大豆优异种质蛋白质和脂肪含量<bold>QTL</bold>挖掘

祁航; 王婉; 唐晓飞; 薛永国; 曹旦; 刘鑫磊; 栾晓燕; 杜吉到; 邱丽娟; QI Hang; WANG Wan; TANG Xiaofei; XUE Yongguo; CAO Dan; LIU Xinlei; LUAN Xiaoyan; DU Jidao; QIU Lijuan

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大豆优异种质蛋白质和脂肪含量QTL挖掘 PDF

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祁航 ^1,2
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刘鑫磊 ³
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栾晓燕 ³
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杜吉到 ¹
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邱丽娟 ^1,2
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1. 黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319； 2. 农作物基因资源与遗传改良国家重大科学工程 / 农业农村部种质资源利用重点实验室 / 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081； 3. 黑龙江农业科学院大豆研究所，哈尔滨 150086

最近更新：2023-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230323002

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摘要

大豆是全球重要的豆科作物，是人们食用和饲用主要的蛋白质和油脂来源。大豆蛋白质和脂肪含量受多基因控制且易被环境等因素影响，发掘高蛋白和脂肪基因位点对于定向培育大豆新品种具有重要意义。本研究选用由高产优质品种黑农84与蛋白含量较高品系京河4号杂交构建的880个家系组成的遗传分离群体，利用中豆芯一号SNP标记和SSR分子标记技术鉴定F₂群体的基因型，结合蛋白质、脂肪含量表型，通过QTL IciMapping4.2的完备区间作图法（ICIM-ADD）定位获得2个蛋白QTL和2个脂肪QTL。qPro_11_1和qOil_11_1，位于分子标记SSR_11_1087与SSR_11_1090之间，区间大小为126.27 kb，遗传贡献率分别为4.05%和3.23%，共有注释基因5个。qPro_14_1和qOil_14_1，位于SSR_14_0421与SSR_14_0429之间，区间大小为246.09kb，遗传贡献率分别为4.67%和7.13%，共有注释基因15个。本研究定位的稳定的蛋白质含量位点和脂肪含量新位点，为大豆高蛋白和高油分子标记辅助选择育种和基因图位克隆奠定了基础。

关键词

大豆; 蛋白质含量; 脂肪含量; SSR; QTL定位

大豆［Glycine max （L.） Merr.］是一种重要的经济农作物，是人类膳食中植物蛋白和食用油的主要来源之一，籽粒蛋白质和脂肪对人类消费和工业应用具有很大价值^［

1-2］。籽粒蛋白质是决定大豆营养价值和经济价值的关键因素^{［参考文献 3

百度学术}3］，大豆蛋白质和脂肪含量是由多个基因控制并易受环境影响的复杂数量性状^{［参考文献 4

百度学术}4］。黑龙江为我国主要的大豆商品粮基地，播种面积占全国的70%，其地理位置及气候条件的特殊性，使得黑龙江的黑土地大豆种植相比于其他省市具有优势。对黑龙江省大豆的品质分析结果表明，大豆蛋白质和脂肪含量与南方等地区相比存在一定的差距，具体表现是蛋白质含量偏低，蛋脂总量偏低^{［参考文献 5

百度学术}5］。因此，利用黑龙江大豆品种挖掘大豆蛋白和脂肪含量相关的QTL/基因，对培育高蛋白、高油含量新品种具有重要的理论和实践意义。

随着数量遗传学的发展，大豆蛋白质、脂肪含量QTL/基因可采用多种分子标记技术进行鉴定，包括限制性片段长度多态性（RFLP，restriction fragment length polymorphism）、扩增片段长度多态性（AFLP，amplified fragment length polymorphism）和简单重复序列多态性（SSR，simple sequence repeat polymorphism）等^［

6-8］。1988年Apuya等^{［参考文献 9

百度学术}9］利用RFLP标记进行连锁分析，构建了第一张大豆品种遗传图谱。Keim等^{［参考文献 10-11}10-11］利用驯化大豆与野生大豆杂交的F₂分离群体构建了一个大豆分子标记遗传连锁图谱，确定了遗传标记与数量性状位点间的关联，并首次利用RFLP标记对大豆进行QTL定位。此后，更多的学者利用不同的群体（F₂、RIL、BC）和分子标记（RAPD、AFLP、SSR）构建了密度不同的遗传图谱^{［参考文献 12-14}12-14］。相对于RFLP等标记多态性低的缺点，Akkaya等^{［参考文献 15

百度学术}15］证实了SSR标记在大豆基因组中的高多态性。1999年，Cregan^{［参考文献 16

百度学术}16］报道了606个SSR基因座的开发，使大豆连锁图谱的标记密度进一步增加。Song等^{［参考文献 17

百度学术}17］构建了一个完整的大豆遗传公共图谱，其包含1849个标记，其中1015个SSR、709个RFLP、73个RAPD。SSR分子标记技术成熟且易操作，SSR分子标记为大豆种质系统的遗传分析提供了实用有效的工具。

蛋白质和脂肪是大豆品质育种的重要目标，国内外已有大量的研究，并有专门的学术共享网站（www.Soybase.com）。Diers等^［

18］利用栽培与野生大豆杂交形成的种间群体，首次报道了与大豆蛋白质和脂肪含量相关的QTL。Lee等^{［参考文献 19

百度学术}19］利用两个群体的F₄和F₂衍生系，通过单因素方差分析和区间作图法分别在E、G、H、K 4个连锁群检测到蛋白质QTL，可解释的表型变异为4.9%~7.4%，其中在E、G、H 3个连锁群同时检测到与脂肪相关的QTL。Sebolt等^{［参考文献 20

百度学术}20］利用野生大豆构建的BC₃群体，在连锁群I上检测到蛋白质主效QTL且与蛋白质含量显著相关，可解释的表型变异为41%~65%。Jun等^{［参考文献 21

百度学术}21］、Qi等^{［参考文献 22

百度学术}22］利用SSR标记，通过关联分析和复合区间方法定位，定位到多个大豆蛋白质QTL，可解释的表型变异为4.4%~14.5%。Yesudas等^{［参考文献 23

百度学术}23］通过SSR标记的方差分析和复合区间映射在第18及20号染色体上发现种子油分QTL，且在第20号染色体还发现1个种子蛋白质QTL。Panthee等^{［参考文献 24

百度学术}24］利用RIL群体通过SSR标记的单因素方差分析和复合区间作图定位到3个种子脂肪QTL，分布在第1、10和12号染色体。目前SoyBase数据库公布的大豆蛋白质和脂肪含量相关QTL数量分别为241和315个，其中主要分布在第15和20号染色体，可解释的遗传贡献率为0.07%~65%。虽然大豆蛋白质和脂肪含量相关QTL鉴定已有众多报道，但应用于分子育种的QTL较少且区间较大，仍需要进一步挖掘QTL/基因。

本研究利用黑龙江省高产优质品种黑农84为母本，高蛋白品系京河4号为父本，构建包含880个家系的F₂群体，结合SSR分子标记基因型数据和群体的表型数据，采用QTL IciMapping4.2完备区间作图法（ICIM-ADD），定位与蛋白质和脂肪含量相关的QTL位点，为改善大豆品质性状和分子标记辅助育种及基因挖掘提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 群体构建

以黑龙江省农业科学院培育的优质多抗、高产品种黑农84（蛋白质含量43.26%，脂肪含量20.41%）为母本，黑龙江省农业科学院黑河分院培育的高蛋白品系京河4号（蛋白质含量45.21%，脂肪含量19.45%）为父本。黑农84与京河4号杂交，通过单粒传法进行加代，构建包含880个家系的F₂遗传分离群体。分别于2019、2020年在黑龙江省农科院试验基地春播种植F₂、F_2：3群体，均采用3 m行长，行距为0.60 m，株距为0.06 m。全生育期田间管理同一般大田管理，植株成熟后从每行选择正常一致的5株进行收获。

1.2 表型数据测定

选择表面干净、无裂纹、菌斑、颗粒完整的大豆种子样品约30~50粒，利用德国Bruker公司生产的傅立叶变换近红外光谱仪^［

25］对群体样品扫描，采集样品的近红外吸收光谱信息，用已构建好的大豆蛋白质、脂肪干基模型，在软件OPUS中分析样品光谱数据得到蛋白质和脂肪含量数据。F₂群体每个单株测定3次重复，取平均值代表该样品的蛋白质和脂肪含量，F_2：3群体每个株系取5个单株，每株测定3次，取5个单株的平均值代表样品的蛋白质和脂肪含量。

利用Microsoft Excel 2019和Minitab17分析群体最大值、最小值、平均数、标准差、偏度、峰度、变异系数和相关系数，并绘制蛋白质、脂肪含量分布图，利用R语言对区间两端标记基因型与蛋白质、脂肪含量进行差异性分析。

1.3 基因组DNA提取

2019年取黑农84与京河4号的F₂群体880个家系的三出复叶的等量叶片，采用经典的CTAB法^［

26］提取叶片基因组DNA，同时提取亲本的基因组DNA。用1%的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA的质量和浓度。

1.4 中豆芯一号芯片检测

试验所用的中豆芯一号芯片为200K SNP芯片，采用商业试剂盒（天根植物基因组DNA试剂盒，DP305）从大豆幼叶中提取基因组DNA。本研究使用基于Illumina^®平台开发的ZDX1 SNP阵列作为分型工具，使用GenomeStudio软件获取SNP基因型，对分型信号进行测试和调整，获得亲本及F₂群体的基因型。

1.5 SSR标记选择及基因型鉴定

基于实验室200K芯片QTL定位结果，选择SSR标记进行QTL定位验证及区间缩小。在大豆数据库SoyBase（https：//www.soybase.org）网站上选择QTL区间内部及附近的SSR标记，11、14号染色体上共计49对SSR标记（表1），根据引物序列信息，由北京博迈德生物技术有限公司合成。利用合成的SSR标记对黑农84和京河4号进行多态性筛选，选择具有多态性的SSR标记对F₂群体进行基因型鉴定。

表1 SSR引物序列信息

Table 1 SSR primer sequence information

标记名称 Marker name	上游引物序列（5′-3′） Upper primer sequence（5′-3′）	下游引物序列（5′-3′） Lower primer sequence（5′-3′）
11_1040	TGGTTATTTTTGTGGGACATTG	TACTGTTTGAACTTGACTTACTTTTGT
11_1046	TTTGTTGACTTCAATGAATTTGCT	TCCACATATTGTGTTTTGAAGAAA
11_1050	TGCTACCAGTCCAAGCCTTT	AGGGTGTGAAGGGGAAAAAC
11_1052	GATCTCCAAATTAAGCCTTGAAC	TGATGGAAACCTAGCAAGCA
11_1056	TGGGAGATGTCCAATTTTCA	CCTTTTGTCATATGCTACACACG
11_1058	TTTTCTTCTGCACACGTGATT	TTCACAACCATATCCTATGTCCA
11_1059	TTTCAATTTTGCGAGGACAA	TTTAACAAGACAAGAAATGCAAAAA
11_1061	ATCCAGGTAACAACATGGCA	CATGCAAAAGCAAGCCCTAT
11_1063	GCATCCATTCACATAAAATTGG	CGTAAAAAGTCGTTCAAAACCA
11_1064	TTGCGAACAAAATGCAAAAG	TCACAGCGGATTATTTGGTG
11_1067	TGTCCAGCCATGCATTTTAC	GGATGTTCAAATTAAAAATTCAGAAA
11_1068	CACCATCTCACAACTTGAGCA	GCTGATTCCTTGGCAAACAT
11_1070	TCCAATGAAGGATTGGTGTG	GCGGGGGTGAAACAGTAGTA
11_1071	CCCAAAGATGGGTCTTCTGA	TGTTACCAAAAGAAAGTCACCTTATG
11_1072	TTGGCCCACCTTGATAACTC	TGAAGGTTGAGGATGCATTG
11_1073	AAGCTCAATTTGAACACATAAAAATG	CATCTTAGGCTCCCGGATCT
11_1074	GTTTTCTCCATCACCTCCCA	CCTTGGACGAACATTGGAGT
11_1075	CAAGATACTAATCTCTGCTGAGGC	ATCTTGCCTTGTGCATTGTG
11_1076	GCACGAATTGAAAAAGTTTAAGTTG	CGAGCTGCTACCAGTTTTTGT
11_1077	GAGGCACCGACAAAGTTGAT	CAGTTGATTCGCGCTTAATTT
11_1078	TGAAAGAGTATTTGAAATCGAAGAGA	TCAATGAGGAAGGATCAAGACA
11_1079	CCCTCAAACAATTGGATAAAAGA	GTGGACACTTCATTAAAAGTAGGTT
11_1080	GCGCGGAAGAAGAAAGTTTA	CAGAACACTACTCAATGTCATCGTT
11_1081	CCAACTAAATAAGCTAGATCCCATC	AAAAATGGCAAGGAAAAGTGA
11_1082	TTAAGGCTGAGGTCCCCTTT	TCACAGGGTGGTGTTGAAGA
11_1083	AATCACGTGTCAAAATTATTATATGC	TCAAATTAAGTCATCAATGGCA
11_1084	TCGTGCCTTAATTGTGTTGG	CAAATTGTTTTGCCGCTCTT
11_1087	TGGATCGATCTTGGTACGATA	CGACAAATGTGATACGGGAC
11_1089	GCTTTTATTAATGCCAGGGG	TTTCCCTTTTCCTTCTCCGT
11_1090	AAGTGACTTATTAGCCCGATCA	CAGGCCTGCCTGTAAACAAT
11_1091	CCACTTCACAAGTGTGGAAAAA	TGGGTCAAGCAAAAATTTAACA
14_0409	TTGCAGAGTCCACAAACTGC	TCACAAGAAGTGGCCAAAAC
14_0411	GATTCAACTCCCACAAACACA	CTCTGCGAACATTCAACACC
14_0413	GAAGGGAAATGGTTTGGGAT	ACCACTTCCAACGGCACTAC
14_0415	GTGTAATAGTTGTCAAAGTTATACCGA	TGCAGCAATTTTACTGGGTG
14_0417	CGGGCTATCTTCCTCCTCTC	TGCATGAGGTTGTTGTAGACG
14_0419	GAGACGAGAAAAGTGGACGAA	TGAATTGGATTCTGTGTGCAT
14_0421	ACATCTTTGCCATCTCAAACC	CGTCTCAACTCATCTCAATGTCA
14_0422	ATGGCCACTTGTGAAGTTCC	TGGGTGCTTTTACCGAACTC
14_0423	GTGCTATTGGCACTACCCGT	TTTGCATCCCACACAATACAA
14_0425	TCACTGTATTAGATCCAATGCTCAA	TGGATTGAAACGCTACAATGAAT
14_0427	CAATAATCAAAGTTAGGTATCATGAGC	CGTGCTCCTGAATAGACAAGG
14_0429	CAGCCTCAAGAATCCACACA	AGCGCGTGAGAAGTTGTTTC
14_0431	TCAATTGCGTTCAAACACTCA	TCCACATCGAAATTTCTTCAAA
14_0432	GAAGCTTATTTGCTGGCTGG	AACCTGCATGTTGCACAATC
14_0433	TGGACCAACATCGTCACCTA	TTCCAATTTTCCTGTTTCGG
14_0434	GTTGGTTACCCCACGGTATG	TACCATTAGCACGCGTTTTG
14_0435	TCCGGATGGACTTGACTCAT	TGCATGTCAAGCAAGTTGAG
14_0436	GCTTATCATACACGTATAAAGGTTTGC	TCATTGAGAAGGAGTTGTGCT
14_0437	GGCTTATTATTCCTTCTTTTGTCA	AAGTGTATCTTCTCAAATTTTGTCCA
14_0438	TGCTTGGCACTTGTACATCC	GGGAAAACTGAAAATCCCCA
14_0439	CTGAAATGCTTCCCAGTGGT	CTCAAAAGGGGTTCCATCAA
14_0441	CGGATGATGTTGAAGTCACG	GAACCTCCGGAAAGTTTCTT
14_0442	GCTTGACAAAGGGGGAAAA	CAGGTTTTTAAGAATGAAAACGAAA
14_0443	CTATGTTTAGGGACCGCAGC	TCCGTTGTCAACCTGAAAGTC
14_0444	GGGTGAGGTCTTCGTTGTTC	ACTAGAACTTGAGGCCACGG
14_0445	TGAGCTTTTATCACCCCCAA	CAATTGAAAAGTTTAACAAATTGAGA
14_0446	TGAAAGATGACTAACGACGACAA	TGCGTGTGAAGGGAAATAAA
14_0447	TGATCAAGATTAATCCCTACCACC	CCCTTCATATTGTGTTTTTCCA

黑色加粗的标记为筛选的多态性SSR标记

The markers in bold black font are screened polymorphic SSR markers

PCR反应采用10 μL反应体系：2 μL的DNA模板（20 ng/μL），1 μL 10×Easy Taq Buffer（含Mg²⁺），0.8 μL 2.5 mmol/L dNTPs，5.1 μL的ddH₂O，0.1 μL Easy Taq酶（5 U/μL），1μL 2μmol/L SSR引物（正反向引物混合）。PCR反应程序为95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，循环34次；最后72 ℃延伸5 min，12 ℃保存。扩增产物中加入3 μL 6×loading buffer （终体积50 mL：0.125 g嗅酚蓝，0.125 g二甲苯青，49 mL甲酚胺，1 mL 0.5 mol/L pH8.0的EDTA），取出PCR产物迅速置于4 ℃冰箱保存。

通过6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测F₂群体SSR标记的扩增产物，取1 μL 加入6×loading buffer 的PCR产物点样，恒定功率100 W，电泳约1 h，最后进行银染显色^［

27］。其中与母本黑农84条带相同的记为A，与父本京河4条带相同的记为B，杂合带型记为H，缺失或模糊的带型记为-。

1.6 QTL定位

结合检测的表型数据与200K芯片和SSR标记鉴定的群体基因型数据。使用QTL IciMapping4.2^［

28］软件中的*map模块进行遗传图谱构建，根据Churchill等^{［参考文献 29

百度学术}29］的方法，模拟运算1000次，设定QTL的显著性水平为0.05，并用完备区间作图法（ICIM）对大豆蛋白质、脂肪含量进行QTL定位分析，蛋白质含量QTL命名前缀为qPro，脂肪含量QTL命名前缀为qOil。

1.7 基因功能注释及表达量查询

利用Phytozome v13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov）网站，Glycine max Wm82.a4.v1基因组，输入基因号检索基因的功能注释。在大豆数据库SoyBase（https：//www.soybase.org）网站，Expression工具栏查询，以Williams82为参考基因组，选择seed 10DAF（DAF，day after flowering）、seed 14DAF、seed 21DAF、seed 25DAF、seed 28DAF、seed 35DAF和seed 42DAF种子发育时期，输入基因号查询基因的表达量，使用R语言进行基因表达量统计作图。

2 结果与分析

2.1 亲本及群体的蛋白质、脂肪含量分布

亲本黑农84和京河4号的蛋白质、脂肪含量存在差异，2019年黑农84的蛋白质含量为43.26%，脂肪含量为20.41%，京河4号的蛋白质含量为45.21%，脂肪含量为19.45%。880个家系间的蛋白质和脂肪含量存在较大差异（表2），2019年的蛋白质含量变异幅度为37.71%~50.61%，变异系数为4.54%，脂肪含量变异幅度为11.17%~22.42%，变异系数为6.04%；2020年的蛋白质含量变异幅度为36.79%~49.89%，变异系数为5.90%，脂肪含量变异幅度为15.37%~21.60%，变异系数为6.30%。两个世代的群体中均存在明显的超亲分离，对其进行频率分布和偏度、峰度分析，蛋白质和脂肪含量均呈现正态分布（图1），可用于蛋白质和脂肪含量的QTL定位。

表2 黑农84×京河4号群体蛋白质、脂肪含量统计分析

Table 2 Statistical analysis of protein and oil content in Heinong 84×Jinghe 4

性状 Traits	年份 Year	黑农84 Heinong84	京河4号 Jinghe4	分离群体Segregating population
性状 Traits	年份 Year	黑农84 Heinong84	京河4号 Jinghe4	平均值±标准差 Mean±SD	变异系数（%）CV	峰度 Kurtosis	偏度 Skewness
蛋白质含量（%） Protein content	2019	43.26±1.04	45.21±1.06	44.20±0.07	4.54	-0.02	0.08
蛋白质含量（%） Protein content	2020	41.59±2.09	43.49±1.36	43.77±0.11	5.90	-0.22	-0.33
脂肪含量（%） Oil content	2019	20.41±0.93	19.45±1.20	19.54±0.04	6.04	3.18	-0.77
脂肪含量（%） Oil content	2020	20.11±0.84	19.47±0.53	18.65±1.17	6.30	-0.42	-0.05

图1 黑农84×京河4号群体蛋白质、脂肪含量分布直方图

Fig. 1 Histogram of protein and oil content distribution in Heinong 84×Jinghe 4

a、b为F₂群体，c、d为F_2：3群体

a， b is the F₂ population，c， d is the F_2：3 population

相关性分析结果显示（表3），两个世代间蛋白质含量和脂肪含量均存在一定的相关性。F₂与F_2：3群体蛋白质含量相关性系数为0.32，呈极显著的正相关；脂肪含量相关性系数为0.34，呈极显著的正相关。F₂群体的蛋白质和脂肪含量及F_2：3群体间的相关性系数均为负数，说明同一世代间蛋白质和脂肪含量呈现负相关性。这表明尽管不同世代的蛋白质和脂肪含量变异幅度不同，但整体的变化趋势一致。

表3 F₂与F₂_：₃群体蛋白质和脂肪含量的相关性

Table 3 Correlation of protein and oil content between F₂ and F_{2： 3}

群体 Population	性状 Traits	F₂		F_2：3
群体 Population	性状 Traits	蛋白质含量 Protein content	脂肪含量 Oil content	蛋白质含量 Protein content	脂肪含量 Oil content
F₂	蛋白质含量	1
F₂	脂肪含量	-0.09	1
F_2：3	蛋白质含量	0.32***	-0.32***	1
F_2：3	脂肪含量	-0.34***	0.34***	-0.91***	1

***代表在0.001水平下显著

***represent significance at the 0.001 probability levels

2.2 基于200K芯片的蛋白质含量QTL定位

利用F₂群体880个单株的基因型，结合蛋白质和脂肪含量表型数据，利用QTL IciMapping4.2完备区间作图法（ICIM-ADD）进行相关QTL定位，未定位到脂肪含量QTL，在第11和14号染色体定位到2个蛋白质含量QTL：qPro_1和qPro_2。其中qPro_1区间大小为75.72 kb，包含2个基因；qPro_2区间大小为411.79 kb，包含26个基因（表4）。

表4 200K芯片鉴定的蛋白质含量QTLs

Table 4 Protein content QTLs identified by 200K chip

QTL名称

QTL name

染色体

Chr.

左侧标记

Left marker

右侧标记

Right marker

LOD值

LOD

遗传贡献率（%）

PVE

加性效应

Additive effect

区间大小（kb）

Interval

基因数量

Number of genes

qPro_1

Gm11_15669676

Gm11_15593956

2.83

1.53

0.25

75.72

qPro_2

Gm14_7329914

Gm14_7741706

3.41

2.18

-0.34

411.79

-表明加性效应为负值，增效基因来源于京河4号，下同

- indicates that additive effect is negative， synergistic gene from Jinghe 4， the same as below

2.3 蛋白质和脂肪含量QTL精细定位

为进一步分析蛋白质含量位点qPro_1和qPro_2，分别选择两个区间内部及左右两侧共49对SSR引物扩增母本黑农84和父本京河4号的DNA进行引物多态性筛选，在第11、14号染色体各检测到11对多态性SSR标记（图2）。

图2 部分SSR标记在黑农84和京河4号多态性筛选结果

Fig. 2 Polymorphism of partial SSR markers between Heinong 84 and Jinghe 4

1：黑农84；2：京河4号

1： Heinong 84；2：Jinghe 4

以筛选出的多态性SSR标记鉴定群体基因型，结合F₂与F_2：3群体的表型数据，利用QTL IciMapping4.2构建遗传图谱定位QTL位点。结果表明，F₂与F_2：3两个世代重复定位到蛋白质和脂肪含量QTL各两个，分别为qPro_11_1、qPro_14_1和qOil_11_1、qOil_14_1（图3）。qPro_11_1和qOil_11_1长度为126.27 kb，遗传贡献率分别为4.05%和3.23%，均包含5个基因，且qPro_11_1与qPro_1发生重叠，重叠区间大小为66.37 kb。qPro_14_1和qOil_14_1长度为246.09 kb，遗传贡献率分别为4.67%和7.13%，均包含15个基因，qPro_14_1包含于qPro_2内（表6）。

图3 Chr.11和Chr.14蛋白质和脂肪含量QTL定位

Fig. 3 Protein and oil content QTL mapping in Chr.11 and Chr.14

a：蛋白质和脂肪QTL定位遗传图谱，染色体左侧绿色标记为qPro_1和qPro_2两端标记，红色标记为qPro_11_1、qOil_11_1、qPro_14_1和qOil_14_1两端标记；b：qPro_11_1和qOil_11_1定位LOD图；c：qPro_14_1和qOil_14_1定位LOD图

a： Protein and oil content QTL mapping genetic map， qPro_1 and qPro_2 are marked in green on the left side of chromosome， and qPro_11_1， qOil_11_1， qPro_14_1 and qOil_14_1 are marked in red； b： Locate LODs in qPro_11_1 and qOil_11_1； c： Locate LODs in qPro_14_1 and qOil_14_1

表6 蛋白质和脂肪含量QTLs

Table 6 Protein and oil content QTLs

QTL名称 QTL name	左侧标记 Left marker	右侧标记 Right marker	物理位置（bp） Position	区间大小（kb） Interval	LOD	遗传贡献率（%） PVE	加性效应 Additive effect	基因数量 Number of genes
qPro_11_1	11_1090	11_1087	15534064~15660330	126.27	4.51	4.05	0.74	5
qOil_11_1	11_1090	11_1087	15534064~15660330	126.27	3.90	3.23	-0.33	5
qPro_14_1	14_0421	14_0429	7468386~7714532	246.09	3.31	4.67	-0.61	15
qOil_14_1	14_0421	14_0429	7468386~7714532	246.09	6.78	7.13	0.39	15

2.4 qPro_11_1不同基因型的蛋白质和脂肪含量差异显著性分析

F₂群体中，11_1090标记A基因型（与黑农84同）蛋白质含量为44.36%±2.17%、B基因型（与京河4号同）蛋白质含量为43.74%±2.01%，A相对于B增加了0.62%；A基因型脂肪含量为19.51%±1.25%、B基因型脂肪含量为19.79%±1.15%，A相对于B降低了0.28%。11_1087标记A基因型蛋白质含量为44.42%±2.17%、B基因型蛋白质含量为43.67%±2.02%，A相对于B增加了0.75%；A基因型脂肪含量为19.47%±1.26%、B基因型脂肪含量为19.80%±1.18%，A相对于B降低了0.33%（图4）。

图4 Chr.11定位QTL的蛋白质和脂肪含量差异显著性测验

Fig. 4 Test for significance of differences in protein and oil content of QTL on Chr.11

a、b：11_1090标记；c、d：11_1087标记；A：与黑农84基因型相同； B：与京河4号基因型相同，下同；*、**、***、****分别表示在0.05、0.01、0.001、0.0001水平差异显著

a， b： 11_1090 marker；c， d： 11_1087 marker；A：The same genotype as Heinong84； B：The same genotype as Jinghe4，the same as below；*， **， *** and **** indicated significant differences at 0.05， 0.01， 0.001 and 0.0001 levels respectively

F_2：3群体中，11_1090标记A基因型蛋白质含量为44.24%±2.78%、B基因型蛋白质含量为42.84%±2.51%，A相对于B增加了1.40%；A基因型脂肪含量为18.40%±1.31%、B基因型脂肪含量为19.02%±1.07%，A相对于B降低了0.62%。11_1087标记A基因型蛋白质含量为44.34%±2.75%、B基因型蛋白质含量为42.75%±2.54%，A相对于B增加了1.59%；A基因型脂肪含量为18.37%±1.31%、B基因型脂肪含量为19.05%±1.08%，A相对于B降低了0.68%（图4）。

结果表明两个世代的两个位点的不同基因型在蛋白质和脂肪含量分布上均具有显著性差异，表明该标记与蛋白质和脂肪含量存在密切关联。

2.5 qPro_14_1不同基因型的蛋白质和脂肪含量差异显著性分析

F₂群体中，14_0421标记A基因型蛋白质含量为44.10%±2.06%、B基因型蛋白质含量为44.77%±2.07%，A相对于B降低了0.67%；A基因型脂肪含量为19.62%±1.23%、B基因型脂肪含量为19.18%±1.56%，A相对于B增加了0.44%。14_0429标记A基因型蛋白质含量为44.16%±2.01%、B基因型蛋白质含量为44.74%±2.01%，A相对于B降低了0.58%；A基因型脂肪含量为19.62%±1.18%、B基因型脂肪含量为19.17%±1.08%，A相对于B增加了0.45%（图5）。

图5 Chr.14定位QTL的蛋白质和脂肪含量差异显著性测验

Fig. 5 Test for significance of differences in protein and oil content of QTL on Chr.14

a、b：14_0421标记； c、d：14_0429标记

a， b： 14_0421 marker； c， d： 14_0429 marker

F_2：3群体中，14_0421标记A基因型蛋白质含量为43.50%±2.75%、B基因型蛋白质含量为44.67%±2.19%，A相对于B降低了1.17%；A基因型脂肪含量为18.91%±1.22%、B基因型脂肪含量为18.13%±1.06%，A相对于B增加了0.78%。14_0429标记A基因型蛋白质含量为43.57%±2.66%、B基因型蛋白质含量为44.46%±2.24%，A相对于B降低了0.89%；A基因型脂肪含量为18.83%±1.22%、B基因型脂肪含量为18.24%±1.08%，A相对于B增加了0.59% （图5）。

结果表明两个世代的两个位点不同基因型的蛋白质和脂肪含量分布均具有显著性差异，表明该标记与蛋白质和脂肪含量存在密切关联。

2.6 候选区间基因功能注释及表达量分析

通过SoyBase（https：//www.soybase.org）数据库查询qPro_11_1和qPro_14_1区间内共20个基因，利用Phytozome v13（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov）检索其中15个基因具有功能注释（表7），根据基因功能注释推测3个基因与蛋白质含量相关，Glyma.11g164300具有蛋白磷酸酶2C功能，Glyma.14g085600和Glyma.14g085800参与半胱氨酸生物合成。利用SoyBase数据库对基因在种子发育不同时期的表达量进行查询分析（图6），表达量较高的有3个：Glyma.11g164700、Glyma.14g085800、Glyma.14g086000。推测Glyma.11g164300、Glyma.11g164700、Glyma.14g085600、Glyma.14g085800、Glyma.14g086000可能为候选基因，但需要进一步的研究验证。

表7 候选区间内基因功能注释

Table 7 Gene function annotation in candidate interval

基因名称 Gene name	功能注释 Functional annotation	基因名称 Gene name	功能注释 Functional annotation
Glyma.11g164300	蛋白磷酸酶2C相关	Glyma.14g085300	未知
Glyma.11g164400	未知	Glyma.14g085400	富含亮氨酸重复序列受体样蛋白激酶
Glyma.11g164500	［酰基载体蛋白］S-丙二酰转移酶/MCAT	Glyma.14g085500	WRKY转录因子相关
Glyma.11g164600	葡萄糖基/葡萄糖醛酸转移	Glyma.14g085600	半胱氨酸蛋白酶家族C1相关
Glyma.11g164700	肉桂酰辅酶A还原酶样蛋白	Glyma.14g085700	EF-钙结合域蛋白
Glyma.14g084800	蛋白核糖核酸酶P1	Glyma.14g085800	半胱氨酸蛋白酶家族C1相关
Glyma.14g084900	未知	Glyma.14g085900	甘露糖-对-多糖醇利用缺陷1 LEC35相关
Glyma.14g085000	RAN结合蛋白9相关	Glyma.14g086000	F-box蛋白SKIP2
Glyma.14g085100	丝氨酸棕榈酰转移酶1	Glyma.14g086100	未知
Glyma.14g085200	驱动蛋白	Glyma.14g086200	未知

图6 SoyBase网站候选区间内基因在种子不同发育时期表达量

Fig. 6 Relative expression levels of seeds at the different developmental stages in the candidate interval of SoyBase website

3 讨论

3.1 群体亲本材料的选择

黑龙江省农业科学院利用分子标记辅助育种，通过杂交、回交等方法对多个目标基因进行选择，选育了遗传背景一致且农艺性状优良的品种黑农84^［

30］。黑农84聚集了亲本的优点，遗传基础更加丰富，是优质高产的黑龙江大豆品种。京河4号为黑龙江省农业科学院黑河分院选育的优质高蛋白大豆品系，由黑河50与中引1106杂交获得，连续3年蛋白质含量均稳定高于45%。利用黑农84和京河4号杂交构建遗传群体进行蛋白质和脂肪含量QTL定位，可以为筛选优质高产且高蛋白的大豆材料奠定基础。

3.2 分子标记的应用

提高大豆种子蛋白质和脂肪含量是大豆育种的主要目标之一，分子标记辅助选择育种为高品质大豆育种提供了一个新的途径^［

31］。分子标记技术的发展为分子育种提供了多种类型的分子标记，例如RAPD、RFLP、AFLP、SSR和SNPs（Single nucleotide polymorphism）等^{［参考文献 32-33}32-33］。其中SSR已被提倡为强大的分子标记系统，是指示重要农艺性状和育种领域应用最为广泛的一项技术，具有高重复性、共显性遗传和广泛的基因组覆盖等特点^{［参考文献 34-35}34-35］。目前SSR分子标记在水稻、小麦、玉米、大麦、大豆等主要作物中广泛应用于遗传图谱的构建。Sharma等^{［参考文献 36

百度学术}36］、Jlassi等^{［参考文献 37

百度学术}37］、Farooqi等^{［参考文献 38

百度学术}38］利用SSR标记定位到较多与品质和抗逆性相关的QTL及等位基因。同时随着SNPs的出现，使得SNP芯片广泛应用于大豆、水稻、小麦等作物的遗传多样性研究、高密度遗传图谱构建以及许多复杂数量性状相关的基因座或基因鉴定^{［参考文献 39-40}39-40］。例如Nsabiyera等^{［参考文献 41

百度学术}41］、Kim^{［参考文献 42

百度学术}42］、Phansak等^{［参考文献 43

百度学术}43］利用SNP芯片鉴定到稳定的品质和抗性QTL及等位基因。本研究同时利用SSR标记和SNP芯片高效快速地鉴定到2个稳定的蛋白质含量QTL，1个稳定的脂肪含量QTL及1个新的脂肪含量QTL，为进一步基因挖掘提供了基础，有助于培育大豆高蛋白高油新种质。

3.3 与前人定位QTL的比较

目前大豆SoyBase（http：//www.soybase.org/）数据库中在第11、14号染色体上定位的蛋白质含量QTL位点各有8个，脂肪含量QTL数量分别为4和19。Gai等^［

44］检测到两个蛋白质含量QTL，这两个QTL均与qPro_11_1发生重叠，大小为126.27 kb。Akond等^{［参考文献 45

百度学术}45］检测到的蛋白质含量QTL，长度为6.37 Mb，与qPro_14_1重叠，大小为246 kb。Diers等^{［参考文献 46

百度学术}46］利用F_2：3家系鉴定到含油量显著位点，长度为1.56 Mb，与qOil_14_1位置最近，距离0.62 Mb。Qi等^{［参考文献 47

百度学术}47］检测到的脂肪QTL大小为12.14 Mb，与qOil_11_1产生11 kb的重叠。数量性状容易受环境因素的影响，但在不同年份、不同地点和不同材料间多次定位到同一QTL，说明该QTL是可稳定遗传的QTL位点^{［参考文献 48-49}48-49］。本研究定位的qPro_11_1、qPro_14_1及qOil_11_1与已发表的不同遗传背景的QTL重叠，说明是稳定主效的QTL，而qOil_14_1为1个新的脂肪QTL位点，可用于下一步的精细定位和图位克隆等研究。

3.4 候选基因预测

根据SoyBase（https：//www.soybase.org/）数据库查询的基因注释推测，Glyma.14g085600和Glyma.14g085800作为半胱氨酸蛋白酶参与生物过程，半胱氨酸为含硫氨基酸，是大豆蛋白质所需的必需氨基酸。研究表明，在大豆中表达玉米醇溶蛋白，半胱氨酸和蛋氨酸含量分别提高了2.36%和3.08%，影响大豆种子的蛋白质结构^［

50］。大豆蛋白质在籽粒发育过程中积累，并易受环境因素影响，Glyma.11g164300蛋白磷酸酶在生长发育和环境胁迫响应中起重要作用，可能调控大豆籽粒蛋白质含量^{［参考文献 51

百度学术}51］。因此推测上述基因可能参与大豆蛋白质合成与积累，但仍需进一步实验鉴定与验证。

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