蒙古栎<bold>Trihelix</bold>转录因子家族鉴定与表达分析

孟鑫; 王世杰; 江敏; 李红燕; 王进茂; 杨敏生; MENG Xin; WANG Shijie; JIANG Min; LI Hongyan; WANG Jinmao; YANG Minsheng

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李红燕
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杨敏生

河北农业大学林学院/河北省林木种质资源与森林保护重点实验室，保定071000

最近更新：2023-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230224007

目录contents

摘要

蒙古栎（Quercus mongolica Fisch.）原产于东亚地区的温带，是珍贵的用材树种，具备很高的应用价值和经济价值。Trihelix转录因子主要与植物光响应、生长发育和响应非生物胁迫等方面相关。为了研究蒙古栎Trihelix转录因子在不同遮阴处理和水分胁迫下的表现，本研究运用生物信息学分析，从蒙古栎基因组中鉴定出34个Trihelix转录因子基因，依次命名为：QmTH01~QmTH34。与拟南芥中鉴定到的29个Trihelix转录因子进行聚类分析，可将其分为GT-1、GT-2、GTγ、SH4、SIP1五个亚族，34个QmTHs分别定位到蒙古栎的10条染色体上，翻译蛋白范围为189~897个氨基酸，等电点为4.58~9.78。QmTHs启动子区域共鉴定出14种不同的与光响应、非生物胁迫、激素以及生长发育响应调控相关的顺式作用元件，其中茉莉酸甲酯响应元件、脱落酸响应元件和光响应元件数量占据主要地位。根据不同遮阴处理和水分胁迫下基因表达分析，鉴定到QmTH01、QmTH14、QmTH22、QmTH24、QmTH33在高光强下表达量相对较高，并随光照强度减弱显著下调表达，表明这5个基因参与蒙古栎响应高光照下的生长生理。鉴定到QmTH06、QmTH17、QmTH24在5次（4、5、6、7、8月）浇水的水分胁迫处理中显著上调表达，表明这3个基因介导蒙古栎响应水分胁迫。

关键词

蒙古栎; Trihelix转录因子; 全基因组鉴定; 生物信息分析; 表达分析

蒙古栎（Quercus mongolica Fisch.）也称柞树，是原产东亚温带地区的白橡树种，属壳斗科（Fagaceae）栎属（Quercus）的落叶乔木^［

1］。蒙古栎属于耐干旱、耐寒植物，抗逆性较强、根系发达，适应能力强^{［参考文献 2

百度学术}2］，其作为暖温带森林中一种具有较强抗性的优势树种，也是中国北方地区次生落叶林的主要营建树种，对维持生态平衡、保护区域生态环境、修缮生态系统具有重要价值^{［参考文献 3-4}3-4］。蒙古栎喜温凉气候，常分布于上阴坡、半阴坡、半阳坡^{［参考文献 5

百度学术}5］，在天然林中，蒙古栎的幼苗、幼树均生活在光强较低的环境之中，苗龄越低受光照强度影响越明显^{［参考文献 6

百度学术}6］。在高光照强度下，蒙古栎的幼苗通常会表现出明显的光抑制现象，但这种现象能随光适应时间的延长逐渐恢复^{［参考文献 7

百度学术}7］。与蒙古栎的自然栖息地相比，位于河北省保定市易县（49 m）的蒙古栎国家林木种质资源库属于低海拔平原地貌。在低海拔地区，蒙古栎苗木的生长发育和叶片生物量的积累时常受到夏季高温及强光的影响。未排除自然降水影响的情况下，适当浇水的蒙古栎幼苗能够更好地积累叶生物量并获得更大的叶面积，而过量的人工浇水则会抑制蒙古栎幼苗叶片的正常生长发育^{［参考文献 8

百度学术}8］。

Trihelix转录因子家族因其特有的3个串联的螺旋结构（螺旋-环-螺旋-环-螺旋）而得名，该结构域高度保守，可以特异性地结合基因上的光应答GT元件，GT元件是在植物基因启动子区串联重复出现的DNA序列^［

9］。因此，该家族又被称为GT因子家族。根据前人的研究报道，可依照GT蛋白结构域的保守氨基酸和DNA结合域数目，将Trihelix转录因子分为5个亚家族：GT-1、GT-2、GTγ、SH4、SIP1，Trihelix转录因子广泛参与植物的生长发育调节并响应非生物胁迫，如耐干旱、低温、涝害等^{［参考文献 10

百度学术}10］。番茄中该家族SlPTL转录因子属于典型的GT-2亚族，SlPTL沉默转基因番茄的株系较野生型发生了矮化、节间距和叶柄变短等表型变化，且抗旱性和抗盐性明显优于对照组^{［参考文献 11

百度学术}11］。TaGT-75异源高表达的转基因拟南芥获得了更强的抗旱性和抗盐性^{［参考文献 12

百度学术}12］。PrASIL1是源于树牡丹的Trihelix转录因子，主要在种子发育早期和成熟期表达，该转录因子在拟南芥的异位过表达中显著抑制总脂肪酸含量并改变其组成^{［参考文献 13

百度学术}13］。有研究表明花瓣缺失体（PTL，petal loss）是一个来自拟南芥中的Trihelix转录因子，能够抑制新生萼片的边缘生长^{［参考文献 14

百度学术}14］。目前，有关蒙古栎Trihelix转录因子家族及其家族成员的数量和功能尚不清楚。本研究利用已发表的蒙古栎基因组和生物信息学方法，对蒙古栎基因组的Trihelix转录因子家族成员的理化性质、系统进化、基因结构、顺式作用元件、种内及种间共线性、不同遮阴处理和水分胁迫下的基因表达进行分析，为进一步研究Trihelix转录因子家族成员的功能奠定一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 蒙古栎Trihelix转录因子家族鉴定及理化性质分析

由figshare（https：//figshare.com/）获得蒙古栎基因组序列（2022年Ai等^［

4］发布，包括蛋白序列文件，GFF文件和核酸序列文件）。EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/index.html）数据库下载拟南芥基因组序列（包括核酸序列文件、蛋白质序列文件、GFF文件、CDS文件）。通过对蒙古栎全基因组数据进行检索，并利用TBtools的本地检索设定阈值为1×10^-5初筛获得候选的Trihelix转录因子家族成员。通过Pfam数据库（http：//pfam.xfam.org/）确认Trihelix典型蛋白结构域序列号为PF13837，由HMM SEARCH使用参数（E≤0.001）手动筛选并使用InterPro Search（InterPro （ebi.ac.uk））进一步验证其结构域，最终确定了34条具有典型结构域Myb_DNA-bind_4的序列。利用Expasy （ExPASy-ProtParam tool）对已得到的34个QmTHs的蛋白质序列进行理化性质鉴定，并使用Cell-PLoc 2.0（Cell-PLoc 2.0 package （sjtu.edu.cn））对34个QmTHs进行亚细胞定位分析。

1.2 蒙古栎Trihelix转录因子系统进化树及聚类分析

利用MEGA 7对处理过的蒙古栎与拟南芥的Trihelix转录因子家族成员的蛋白序列文件同时进行Clustal W比对，并将比对结果导出，利用Neighbor-Joining法建立进化树，Bootstrap method设定重复值为1000，完成后将蒙古栎与拟南芥的Trihelix家族成员种间进化关系结果导出，利用Evolview2.0进行种间进化树的可视化及修饰。

1.3 蒙古栎Trihelix转录因子结构及保守基序分析

利用MEME分析结果文件，提供蛋白序列的motif结构信息，结合蒙古栎Trihelix家族成员的进化树信息和GFF文件，利用TBtools生成进化树、motif结构、基因结构三合一图像。

1.4 蒙古栎Trihelix转录因子启动子区域顺式作用元件分析

提取蒙古栎Trihelix转录因子上游1500 bp的序列，利用Plant CARE（PlantCARE， a database of plant promoters and their cis-acting regulatory elements （ugent.be））提取顺式作用元件，对生成的文件进行筛选，将相同作用的顺式作用元件归类，利用GSDS（Gene Structure Display Server 2.0 （gao-lab.org））绘图。统计不同类型顺式作用元件数量，并绘制顺式作用元件数量的柱状图。

1.5 蒙古栎Trihelix转录因子染色体定位及种内共线性分析

利用蒙古栎基因组信息，整理出34个QmTHs所在染色体的名称、长度信息，以及染色体上基因所在位置的起止信息。将配置文件利用Mapchart生成34个QmTHs的染色体定位图并进行修饰。利用TBtools One step MCScanX进行蒙古栎的种内比对，将整理好的数据导入相应配置文件并输入TBtools生成circos图。

1.6 蒙古栎Trihelix转录因子与拟南芥Trihelix转录因子之间的共线性分析

根据鉴定到的蒙古栎Trihelix转录因子的基因和染色体注释文件，利用TBtools对蒙古栎Trihelix转录因子进行共线性分析。利用同样的方法对拟南芥进行Trihelix转录因子的共线性分析，再利用TBtools进行种间共线性分析。

1.7 不同遮阴处理和水分胁迫下QmTHs的表达分析

在河北省洪崖山国有林场管理局七里亭示范场设立试验田，蒙古栎种源来自河南省三门峡市灵宝市小秦岭，选取生长健壮、无病虫害、播种繁殖的3年生蒙古栎实生苗进行遮阴处理和水分胁迫（于2021年进行），实生苗基径为18.74±3.91 mm，苗高为93.08±11.58 cm，种植密度为1 m×1 m。遮阴处理设立遮阴棚，采用三针遮阴网，随机选取3块条件相同的样地设置3组处理：GCK为无遮阴的对照组（100%照度）、GA为设一层遮阴网（40%照度）、GB为设两层遮阴网（20%照度），设置3次重复，每组10株生长一致的幼苗。水分胁迫处理于4月开展，处理为：SA为不浇水的对照组、SC为浇水2次（4、5月）、SF为浇水5次（4、5、6、7、8月），每月单次浇水量为选取试验地田间持水量的85%，水分胁迫处理期间未排除自然降水的影响，试验地选择条件一致的3块样地，每块面积75 m²（15 m×5 m），设3次重复，每组10株条件一致的幼苗。每一组样本幼苗各采取适量叶片立即液氮速冻，于超低温冰箱（-80℃）中保存备用。根据Trizol试剂盒（Invitrogen，美国卡尔斯巴德）说明书对叶片提取总RNA，用Agilent 2100生物分析仪（Agilent Technologies，美国帕洛阿托）评估RNA质量并采用浓度为1%的琼脂糖凝胶电泳检测，反转录制备cDNA文库后送至广州基迪奥生物科技有限公司（中国广州）测序。通过对转录组数据筛选得到QmTHs的差异表达并通过Excel分别对遮阴处理和水分胁迫的数据进行处理，利用TBtools绘制基因表达热图，根据热图中基因表达量变化的趋势筛选出具代表性基因进行后续分析。使用Excel将遮阴处理和水分胁迫下的QmTHs表达量取平均值并列出矩阵，使用PAleontological Statistics 4.11进行不同遮阴处理和水分胁迫下基因表达量之间的相关性分析，使用TBtools制作相关性分析热图。

2 结果与分析

2.1 蒙古栎Trihelix转录因子家族鉴定及理化性质分析

得到34条具有典型Myb_DNA-bind_4结构域的序列，分别命名为QmTH01~QmTH34。同时根据蒙古栎的基因组信息，将蒙古栎的12条染色体分别命名为Chr01~Chr12。根据序列信息进行基因ID、亚族、染色体定位、亚细胞定位、理论等电点等分析（表1）。结果显示，Trihelix转录因子的氨基酸大小、分子量及等电点差异较为明显。最短的QmTH31基因只含有189个氨基酸，其蛋白分子质量仅为21.24 kDa，最长的QmTH32则含有897个氨基酸，其蛋白分子量为99.51 kDa，二者均属于GT-1亚族。亚细胞定位结果与已报道的其他物种中的情况类似，根据预测整个Trihelix基因家族的成员基本都定位于细胞核。仅3个基因（QmTH12、QmTH24、QmTH26）定位在叶绿体上；值得注意的是，有2个基因同时定位在多个位置，QmTH10同时定位到细胞核、叶绿体、过氧化物酶体，QmTH33同时定位到细胞核、叶绿体。

表1 蒙古栎Trihelix转录因子基本信息

Table 1 Basic information of transcription factors of Quercus mongolica Trihelix

名称 Name	基因ID Gene ID	亚族 Sub- family	染色体定位 Chromosome localization			氨基酸（aa） Amino acid	蛋白分子量（kDa） Molecular weight of protein	等电点 pI	亚细胞定位 Subcellular localization
名称 Name	基因ID Gene ID	亚族 Sub- family	染色体 Chr.	起始（bp） Start	终止（bp） End	氨基酸（aa） Amino acid	蛋白分子量（kDa） Molecular weight of protein	等电点 pI	亚细胞定位 Subcellular localization
QmTH01	Qm026922.1	GTγ	Chr01	5385034	5386392	452	51.21	5.43	细胞核
QmTH02	Qm001387.1	GT-2	Chr02	26073302	26075523	549	62.17	5.73	细胞核
QmTH03	Qm001388.1	GT-2	Chr02	26087402	26090623	610	67.96	5.59	细胞核
QmTH04	Qm001389.1	GTγ	Chr02	26103813	26109275	473	54.20	6.25	细胞核
QmTH05	Qm001521.1	GT-2	Chr02	29122713	29127353	785	84.55	5.31	细胞核
QmTH06	Qm003842.1	SIP1	Chr02	81721328	81724164	388	44.79	4.58	细胞核
QmTH07	Qm011711.1	GT-2	Chr03	18083058	18085368	632	71.94	5.95	细胞核
QmTH08	Qm012253.1	SH4	Chr03	32602074	32605460	299	34.32	8.87	细胞核
QmTH09	Qm012559.1	SH4	Chr03	41804442	41807458	334	36.66	5.21	细胞核
QmTH10	Qm012796.1	GT-1	Chr03	47721110	47728842	397	45.29	6.03	叶绿体，细胞核，过氧化物酶体
QmTH11	Qm005417.1	SIP1	Chr04	14711365	14722811	326	36.22	9.76	细胞核
QmTH12	Qm006071.1	SIP1	Chr04	34189486	34194146	484	52.27	8.44	叶绿体
QmTH13	Qm006093.1	GT-2	Chr04	34895506	34897878	543	62.51	5.89	细胞核
QmTH14	Qm007917.1	SIP1	Chr05	2646400	2650896	447	48.46	9.78	细胞核
QmTH15	Qm008633.1	SIP1	Chr05	22688784	22690674	472	54.52	4.84	细胞核
QmTH16	Qm008639.1	SIP1	Chr05	22793645	22795535	472	54.60	4.84	细胞核
QmTH17	Qm009337.1	SIP1	Chr05	42322164	42323525	352	39.84	5.41	细胞核
QmTH18	Qm009926.1	SH4	Chr05	56870770	56872441	361	39.96	8.24	细胞核
QmTH19	Qm010121.1	GT-2	Chr05	61620797	61622794	392	44.40	5.16	细胞核
QmTH20	Qm026443.1	GT-2	Chr06	51482470	51484558	537	61.25	5.24	细胞核
QmTH21	Qm026455.1	GT-2	Chr06	51704735	51706822	537	61.24	5.24	细胞核
QmTH22	Qm030355.1	GT-1	Chr07	34356112	34357760	288	34.27	7.79	细胞核
QmTH23	Qm030694.1	GT-2	Chr07	40433079	40435601	568	65.10	6.19	细胞核
QmTH24	Qm030733.1	SIP1	Chr07	40986647	40993859	551	59.97	6.00	叶绿体
QmTH25	Qm030735.1	GTγ	Chr07	41022223	41034061	549	62.52	6.19	细胞核
QmTH26	Qm030744.1	SIP1	Chr07	41184480	41191801	551	59.94	6.00	叶绿体
QmTH27	Qm030746.1	GTγ	Chr07	41245054	41251014	517	59.00	5.90	细胞核
QmTH28	Qm015323.1	SIP1	Chr08	40367868	40372180	341	38.49	9.05	细胞核
QmTH29	Qm016523.1	SIP1	Chr08	64189328	64190897	259	29.72	7.63	细胞核
QmTH30	Qm021587.1	SH4	Chr10	281880	283985	328	37.28	5.41	细胞核
QmTH31	Qm021769.1	GT-1	Chr10	3926907	3928399	189	21.24	7.77	细胞核
QmTH32	Qm021818.1	GT-1	Chr10	5028427	5041222	897	99.51	8.83	细胞核
QmTH33	Qm031613.1	SIP1	Chr12	7258142	7264198	382	43.00	9.75	叶绿体，细胞核
QmTH34	Qm032461.1	SH4	Chr12	24795352	24798986	336	38.74	5.91	细胞核

2.2 蒙古栎Trihelix转录因子系统进化树及聚类分析

将蒙古栎和拟南芥构建种间系统进化树进行Trihelix转录因子的进化关系研究（图1）。结果显示，在Trihelix转录因子进化树中，34个蒙古栎Trihelix基因和29个拟南芥Trihelix基因呈现明显的聚类现象。蒙古栎的34个Trihelix基因分布在5个亚族中，最大的亚族是SIP1，包含12个蒙古栎基因、10个拟南芥基因；GT-2亚族包含9个蒙古栎基因、7个拟南芥基因；SH4包含5个蒙古栎基因、4个拟南芥基因；GT-1包含4个蒙古栎基因、5个拟南芥基因；最小的亚族是GTγ，仅包含4个蒙古栎基因、3个拟南芥基因。根据进化树结果显示，与其他3个亚族相比，GT-1和GT-2的相似性更强一些，但其内部的氨基酸序列迥异导致了两个亚族的基因功能也不尽相同，这与Kaplan-Levy等^［

15］的研究结果一致。

图1 蒙古栎与拟南芥的Trihelix家族成员种间系统进化树分析

Fig.1 Phylogenetic tree analysis of the Trihelix family members of Quercus mongolica and Arabidopsis Thaliana

2.3 蒙古栎Trihelix转录因子结构及保守基序分析

根据基因结构分析结果显示（图2），蒙古栎中各亚族成员均包含内含子。选择10个保守基序进行分析，34个QmTHs均含有Motif1；其中GT-2亚族均含有Motif1、Motif2、Motif4、Motif6、Motif7；GT-1亚族除了QmTH22含有Motif4，其余成员只含有Motif1、Motif2、Motif6、Motif7；结合进化树的结果分析，这印证了向小雪等^［

16］关于GT-1和GT-2亚族的同源性相较于其他亚族最为相近的研究。SIP1亚族中，QmTH26、QmTH24 与QmTH12在一个分支，QmTH16、QmTH15与QmTH06在一个分支，QmTH28与QmTH14在一个得分较高的分支；GTγ亚族中，QmTH25与QmTH27、QmTH04与QmTH01这些基因之间具有极高的同源性，相互之间结构近似。SH4亚族中，QmTH08与QmTH18、QmTH30与QmTH09，这些基因之间具有极高的同源性，相互之间结构近似。因此推测上述基因之间存在功能相近的可能性。

图2 蒙古栎Trihelix转录因子家族系统进化树、保守基序和基因结构

Fig.2 Phylogenetic tree of transcription factor family of Quercus mongolica Trihelix，conserved motif and gene structure

2.4 蒙古栎Trihelix转录因子启动子区域顺式作用元件分析

根据结果分析（图3），蒙古栎Trihelix转录因子上游存在光响应顺式元件（包括I-box、G-box、TCT-motif等24种）、防御和逆境响应顺式元件（TC-rich repeats）、低温响应顺式元件（LTR）、生长素响应顺

图3 蒙古栎Trihelix转录因子启动子顺式作用元件分析

Fig.3 Analysis of cis-acting elements of transcription factor promoter of Quercus mongolica Trihelix

式元件（包括TGA-element、AuxRR-core、TGA-box）、厌氧诱导顺式元件（ARE）、水杨酸响应顺式元件（TCA-element）、脱落酸响应顺式元件（ABRE）、干旱诱导顺式元件（MBS）、茉莉酸甲酯响应顺式元件（TGACG-motif、CGTCA-motif）、分生组织表达顺式元件（CAT-box）、赤霉素响应顺式元件（P-box、GARE-motif、TATC-box）、伤口反应顺式元件（WUN-motif）、参与栅栏组织叶肉细胞分化的顺式元件（HD-Zip1）、缺氧特异性诱导相关增强子顺式元件（GC-motif）。启动子区域顺式作用元件数量（图4）分析表明，除QmTH11外，其余33个QmTHs均含有与光响应相关的顺式作用元件，总数为第一（288个）；总数分列第二和第三的是茉莉酸甲酯响应顺式作用元件（74个）和脱落酸响应顺式作用元件（57个）。数量最少的是伤口反应顺式元件（1个）和参与栅栏组织叶肉细胞分化的顺式元件（1个），分别位于QmTH19和QmTH27。有24个蒙古栎Trihelix基因含有与厌氧诱导相关的顺式作用元件，占顺式作用元件总数的70.6%；有13个蒙古栎Trihelix基因含有与干旱响应相关的顺式作用元件，占顺式作用元件总数的38.2%。同时，还鉴定到两种介导种子成熟过程的顺式作用元件，分别是GCN4 motif（核心序列为TGAGTCCA）和RY-element（核心序列为CATGCATG）。

图4 蒙古栎Trihelix转录因子启动子顺式作用元件数量

Fig.4 Number of cis-acting elements in the transcription factor promoter of Quercus mongolica Trihelix

2.5 蒙古栎Trihelix转录因子染色体定位及种内共线性分析

本研究利用MapChart软件绘制了34个QmTHs在染色体上的位置，结果显示，34个QmTHs分布在蒙古栎的12条染色体中的10条上，其中Chr09、Chr11两条染色体没有分布（图5）。分布数量最少的染色体是Chr01，仅有1个基因（QmTH01）。分布数量最多的是Chr05和Chr07，各有6个基因。Trihelix家族成员中存在基因的串联重复事件，共3对，分别为QmTH15/QmTH16、QmTH20/QmTH21和QmTH24/QmTH26，分别在Chr05、Chr06、Chr07三条染色体的一端形成串联重复序列，形成基因簇。这3对串联重复基因分属于2个基因亚族，其中QmTH15/ QmTH16和QmTH24 /QmTH26属于SIP1亚家族，QmTH20/QmTH21属于GT-2亚家族。同时，使用TBtools软件，对蒙古栎Trihelix转录因子进行共线性分析（图6），其中共线性基因对仅有4对，推测部分蒙古栎Trihelix家族的成员可能由基因复制事件产生。

图5 蒙古栎Trihelix转录因子的染色体定位

Fig.5 Chromosome localization of transcription factors of Quercus mongolica Trihelix

图6 蒙古栎Trihelix转录因子的共线性分析

Fig.6 Collinearity analysis of transcription factors of Quercus mongolica Trihelix

图中的灰色线为蒙古栎染色体上基因间的共线性关系，红色线是蒙古栎Trihelix基因家族成员间的共线性关系，蓝色线是蒙古栎Trihelix基因家族的串联重复基因

The gray line in the figure is the collinear relationship between genes on the chromosomes of Quercus mongolica， and the red line is the collinear relationship between members of the Trihelix gene family of Quercus mongolica， The blue line is a tandem repeating gene in the Trihelix gene family of Quercus mongolica

2.6 蒙古栎Trihelix转录因子与拟南芥Trihelix转录因子之间的共线性分析

利用TBtools软件对模式植物拟南芥和蒙古栎进行种间的Trihelix转录因子共线性分析，结果显示（图7），蒙古栎与拟南芥之间共有共线性基因对18个，除未有蒙古栎Trihelix基因分布的Chr09、Chr11外，Chr01、Chr06也未发现与拟南芥存在共线性基因。

图7 蒙古栎与拟南芥的种间Trihelix转录因子共线性分析

Fig.7 Collinearity analysis of interspecific Trihelix transcription factors of Quercus mongolica and Arabidopsis Thaliana

Qm_Chr1~Qm_Chr12代表蒙古栎的12条染色体，Ath_1~Ath_5代表拟南芥的5条染色体，Ath_Pt代表拟南芥叶绿体基因组，Ath_Mt代表拟南芥线粒体基因组

Qm_Chr1-Qm_Chr12 represents 12 chromosomes of Quercus mongolica， Ath_1-Ath_5 represents 5 chromosomes of Arabidopsis thaliana， Ath_Pt represents chloroplast genome of Arabidopsis thaliana， Ath_Mt represents mitochondrial genome of Arabidopsis thaliana

2.7 不同遮阴处理和水分胁迫下QmTHs的表达分析及相关性分析

2.7.1 遮阴处理下QmTHs的表达模式及相关性分析

由图8可知，正常光照条件下（GCK），QmTH01、QmTH06、QmTH14、QmTH19、QmTH20、QmTH21、QmTH22、QmTH24、QmTH25、QmTH27、QmTH33共11个基因表达量较高，根据启动子顺式作用元件的分析结果发现，在QmTH01、QmTH14、QmTH22 、QmTH24、QmTH33的启动子区域同时存在光响应和脱落酸响应相关的顺式作用元件，且QmTH24启动子区域含有干旱诱导响应元件；而随光照强度减弱，该11个基因的表达逐渐呈现下调，推测这些基因的功能可能与蒙古栎幼苗在高光强下的光响应生理相关联；同时，有一个特殊的基因QmTH11，在3组处理中因其基因表达不具规律性，推测其与蒙古栎的光响应生理没有联系，符合未在其启动子区域鉴定到与光响应相关顺式元件的结果。

图8 蒙古栎Trihelix转录因子在不同遮阴处理下的表达分析

Fig.8 Expression analysis of transcription factors of Quercus mongolica Trihelix under different shading treatments

GCK：全光照；GA：一层遮阴网（40%照度）；GB：两层遮阴网（20%照度）； 1， 2， 3为3次生物学重复，下同

GCK： Full light； GA： A shade net （40% illumination）； GB： Two layers of shading net （20% illumination）； 1， 2， 3 is three biological repeats， the same as below

QmTH02、QmTH03、QmTH04、QmTH05、QmTH07、QmTH09、QmTH10、QmTH12、QmTH13、QmTH15、QmTH16、QmTH17、QmTH26、QmTH28、QmTH29、QmTH30、QmTH31、QmTH34共18个基因的表达量随光照强度减弱呈现了显著的上调趋势，因此推测这些基因的功能均与蒙古栎在弱光照条件下的光响应生理密切相关，这与前面11个基因的鉴定结果互补，且这29个Trihelix基因的启动子区域均预测到了大量的光响应元件，进一步印证了Trihelix转录因子家族成员普遍参与调控植物的光响应生理。

由相关性分析结果（图9）可知，在高光强下介导蒙古栎光响应生理的11个Trihelix基因表达量之间具有显著的正相关性，表明该11个基因在高光强下共同上调表达；另18个弱光照条件下介导光响应生理的蒙古栎Trihelix基因，除QmTH31外，其余17个蒙古栎Trihelix基因表达量之间同样具有显著的正相关性，表明该17个基因在弱光照环境中共同上调表达。介导高光强和弱光照环境中蒙古栎生长发育的Trihelix基因表达量之间具有显著的负相关性，证明了两组蒙古栎Trihelix基因的功能具有显著的差异。

图9 遮阴处理下蒙古栎Trihelix转录因子表达量的相关性分析

Fig.9 Correlation analysis of transcription factor expression levels of Quercus mongolica Trihelix under shading

2.7.2 水分胁迫下QmTHs的表达模式及相关性分析

由图10的结果分析可知，QmTH06、QmTH17、QmTH19、QmTH24、QmTH25、QmTH27、QmTH30、QmTH33等基因的表达量在SF（浇水5次）处理下较SA（对照组）和SC（浇水2次）处理出现了显著的上调趋势，仅在QmTH06、QmTH17、QmTH24的启动子区域鉴定到了厌氧诱导和缺氧特异性诱导相关的增强子元件，推测QmTH06、QmTH17、QmTH24均介导蒙古栎在水分胁迫下的生理机制。而QmTH02、QmTH07、QmTH23、QmTH32 四个基因仅在SA处理下显著响应，且这4个基因的启动子区域均预测到了与脱落酸响应相关的顺式元件，由于试验田环境区别于蒙古栎幼苗自然生长环境，因此推测该4个基因介导蒙古栎在土壤含水较低环境中的生理机制。另外，发现了QmTH05、QmTH09、QmTH026三个基因仅在SC处理下显著响应，并在其启动子区域预测到了生长素响应相关的顺式作用元件。其余蒙古栎Trihelix家族成员表达量变化不具规律性。根据相关性分析结果（图11）可知，QmTH06、QmTH17、QmTH24基因的表达量之间均具有显著的正相关性，推测该3个基因共同介导蒙古栎在水分胁迫下的生理机制；QmTH02、QmTH07、QmTH23、QmTH32基因，其表达量之间具有显著的正相关性，表明这4个基因共同介导蒙古栎幼苗在低土壤含水量环境中的生长发育。且QmTH06、QmTH17、QmTH24的表达量与QmTH02、QmTH07、QmTH23、QmTH32的表达量之间均呈现负相关，表明两组基因之间功能具有显著的差异性。

图10 蒙古栎Trihelix转录因子在水分胁迫下的表达分析

Fig.10 Expression analysis of transcription factors of Quercus mongolica Trihelix under water stress

SA：不浇水；SC：浇水2次（4、5月）；SF：浇水5次（4、5、6、7、8月）

SA：No watering； SC： Water twice （ April and May）； SF： Water 5 times （April， May， June， July， August）

图11 水分胁迫下蒙古栎Trihelix转录因子表达量的相关性分析

Fig.11 Correlation analysis of transcription factor expression of Quercus mongolica Trihelix under water stress

3 讨论

Trihelix转录因子因其结合光响应的GT元件和特有的三螺旋结构而受到重视，对调控植物响应干旱、低温和盐碱等非生物胁迫具有重要作用^［

17-18］。因此，本研究对鉴定到的蒙古栎的34个Trihelix基因的理化性质进行了分析，其中序列长度、氨基酸数量、相对分子量存在较大的差异，这导致了不同成员之间的基因结构以及保守基序的差异性，由此导致了不同Trihelix转录因子之间的功能的多样化，与梨Trihelix转录因子家族成员之间存在功能差异性的研究结果一致^{［参考文献 19

百度学术}19］。根据系统进化树分析，34个QmTHs被分为5个亚族，根据对其不同亚族进行的分析结果发现，即使具有较高同源性的亚族，其功能也存在着巨大的差异，如相对同源性最近的GT-1和GT-2；此结论与Trihelix转录因子同源关系相近的亚族间功能迥异的研究相符合^{［参考文献 16

百度学术}16，20］。

分布在植物Trihelix转录因子启动子区域的不同类型顺式作用元件调控相应的响应非生物胁迫功能基因表达^［

21］。Li等^{［参考文献 22

百度学术}22］在高粱基因组中鉴定到40个属于Trihelix基因家族的基因，简称SbTH，并对其中14个SbTH成员进行qPCR鉴定，其中12个SbTH基因在非生物胁迫中显著上调。卢世雄^{［参考文献 23

百度学术}23］在VvTH的顺式作用元件分析中发现VvTH启动子区域含有脱落酸诱导、茉莉酸甲酯诱导、干旱响应等响应逆境胁迫相关元件，且qPCR结果中鉴定到VvTrihelix5、VvTrihelix6、VvTrihelix7三个成员在200 mmol/L NaCl胁迫下显著上调（为对照的7.3、15.4、7.2倍）。Tong等^{［参考文献 24

百度学术}24］在铁皮石斛中鉴定到32个属于Trihelix基因家族的基因，简称DoGT，其中10个DoGT成员在低温胁迫下被诱导并显著上调表达，这些基因的启动子区域均具有与响应胁迫相关的MYB元件。另外，本研究在蒙古栎Trihelix转录因子家族成员启动子中发现大量与光响应有关的顺式元件（G-box等），表明蒙古栎Trihelix转录因子家族普遍参与光响应调节，这与Trihelix转录因子在其他植物中与光响应调节密切相关的研究符合^{［参考文献 25-27}25-27］。同时，在其启动子区域同样鉴定到大量干旱诱导、脱落酸响应、低温响应和水杨酸响应等相关顺式作用元件，表明蒙古栎Trihelix转录因子可介导不同非生物胁迫下的响应机制，这符合其他物种中Trihelix转录因子的功能研究^{［参考文献 28-30}28-30］。

蒙古栎幼苗对光照强度变化尤为敏感，遮阴是影响蒙古栎幼苗生长发育以及光合作用的重要因子，适当的遮阴处理可以促进蒙古栎幼苗叶片的生长发育，反之，高光强下蒙古栎幼苗表现出显著的光抑制，主要体现在最大净光合速率的下降^［

7，31］。然而，高光强有利于根系的形成^{［参考文献 32

百度学术}32］，在许中旗等^{［参考文献 33

百度学术}33］的研究中发现，高光强下蒙古栎幼苗的根冠比显著高于低光强下生长的蒙古栎幼苗。种子植物的气孔活动通常受内源性脱落酸和光照强度的变化诱导，在高光强下，植物通过气孔活动的调节来降低蒸腾作用并维持自身的正常生理生化过程^{［参考文献 34

百度学术}34］。11个受高光强诱导的蒙古栎Trihelix基因中，QmTH01、QmTH14、QmTH22 、QmTH24、QmTH33启动子区域同时鉴定到光响应和脱落酸响应相关的顺式作用元件，其中QmTH24启动子区域含有干旱诱导响应元件，表明这5个基因均介导高光强下蒙古栎的光适应生理。在18个弱光照条件下表达上调的蒙古栎Trihelix基因中，鉴定到多个家族成员启动子区域兼具光响应和生长素响应元件，在GA（40%照度）、GB（20%照度）处理的表达分析中观测到QmTH05、QmTH09、QmTH23、QmTH26、QmTH29、QmTH32、QmTH34表达量较GCK（100%照度）处理呈显著上调趋势，因此推测这7个基因均参与调控弱光照条件下蒙古栎幼苗的生长发育。

此外，蒙古栎并不耐潮湿和水涝^［

35］，土壤含水量过高反而会抑制蒙古栎幼苗的正常生长发育，适当的土壤含水量则促进蒙古栎幼苗的生长。Jiang等^{［参考文献 8

百度学术}8］在蒙古栎不同栽培模式的综合生理研究中发现，相较于其他处理，2次浇水处理（4、5月浇水）促进了蒙古栎幼苗的生长。本研究鉴定到QmTH05、QmTH09、QmTH26在SC（浇水2次，4、5月）处理下的基因表达量相较SA（对照组）处理呈现显著上调，且QmTH05、QmTH09、QmTH26仅在SC处理下响应，该3个基因的启动子区域均存在生长素响应元件，推测该3个基因能够介导适宜土壤含水量下蒙古栎的生长发育。Trihelix转录因子能够显著响应水分胁迫，李彦杰等^{［参考文献 36

百度学术}36］在狗牙根（Cynodon dactylon（L.） Pers.）上发现，水淹胁迫会诱导Trihelix转录因子家族多个成员（12个）的表达水平显著上调（上调范围1.21~10.78）。在SF（浇水5次，4、5、6、7、8月）处理下，QmTH06、QmTH17、QmTH24显著上调表达，且这3个基因的启动子区域均鉴定到厌氧诱导响应元件和缺氧特异性诱导相关的增强子元件，表明QmTH06、QmTH17、QmTH24均参与调控蒙古栎响应水分胁迫。

综上所述，蒙古栎Trihelix基因在介导光响应生理中起到重要作用，同时还介导高光强下蒙古栎的光适应生理和水分胁迫下蒙古栎植株的抗逆生理。本研究基于生物信息学分析，共筛选鉴定出34个蒙古栎Trihelix基因，但是各基因在蒙古栎中的光响应、强光和水分胁迫下的具体作用机制还需进一步研究。

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