豆抗炸荚相关QTL^{［参考文献 3-4}3-4］。近期研究发现大豆与拟南芥中抗炸荚相关基因高度同源^{［参考文献 5

百度学术}5］，但炸荚效应不完全对等^{［参考文献 6

百度学术}6］。其他豆类炸荚研究相对滞后，其中豇豆炸荚性相关基因位于第7染色体^{［参考文献 7-8}7-8］，且可能与小豆炸荚基因属同一个位点^{［参考文献 9

百度学术}9］。而菜豆炸荚至少涉及两个基因，且与大豆炸荚相关基因不同源，说明不同豆种炸荚的遗传调控机制并非完全一致^{［参考文献 10

百度学术}10］。小豆炸荚及硬实率的基因发掘研究较少，仅Kaga等^{［参考文献 11

百度学术}11］依据荚皮卷曲数将小豆炸荚相关基因定位在第7连锁群，但无后续报道。

籽粒硬实有助于植物抵御野外各种不良气候条件，延缓种子劣变，是野生资源繁衍生息的典型属性，与种子休眠紧密相关。然而农业生产中，种子硬实严重影响播种质量，降低田间出苗率和整齐度。在豆类食品加工利用过程中，硬实不利于种子的研磨、烘焙、发酵等处理，降低产品质量。目前，有关种子硬实性研究也多集中在大豆。据报道，大豆籽粒硬实为多基因控制的复杂性状，受遗传和环境共同调控^［

12-13］，且野生大豆籽粒硬实由编码钙调跨膜蛋白与种皮钙含量有关基因发生点突变导致^{［参考文献 14

百度学术}14］。也有研究认为编码内切-1，4-ß-葡聚糖酶基因能导致种子硬实^{［参考文献 15

百度学术}15］。Humphry等^{［参考文献 16

百度学术}16］在绿豆中也检测到4个与硬实率相关的QTL。小豆遗传研究相对落后，先后有农艺性状如初花期^{［参考文献 17

百度学术}17］、籽粒大小^{［参考文献 18

百度学术}18］等相关基因定位的研究报道。

我国是小豆原产国，也是主要生产国，种质资源丰富^［

19-20］，尤其野生资源具有丰富的变异类型^{［参考文献 21

百度学术}21］，是小豆抗性育种的重要基因来源。通过现代分子学手段，利用表型性状鉴定和SSR分子标记解析种子硬实性状调控机理对有效利用野生资源种质在小豆品种改良具有重要指导意义。因此，本研究基于栽培小豆与野生小豆衍生的重组自交系，利用荚皮卷曲数及炸荚率代表炸荚特性，利用籽粒硬实率代表籽粒硬实特性，使用SSR标记分别对上述性状开展了初步定位研究，以期为相关基因的精细定位及基因克隆奠定基础。

1 材料与方法

1.1 群体构建

2016年用抗炸荚、籽粒硬实率低的栽培种中红5号与炸荚、籽粒硬实率高的野生小豆（Vigna angularis var. nipponensis）杂交，陆续在北京、三亚通过单粒传法进行繁殖，构建了包含308个家系的稳定遗传研究群体F₈，该群体的F₂世代曾用于籽粒大小的定位^［

18］。

1.2 材料种植

该RIL群体及双亲于2021年和2022年7月种植于广西农业科学院里建基地（108°27' E，23°17' N）。该基地土壤有机质含量为2%~3%，土层深厚，透水性好。种植方式为起垄播种，垄宽85 cm，行长1.5 m，双粒点播，每家系2行，出苗后间苗定苗，重复两次，均按当地大田模式管理。

1.3 炸荚及籽粒硬实率性状调查

1.3.1 炸荚性状采集

在2021年和2022年成熟期，分别收获双亲及RIL群体相同成熟度的豆荚。每个家系收3个单株，每个单株收10个豆荚，所有的豆荚收获后置于网袋中，自然干燥10 d。调查每个袋中完全炸开的豆荚数量和荚皮卷曲圈数，计算豆荚炸荚率（PS，ratio of pod shattering）及荚皮卷曲数（NPC，number of pod curling）。炸荚的数量占总豆荚数量的百分数为炸荚率。

1.3.2 硬实种子的表型分析

随机从双亲及2022年收获的RIL群体各家系中选取30粒表面光滑饱满无病斑种子，置于5 cm培养皿中并加入5 mL 蒸馏水，3次重复，室温下浸泡处理108 h，每12 h统计硬实种子数（经过浸泡，种子体积无变化或种皮无皱缩，即视为硬实种子），计算硬实率（HSN，ratio of hard seededness），即硬实种子数与占全部种子数的百分数。

1.4 DNA提取与SSR分析

取双亲及RIL群体各家系幼嫩无病虫害的叶片，用改良CTAB法提取基因组DNA^［

22］。分光光度计检测 DNA 的纯度和浓度后，将全部DNA浓度均调至50 ng/µL，保存于-20℃冰箱备用。选用公开发表及自主开发的552对SSR引物 ^{［参考文献 11

百度学术}11，23］，由北京赛百盛基因技术有限公司合成。PCR扩增体系共10 µL，包含模板DNA（50 ng/L）1 µL、上下游引物（10 μmol/L）各0.5 µL、2×Taq Mix 5 µL、ddH₂O 3 µL。PCR反应程序为 95℃预变性5 min；95℃变性30 s，55 ℃复性30 s，72 ℃延伸30 s，35个循环；72 ℃继续延伸5 min；最后12℃降温保存10 min。PCR产物用6%的聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，银染法显色^{［参考文献 24

百度学术}24］。

1.5 图谱构建及QTL分析

用IciMapping4.2软件的MAP功能^［

25］，母本基因型用0，父本基因型用2，缺失用-1表示。选择RIL分析模型，利用Threshold Value标记构建遗传图谱（LOD设为3.0），并采用完备区间作图法对炸荚和籽粒硬实进行作图，步长为 0.1 cM，PIN为 0.001，LOD 阈值为3.0，并计算出每个QTL的表型贡献率，采用“Q+性状名称缩写+年份缩写+序号”对QTL进行命名。

2 结果与分析

2.1 小豆炸荚及种子硬实性状表型数据分析

结果表明，RIL群体各家系炸荚率和荚皮卷曲数变异较丰富（表1）。其中 2021年和2022年炸荚率变异范围均为0~100%，变异系数为92.28%~127.91%，荚皮卷曲数变异范围均为0~4.75，变异系数为105.34%~109.97%。其中，2021年平均炸荚率（41.13%）高于2022年（29.88%），平均荚皮卷曲数（1.40）略大于2022年（1.17）。不同年份RIL群体各家系炸荚率及荚皮卷曲数的分布均不符合正态分布，但数据具有连续性，可用于QTL定位研究（图1，图2）。

表1 RIL群体荚皮卷曲数及炸荚率表型分析

Table 1 The statistics of number of pod curling and shattering within RIL population of adzuki bean

年份 Year	性状 Traits	平均值 Mean	最大值 Max.	标准差 SD	峰度 Kurtosis	偏度 Skewness	变异系数（%） CV
2021	荚皮卷曲数	1.40	4.75	1.48	-1.38	0.40	105.34
2021	炸荚率（%）	41.13	100	37.95	-1.5	0.21	92.28
2022	荚皮卷曲数	1.17	4.75	1.28	-1.11	0.53	109.97
2022	炸荚率（%）	29.88	100	38.22	-0.7	0.92	127.91

图 1 小豆RIL群体荚皮卷曲数分布直方图

Fig. 1 Distribution of number of pod curling within RIL population of adzuki bean

图2 小豆RIL群体炸荚率分布

Fig. 2 Distribution of ratio of pod shattering within RIL population of adzuki bean

浸种12 h时，中红5号种子硬实率为0；野生小豆硬实率在12 h仅有少数完全吸涨种子，硬实率为86.67%，在24~108 h，硬实率基本保持不变（图3）。RIL群体各家系硬实率平均值随着时间逐渐降低，浸泡12~24 h时，种子硬实率平均值变化最快，24~60 h，籽粒硬实率平均值变化减缓，60 h之后籽粒硬实率平均值变化趋近0。因此，确定60 h为鉴定RIL群体籽粒硬实率的时间，并将该数据用于后续籽粒硬实率的QTL定位。分析发现， RIL群体各家系在60 h的硬实率为连续分布（图4），是典型的数量性状，可用于QTL定位研究。

图3 不同浸泡时间中红5号和野生小豆籽粒硬实率的变化

Fig. 3 The changes of hard seededness percentage for Zhonghong 5 and wild adzuki bean in different soaking time

图4 小豆RIL 群体各家系的硬实率分布图

Fig.4 The distribution of ratio of hard seededness of lines from RIL population of adzuki bean

2.2 遗传图谱构建

从552对SSR引物中共筛选出亲本间多态性引物112个（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230224005，附表1），多态率为20.1%。连锁分析共将其中111个SSR标记定位到11条小豆连锁群（LG，linkage group），全长3813.5 cM，不同连锁群长度为126.3~629.0 cM，平均346.7 cM；每条连锁群标记数为4~16个，平均间距34.35 cM（表2，图5）。

表2 小豆SSR遗传连锁图谱信息

Table 2 Information of linkage groups of adzuki bean based on SSR markers

连锁群 Linkage groups	标记个数 Number of markers	长度（cM） Length	标记平均距离（cM） Interal between maker
LG1	16	629.0	39.3
LG2	11	497.4	45.2
LG3	7	126.3	18.0
LG4	9	358.8	39.9
LG5	12	374.3	31.2
LG6	8	263.0	32.9
LG7	10	403.6	40.4
LG8	10	240.0	24.0
LG9	16	591.1	36.9
LG10	8	160.0	20.0
LG11	4	170.0	42.5

图5 小豆SSR遗传连锁图

Fig.5 Linkage groups of adzuki bean based on SSR markers

2.3 小豆炸荚及硬实率QTL定位

2.3.1 炸荚性QTL定位

2021年共检测到与荚皮卷曲数相关QTL 9个，与炸荚率相关QTL 10个，表型贡献率分别在1.56%~2.41%及1.73%~1.79%之间（表3）。与荚皮卷曲数相关QTL分别分布在LG1、4、6、7、8、9，与炸荚率相关QTL分别分布在LG1、3、5、7、11。19个QTL中，有4个为炸荚率和荚皮卷曲数重复检测的区间，分别位于LG1（mb56~mb43）和LG7（mb26~mb90，mb87~mb92，mb94~mb35）。

表3 不同年份检测到的与小豆炸荚率及荚皮卷曲数相关QTLs

Table 3 QTLs related with pod shattering in adzuki bean under different environments

年份 Year	性状 Traits	QTL名称 QTL name	连锁群 Linkage group	区间 Interval	位置（cM） Positon	LOD值 LOD value	表型贡献率（%） Phenotypic variation explained
2021	炸荚率	Qvrps-1.1	1	mb5~mb1	34	7.18	1.79
		Qvrps-1.2	1	mb3~mb51*	429	5.44	1.75
		Qvrps-1.3	1	mb56~mb43*	577	7.63	1.79
		Qvrps-1.4	3	mb64~mb14	28	5.51	1.78
		Qvrps-1.5	5	mb23~mb74	335	6.50	1.78
		Qvrps-1.6	7	mb26~mb90*	28	4.37	1.73
		Qvrps-1.7	7	mb76~mb93	122	6.45	1.77
		Qvrps-1.8	7	mb87~mb92*	212	7.67	1.74
		Qvrps-1.9	7	mb94~mb35*	367	5.62	1.76
		Qvrps-1.10	11	mb34~mb46*	106	7.05	1.78
	荚皮卷曲数	Qvnpc-1.1	1	mb56~mb43*	576	7.03	1.56
		Qvnpc-1.2	4	mb16~mb69	116	20.92	2.40
		Qvnpc-1.3	4	mb17~mb70	325	26.55	2.41
		Qvnpc-1.4	6	mb83~mb25	225	22.12	2.40
		Qvnpc-1.5	7	mb26~mb90*	31	21.91	2.40
		Qvnpc-1.6	7	mb87~mb92*	215	21.34	2.40
		Qvnpc-1.7	7	mb94~mb35*	372	21.89	2.40
		Qvnpc-1.8	8	mb28~mb97	201	23.52	2.40
		Qvnpc-1.9	9	mb39~mb49	394	21.02	2.40
2022	炸荚率	Qvrps-2.1	1	mb56~mb43*	567	6.68	4.70
		Qvrps-2.2	2	mb13~mb57	262	7.69	4.69
		Qvrps-2.3	7	mb94~mb35*	366	14.07	5.45
		Qvrps-2.4	9	mb32~mb29	46	7.26	4.71
		Qvrps-2.5	11	mb34~mb46*	91	8.31	4.68
	荚皮卷曲数	Qvnpc-2.1	1	mb1~mb2	98	11.15	3.43
		Qvnpc-2.2	1	mb3~mb51*	427	14.26	3.42
		Qvnpc-2.3	1	mb56~mb43*	576	13.13	3.43
		Qvnpc-2.4	2	mb59~mb10	85	11.35	3.43
		Qvnpc-2.5	7	mb87~mb92*	215	16.40	3.44
		Qvnpc-2.6	9	mb32~mb29*	48	13.55	3.43
		Qvnpc-2.7	9	mb102~mb33	562	12.89	3.43
		Qvnpc-2.8	10	mb45~mb44	114	13.00	3.44
		Qvnpc-2.9	11	mb34~mb46*	83	14.87	3.44

*为不同年份炸荚率及豆荚卷曲数重复检测到的区间。 vrps 即小豆炸荚率，vnpc即小豆豆荚卷曲圈数；下同

* means the interval has been repeatedly detected for vrps and vnpc between years. vrps means ratio of pod shattering in Vigna angularis， vnpc means number of pod curling in V. angularis； The same as below

2022年检测到与荚皮卷曲数相关QTL 9个，与炸荚率相关QTL 5个，贡献率分别在3.42%~3.44%及4.68%~5.45%之间（表3）。与荚皮卷曲数相关QTL分别分布在LG1、2、7、9、10、11，与炸荚率相关QTL分别分布在LG1、2、7、9、11。14个QTL中，有3个为炸荚率与荚皮卷曲数重复检测的区间，分别位于LG1（mb56~ mb43）、LG9（mb32~mb29）和LG11（mb34~mb46）。

不同年份重复检测到的荚皮卷曲数相关QTL一共有2个，分别分布在LG1（mb56~mb43）和LG7（mb87~mb92）。重复检测到的炸荚率相关QTL有3个，分别分布在LG1（mb56~mb43）、LG7（mb94~mb35）和LG11（mb34~mb46）。结果表明，LG1的mb56~mb43为不同环境下重复检测到的炸荚性状有关的QTL。

2.3.2 硬实率QTL定位

检测到与小豆硬实率相关的QTL共4个，分布在LG5、8、9、11（表4），表型贡献率在2.78%~2.84%。其中LG5和LG8的硬实率相关QTL区间分别与21年炸荚率、荚皮卷曲数相关区间重合，而位于LG11的硬实率相关QTL区间则同时与2021年炸荚率、2022年炸荚率及2022年荚皮卷曲数相关QTL重合（图6）。

表 4 小豆籽粒硬实相关QTL信息

Table 4 information of QTLs related with hard seededness of adzuki bean

连锁群 Linkage group	QTL名称 QTL name	位置（cM） Positon	标记区间 Interval	LOD值 LOD value	表型贡献率（%） Phenotypic variation explained
5	Qvrhs-1	342	mb23~mb74	8.13	2.84
8	Qvrhs-2	203	mb28~mb97	5.15	2.78
9	Qvrhs-3	326	mb109~mb30	5.52	2.78
11	Qvrhs-4	98	mb34~mb46	5.08	2.80

图6 小豆籽粒硬实率、荚皮卷曲数、炸荚率等不同性状间重合的QTL区间

Fig. 6 QTLs repeatedly detected within hard seededness， ratio of pod shattering and number of curl of pod in adzuki bean

vrhs 即小豆籽粒硬实率；下同

vrhs means ratio of hard seededness in Vigna angularis； The same as below

3 讨论

作为豆科作物的普遍现象，炸荚是受环境和遗传共同调控的复杂性状，其评价方法也不完全一致。其中，大豆一般用炸荚率作为炸荚特性的评价指标^［

26］，本研究中分别利用炸荚率、荚皮卷曲数来评估炸荚特性，结果显示，不同年份间炸荚率的变异远低于荚皮卷曲数，推测其原因为荚皮卷曲数比炸荚率更易受环境影响，尤其是荚的成熟度直接影响荚皮的卷曲程度。不同年份RIL群体各家系的炸荚率及荚皮卷曲数均不符合正态分布，说明了小豆炸荚的遗传背景相对复杂，受多基因控制。

炸荚的分子遗传学研究也以大豆研究比较多，包括炸荚的标记开发^［

27］及基因发掘^{［参考文献 28

百度学术}28］等。小豆炸荚的研究相对罕见，仅Kaga等^{［参考文献 11

百度学术}11］利用荚皮卷曲数指标鉴定出炸荚性状在第7连锁群。本研究QTL分析结果显示同一年份内炸荚率和荚皮卷曲数的定位区间重合度非常高，说明这两种方法均可以用于炸荚性状的评估，而不同年份的炸荚率和荚皮卷曲数的定位区间有部分重合，说明这些重叠区间QTL具有一定环境稳定性。由于炸荚性与含水量及成熟度等多种因素有关 ^{［参考文献 29-30}29-30］，属于多基因控制的复杂性状，本研究检测到的QTL贡献值均较小。

种子硬实也是遗传和环境共同决定的复杂性状。张太平等^［

31］研究认为大豆硬实性状受 2个主基因控制，基因间有累加效应，硬实为显性。种间杂交后代的分离分析也表明大豆籽粒硬实受少数基因调控^{［参考文献 32

百度学术}32］。小豆籽粒硬实研究相对较少，曹志敏等^{［参考文献 1

百度学术}1］发现小豆品种间硬实率有明显差异，不同年份的小豆硬实受降水、日照、气温等影响。本研究RIL家系的硬实率均显著低于野生小豆，说明在野生资源的育种利用中，后代硬实率并不是关键影响因素。而硬实率相关QTL均较低的表型贡献率印证了该性状为多因素调控。4个硬实率相关QTL中有3个分别与小豆炸荚性状QTL区间重合，说明这些驯化相关性状可能在基因组上紧密连锁或簇状分布，非常有利于在野生资源育种利用过程中的分子标记辅助选择或大片段的回交导入。由于本研究中用于图谱构建的SSR标记数量有限，定位区间相对粗略，下一步将开发更多的基于PCR技术的标记，加密图谱开展精细定位，以提高分子标记辅助选择效率，促进小豆驯化相关性状的基因克隆及功能解析。

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