锂离子束辐照小麦诱发<bold>DNA</bold>损伤与特异基因调控网络解析

杜国锋; 谢永盾; 郭会君; 熊宏春; 古佳玉; 赵林姝; 赵世荣; 丁玉萍; 隋丽; 刘录祥; DU Guofeng; XIE Yongdun; GUO Huijun; XIONG Hongchun; GU Jiayu; ZHAO Linshu; ZHAO Shirong; DING Yuping; SUI Li; LIU Luxiang

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杜国锋 ^1,2
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隋丽 ³
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刘录祥 ²
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1. 青岛农业大学农学院，山东青岛 266109； 2. 中国农业科学院作物科学研究所 / 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程 / 国家农作物航天诱变技术改良中心，北京 100081； 3. 中国原子能科学研究院，北京 102413

最近更新：2023-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230329001

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摘要

锂（⁷Li）离子束作为一种新型诱变剂在作物诱变育种中发挥着越来越重要的作用。本研究利用彗星电泳技术探索了⁷Li离子束辐照小麦诱导的DNA损伤特点，并结合转录组分析初步解析了特异基因表达调控网络。结果表明，与传统诱变因素伽马（γ）射线相比，⁷Li离子束辐照引起的小麦幼苗生长抑制程度低，幼苗叶脉失绿至开裂。对辐照诱导的差异表达基因进行GO和KEGG功能分析显示，⁷Li离子束辐照诱导的差异表达基因主要富集在细胞壁合成与代谢和甘油脂类代谢通路，而γ射线辐照诱导的差异表达基因主要富集在光合作用代谢通路中，推测细胞壁合成与代谢和甘油脂类代谢通路途径与响应⁷Li离子束辐照引起的损伤密切相关，而光合作用代谢途径与响应γ射线辐照引起的损伤密切相关。两种辐射诱导的差异表达基因的转录因子分析结果显示，⁷Li离子束辐照诱导的MYB、WRKY、bHLH和NAC等转录因子家族可能在响应⁷Li离子束辐照过程中具有重要作用，⁷Li离子束辐照特异诱导Whirly家族转录因子调控DNA损伤修复，而γ射线辐照诱导E2F/DP家族转录因子调控DNA损伤修复。

关键词

小麦; 锂（⁷Li）离子束; 伽马射线（γ）; DNA损伤; 转录组

作物诱发突变技术是利用X射线、γ射线、航天诱变和EMS等诱变因素诱发植物遗传物质产生突变，以创制新种质、选育新品种的有效技术^［

1-2］，在小麦（Triticum aestivum L.）^{［参考文献 3

百度学术}3］、水稻（Oryza sativa L.） ^{［参考文献 4

百度学术}4］、大豆（Glycine max（L.） Merr.）^{［参考文献 5

百度学术}5］等作物上已经得到了广泛的应用，取得了重要进展，其中γ射线是应用最广泛的诱变剂。近年来，高能重离子作为新型诱变剂引起了人们的关注。重离子束属于高线性能量转移（LET，linear energy transfer）辐射^{［参考文献 6

百度学术}6］，与X、γ射线等低线性能量转移辐射相比，能将大部分能量沉积在生物体内，使生物体产生损伤，具有突变率高、相对生物学效应高、损伤不易修复等特点^{［参考文献 7-9}7-9］。重离子束辐照能产生尖锐的Bragg峰，峰值处生物体受到的损伤较强，其他区域受到的影响相对较小，即重离子束辐照区域是局部的，所以能获得更多存活率较高的突变体^{［参考文献 10

百度学术}10］。利用全基因组测序技术对γ射线和碳离子束诱变创制的水稻M₅代突变株系进行鉴定，发现碳离子比γ射线能诱发更多复杂的结构变异^{［参考文献 11

百度学术}11］。10 Gy的碳离子束辐照水稻种子后，对水稻株高、根长和鲜重有刺激作用，但高于10 Gy剂量就会显著抑制地上部分生长^{［参考文献 12

百度学术}12］。研究表明，利用25 Gy及以上剂量的⁷Li离子束辐照小麦种子后，小麦幼苗的苗高会显著降低^{［参考文献 13-14}13-14］，并出现弯曲生长^{［参考文献 15

百度学术}15］。离子束辐照还能对植物DNA造成直接和间接影响，诱导植物DNA发生单链断裂或双链断裂^{［参考文献 16

百度学术}16］。⁷Li离子束辐照能在植物DNA周围产生活性氧（ROS，reactive oxygen species），进而引起植物产生更加复杂的DNA损伤^{［参考文献 17

百度学术}17］。林敏等^{［参考文献 18

百度学术}18］研究发现，⁷Li离子束辐照后对DNA分子中的氢键能造成破坏；Stoilov等^{［参考文献 19

百度学术}19］研究结果表明，⁷Li离子束辐照会导致DNA链发生断裂。虽然已经有多项⁷Li离子束辐照诱发的DNA损伤效应研究，但DNA损伤修复的调控机制仍然不清楚。

本研究利用彗星电泳实验和转录组测序技术分析⁷Li离子束与γ射线辐照诱发小麦DNA损伤和特异基因调控网络的差异。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究选用北京市审定的小麦品种航麦501（HM501）为材料，使用⁷Li离子束辐照2021年收获的HM501的干种子，根据以前的研究结果^［

15］，选择合适的辐照剂量，分别为0、30、50和75 Gy，每个处理的种子数为200粒，进行3次生物学重复。辐照后的小麦种子放置冰箱中低温保存。同时使用γ射线辐照2021年收获的HM501的干种子，根据以前的研究结果^{［参考文献 20

百度学术}20］，选择合适的辐照剂量，分别为0、100、150和200 Gy，每个处理的种子数为200粒，进行3次生物学重复。辐照后的小麦种子放置冰箱中低温保存。其中0 Gy ⁷Li离子束和γ射线辐照的小麦种子均为未辐照种子，在后续试验中设为同一个对照组。

1.2 试验方法

1.2.1 生长条件和生物损伤的分析

将经过⁷Li离子束和γ射线辐照的HM501种子用2% NaClO浸泡10 min消毒，后用蒸馏水清洗4~5次，将消毒后的种子放置培养皿中，加入少量蒸馏水浸泡1 d至露白。将露白的种子置于网状尼龙线的金属架上，保持种子表面与水接触，放置在200~300 μmol/ m²·s光照和21 °C 的培养箱中生长7 d后，记录幼苗表型，分别测量20株幼苗的苗高和根长计算平均值，每个处理设置3次生物学重复。

1.2.2 彗星电泳实验

将生长7 d的小麦幼苗用刀片切碎后浸入5 mL新鲜制备的酶溶液中（包括1.5%（w/v）纤维素酶RS、0.75%（w/v）离析酶R10、0.6 mol/L甘露醇、10 mmol/L MES（pH＝5.5）、10 mmol/L CaCl₂、0.1% BSA、5 mmol/L β-巯基乙醇和50 mg/mL羧苄青霉素），酶解3 h制备原生质体。使用彗星测定试剂盒（Trevigen，美国）制作载玻片，用1∶10000稀释的SYBR Green I染色剂（Sigma）对载玻片进行染色后，使用荧光显微镜对小麦DNA进行拍照。使用CASP彗星分析软件（http：//www.casp.of.pl/）定量评估每个彗尾尾部DNA百分含量（Tail DNA%），每次处理分析3张图片，每张图片包含20个彗星细胞。

1.2.3 转录组测序和分析

分别取对照、⁷Li离子束和γ射线辐照的种子生长7 d后的小麦幼苗地上部分，用于RNA提取和cDNA文库构建，命名为CK、⁷Li30、⁷Li50、⁷Li75、γ100、γ150和γ200，每个样品均设3次生物学重复。RNA提取、cDNA文库的构建、文库质控和测序由北京百迈客生物技术有限公司完成。测序的原始数据经过滤得到Clean data，利用HISAT2^［

21］与小麦参考基因组 IWGSC RefSeq v2.1 （http：//www.wheatgenome.org）进行序列比对，利用StringTie^{［参考文献 22

百度学术}22］对与参考基因组对比上的读长（Read）进行组装和定量。以FPKM（Fragments Per Kilobase of transcript Per Million Fragments mapped）作为检测基因表达水平的指标。采用DEGseq2^{［参考文献 23

百度学术}23］软件分析样本间差异，以Fold Change≥2且FDR<0.01为筛选标准。

1.2.4 数据分析

使用GO（http：//www.geneontology.org/）和KEGG（http：//www.genome.jp/kegg/）对差异表达基因进行富集分析；采用K-means 聚类共表达分析和转录因子分析方法对差异表达基因进行数据分析，所有转录组数据分析均在百迈客转录组分析平台（www.biocloud.net）完成。

1.2.5 差异表达基因的RT-qPCR验证

随机选取8个差异表达基因进行荧光定量PCR（RT-qPCR）验证，检验RNA-seq数据的可靠性，引物序列见表1。使用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix反转录试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，中国北京）合成cDNA。用Green qPCR SuperMix荧光定量试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，中国北京）进行RT-qPCR实验。本研究选择Actin作为内参基因进行表达量归一化处理。采用2^-ΔΔCT法计算相对表达量。

表1 荧光定量PCR引物序列

Table 1 Primer of RT-qPCR

引物名称 Primer name	正向引物（5′-3′） Forward primer（5′-3′）	反向引物（5′-3′） Reverse primer（5′-3′）
TraesCS1A03G0253000	GGGCACTGGGCTAGAGACTGC	CTGATTGCATTTGCTGCACAGG
TraesCS4D03G0025500	ATCACGCCGCAGTGCCCCAA	CAGTTGTTGGCCGCCGACCCG
TraesCS4A03G0749800	ATCACGCCGCAGTGCCCCAG	GCAGTTGTTGGCCGCCGACCCT
TraesCS2B03G0698400	GTTGCTATTAAACCTCTGGAG	GATCTGAATTTTGTCACCCA
TraesCS2A03G0395300	AGTTCCAGTTCCAGTACTCG	TGTAGAGGTGCTGTGGCACG
TraesCS2B03G0852800	TCTGAGGAGCTGCTCGAACGT	ACAGCAGCTATATGGTCCGA
TraesCS2D03G1091000	ACATGTCGCACGAGCTCGAG	GCGCTCTCTTGCTCCTGCGCTG
TraesCS2B03G0179300	TGATCCGCTCCAAGTGGGTA	TGAAGCTGACGCATTGCACT
Actin	ATGGAAGCTGCTGGAATCCAT	CCTTGCTCATACGGTCAGCAATAC

2 结果与分析

2.1 ⁷Li离子束与γ射线辐照对苗高和根长的抑制作用

幼苗生长7 d后，⁷Li离子束辐照的幼苗在不同剂量下均出现叶脉失绿至开裂，且出现部分卷叶（图1A），但30 Gy和50 Gy辐照后的小麦的苗高没有显著变化，根长分别下降了11.41%和9.02%，75 Gy辐照后的小麦苗高和根长分别下降了10.14%和26.42%（图1B）。γ射线辐照的HM501幼苗出现了显著的生长抑制效应（图1A），与对照相比，100 Gy辐照后的小麦苗高和根长分别下降了34.06%和37.20%，150 Gy辐照后的小麦苗高和根长分别下降了76.81%和74.61%，200 Gy辐照后的小麦苗高和根长分别下降了89.23%和86.74%（图1B）。结果表明，⁷Li离子束辐照后对小麦幼苗的生长抑制效应较γ射线低。

图1 ⁷Li离子束与γ射线辐照后小麦幼苗的损伤效应

Fig.1 The damage effects of ⁷Li ion beam and γ ray on wheat seedlings

A：⁷Li离子束与γ射线辐照后的小麦种子生长7 d后的幼苗照片；B：⁷Li离子束与γ射线辐照后的小麦种子生长7 d后幼苗苗高和根长；CK为对照，⁷Li30、⁷Li50和⁷Li75分别为30、50和75 Gy ⁷Li离子束辐照后的小麦材料，γ100、γ150和γ200分别为100、150和200 Gy γ射线辐照后的小麦材料，下同；不同小写字母表示在不同处理间在P＜0.05水平差异显著，下同

A： The seedling photographs of 7-day-seedlings germinatedfrom ⁷Li ion beam and γ rayirradiated wheat seeds； B： The seedling height and root length of 7-day-seedlings germinated from ⁷Li ion beam and γ rayirradiated wheat seeds；CK was the control， ⁷Li30， ⁷Li50 and ⁷Li75 were wheat materials irradiated by 30， 50 and 75 Gy ⁷Li ion beams， respectively， γ100， γ150 and γ200 were wheat materials irradiated by 100， 150 and 200 Gy γ rays， respectively， the same as below； Different lowercase letters indicate significant differences between different treatment at P＜0.05 level， the same as below

2.2 ⁷Li离子束与γ射线辐照诱导的DNA损伤

彗星电泳结果显示，不同剂量的⁷Li离子束和γ射线照射后，小麦的DNA均发生了不同程度的损伤（图2）。为了阐明两种辐照诱发的小麦DNA损伤程度，对尾部DNA百分含量进行分析（图3）。⁷Li离子束辐照后，尾部DNA百分含量随着剂量增加而显著上升，均值从3.17%（对照组）上升到26.39%（50 Gy辐照），75 Gy ⁷Li离子束辐照引起的尾部DNA百分含量与50 Gy⁷Li离子束辐照维持在相似水平（图3）。γ射线辐照后，尾部DNA百分含量随剂量增加而显著上升，均值从3.17%（对照组）升至36.95%（150 Gy辐照），200 Gy γ射线辐照引起的尾部DNA百分含量与150 Gy γ射线辐照维持在相似水平（图3）。

图2 不同剂量⁷Li离子束与γ射线辐照后小麦幼苗细胞核彗星电泳实验图片

Fig.2 Comet assay images of nuclei of wheat seedling from different doses of ⁷Li ion beam and γ rayirradiated seed

图 3 ⁷Li离子束与γ射线辐照后小麦幼苗DNA的彗星电泳分析结果

Fig.3 Results of the comet assay analysis on wheat seedling from ⁷Li ion beam and γ ray irradiated seed

2.3 ⁷Li离子束与γ射线辐照诱导的差异表达基因分析

为了解析⁷Li离子束与γ射线辐照的分子特征和响应机制的异同，对辐照后的幼苗进行了转录组数据分析。测序数据经过质量控制后，共获得230.13 Gb 的Clean data，各样品Clean data均达到10.96 Gb，Q30碱基百分比在94.21%以上。将Clean reads与参考基因组序列进行对比，各样品的比对效率在92.64%~95.44%，生物学重复相关性均在0.821以上（图4），表明本研究的转录组测序质量和样品重复性良好。以Fold Change≥2且FDR<0.01为筛选标准，鉴定不同样品间的差异表达基因。如图5所示，与对照相比，30 Gy、50 Gy和75 Gy ⁷Li离子束辐照后，分别鉴定出8819、6436和2502个差异表达基因，其中包含632个共同的差异表达基因（图5B）；100 Gy、150 Gy和200 Gy γ射线辐照后，分别鉴定出9819、25215和26795个差异表达基因，其中包含6684个共同的差异表达基因（图5C）。共有272个差异表达基因受两种辐照共同诱导（图5D）。

图4 样品间表达量相关性热图

Fig.4 Correlation heatmap between samples

1、2、3表示不同处理的3次生物学重复

1， 2， 3 are three biological replicates in different treatments

图5 ⁷Li离子束与γ射线辐照后诱导的差异表达基因

Fig.5 Summary of the DEGs under ⁷Li ion beam and γ ray irradiation treatment

A：⁷Li离子束与γ射线辐照后诱导的上调和下调差异表达基因的数量；B：不同剂量的⁷Li离子束辐照后诱导的差异表达基因的韦恩图； C：不同剂量的γ射线辐照后诱导的差异表达基因的韦恩图； D：⁷Li离子束与γ射线辐照后诱导的差异表达基因的韦恩图；韦恩图中数字代表不同比较组中差异表达基因的个数，重叠部分中的数字代表不同比较组中共同差异表达基因的个数

A： A summary of the numbers of up- and down-regulated DEGs under ⁷Li ion beam and γ ray irradiation treatment； B： Venn map of differentially expressed genes under different doses of ⁷Li ion beam irradiation treatment； C： Venn map of differentially expressed genes under different doses of γ ray irradiation treatment； D： Venn map of differentially expressed genes between ⁷Li ion beam and γ ray irradiation treatment； The numbers in the Venn map represent the number of differentially expressed genes in different comparison groups， and the numbers in the overlapping part represent the number of common differentially expressed genes in different comparison groups

2.4 差异表达基因功能分析

为了进一步解析差异表达基因的功能，进行了GO和KEGG富集分析。GO分析结果显示，⁷Li离子束和γ射线分别富集注释出64和333个条目。⁷Li离子束和γ射线辐照后，GO富集的前20个条目具有显著差异（图6）。⁷Li离子束辐射诱导的生物过程（BP，biological process）相关的差异表达基因富集较为显著的3个GO条目分别是纤维素生物合成过程（Cellulose biosynthetic process）、细胞壁组织（Cell wall organization）和细胞壁大分子分解代谢过程（Cell wall macromolecule catabolic process）；细胞组分（CC，cellular component）相关的差异表达基因富集较为显著的GO条目是核糖体（Ribosome）；分子功能（MF，molecular function）相关的差异表达基因富集较为显著的3个GO条目分别是转录因子活性（Transcription factor activity）、序列特异性DNA结合（Sequence-specific DNA binding）和纤维素合成酶（UDP形成）活性（Cellulose synthase （UDP-forming） activity）（图6A）。γ射线辐射诱导的生物过程相关的差异表达基因富集较为显著的3个GO条目分别是碳水化合物代谢过程（Carbohydrate metabolic process）、光系统Ⅰ中的光捕获（Photosynthesis， light harvesting in photosystem I）和光合系统的光捕获（Photosynthesis， light harvesting）；细胞组分相关的差异表达基因富集较为显著的3个GO条目分别是光系统I反应中心（Photosystem I reaction center）、光系统I（Photosystem I）和质体球（Plastoglobule）；分子功能相关的差异表达基因富集较为显著的3个GO条目分别是：蛋白质二硫化物氧化还原酶活性（Protein disulfide oxidoreductase activity）、氧化还原酶（Oxidoreductase activity）和钙离子结合（Calcium ion binding）（图6B）。

图6 差异表达基因的GO富集

Fig.6 GO enrichment analysis of the DEGs

A：⁷Li离子束辐照后的差异表达基因 GO分析；B：γ射线辐照后的差异表达基因 GO分析；图中数字代表该GO条目中差异表达基因个数

A： GO enrichment analysis of the DEGs under ⁷Li ion beam irradiation treatment； B： GO enrichment of the DEGs under γ ray irradiation treatment； The numbers in the figure represent the number of DEGs in this term

KEGG通路富集结果表明，⁷Li离子束和γ射线辐照后，分别诱导5条和26条信号通路，均涉及淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）通路（图7）。⁷Li离子束辐照后，特异诱导甘油脂类代谢（Glycerolipid metabolism）、氨基糖和核苷酸糖代谢（Amino sugar and nucleotide sugar metabolism）、柠檬烯和蒎烯降解（Limonene and pinene degradation）和植物-病原菌互作（Plant-pathogen interaction）4条通路（图7A）。γ射线辐照后，特异诱导光合作用-天线蛋白（Photosynthesis- antenna proteins）、光合生物碳固定（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、丙氨酸、天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine， aspartate and glutamate metabolism）、维生素B6代谢（Vitamin B6 metabolism）、硫代谢（Sulfur metabolism）和磷脂酰肌醇信号系统（Phosphatidylinositol signaling system）等25条通路（图7B）。结果表明，⁷Li离子束和γ射线辐照诱导的基因表达网络具有显著差异。

图7 差异表达基因的KEGG富集

Fig.7 KEGG enrichment analysis of the DEGs

A：⁷Li离子束辐照后的差异表达基因 KEGG分析；B：γ射线辐照后的差异表达基因 KEGG分析

A： KEGG enrichment analysis of the DEGs under⁷Li ion beam irradiation treatment； B： KEGG enrichment analysis of the DEGs under γ ray irradiation treatment

2.5 ⁷Li离子束与γ射线辐照诱导的基因表达模式差异

将⁷Li离子束与γ射线辐照诱导的差异表达基因进行K-means 聚类共表达分析（图8A），结果表明，可以将其中7044个基因分类为6种聚类模式。与对照组相比，聚类模式C1、C2和C6中的基因在⁷Li离子束辐照后表达水平与对照相当或略有降低，而γ射线辐照后表达量显著下调；聚类模式C4和C5中的基因在⁷Li离子束辐照后的表达水平与对照相当或略有升高，而γ射线辐照后表达量显著上调；聚类模式C3中的基因在⁷Li离子束和γ射线辐照后表达量都低于对照组，且两种辐照后的表达水平相似（图8A）。

图8 ⁷Li离子束与γ射线诱导的差异表达基因的聚类分析

Fig.8 Clustering analysis of DEGs under ⁷Li ion beam and γ rayirradiation treatment

A：差异表达基因的6个聚类（C1 ~ C6），名称后数字代表该聚类包含差异表达基因数目；B：不同聚类的差异表达基因的KEGG富集通路

A： The six clusters （C1 to C6） for DEGs， the number after the name represents the number of differentially expressed genes in the cluster；B： Enrichment pathways of the DEGs in different clusters， referring to the KEGG database

将上述6个聚类模式包含的基因进行KEGG分析，结果表明，聚类模式C1、C2和C6包含的基因主要涉及淀粉和蔗糖代谢（Starch and sucrose metabolism）、昼夜节律-植物（Circadian rhythm-plant）、光合生物固碳（Carbon fixation in photosynthetic organisms）、磷脂酰肌醇信号系统（Phosphatidylinositol signaling system）、光合作用-天线蛋白（Photosynthesis - antenna proteins）和光合作用（Photosynthesis）等通路。聚类模式C4和C5包含的基因则主要涉及二萜生物合成（Diterpenoid biosynthesis）、丙氨酸，天冬氨酸和谷氨酸代谢（Alanine， aspartate and glutamate metabolism）、糖酵解/糖异生（Glycolysis/Gluconeogenesis）、ABC转运蛋白（ABC transporters）和过氧化物酶体（Peroxisome）等通路。而聚类模式C3包含的基因主要涉及昼夜节律-植物（Circadian rhythm - plant）、甘油磷脂代谢（Glycerophospholipid metabolism）、植物病原相互作用（Plant-pathogen interaction）、植物激素信号转导（Plant hormone signal transduction）、MAPK信号通路-植物（MAPK signaling pathway-plant）（图8B）。结果表明，在光合作用相关途径中，⁷Li离子束辐照对小麦幼苗的抑制作用较γ射线低。

2.6 ⁷Li离子束与γ射线辐照诱导的差异转录因子分析

⁷Li离子束辐照诱导15个转录因子（TF）家族中的48个TF编码基因，γ射线辐照诱导39个TF家族中的392个TF编码基因（图9A）。两种辐照条件均能诱导10个TF家族中的30个TF编码基因，包括NAC（3个）、WRKY（9个）、bHLH（2个）、GRAS（4个）、RAV（2个）、ERF（5个）、C2H2（2个）、MYB （1个）、bZIP （1个）和C3H （1个）。其中，除1个NAC家族TF编码基因、1个GRAS家族TF编码基因和2个RAV 家族TF编码基因在⁷Li离子束和γ射线辐照后表达水平上调外，其他TF编码基因都在⁷Li离子束和γ射线辐照后表达水平下调（图9B）。⁷Li离子束辐照特异诱导的Whirly TF家族中的2个基因，主要功能为DNA损伤修复^［

24］。γ射线辐照特异诱导Dof（14个）、G2-like（14个）、FAR1（11个）、GATA（7个）、LBD（7个）、ARF（6个）、HD-ZIP（5个）、NF-YB（5个）和E2F/DP（1个）等24个TF家族中的108个基因，其中E2F/DP家族的基因功能主要为DNA损伤修复^{［参考文献 25

百度学术}25］（图9A）。结果表明，⁷Li离子束能特异诱导Whirly转录因子调控DNA损伤修复。

图9 ⁷Li离子束和γ射线诱导的差异表达基因中TF编码基因的分布

Fig.9 Distributions of TF genes among the ⁷Li ion and γ ray beam irradiation induced DEGs

A：⁷Li离子束和γ射线诱导的差异表达基因中TF编码基因的数量和分类；B：共同诱导的TF编码基因的表达量热图

A： Number and classification of TF genes among the ⁷Li ion and γ ray beam irradiation induced DEGs； B： Heat map constructed based on log₂ （fold change） of common TFs

2.7 差异表达基因验证

为了验证转录组数据的可靠性，随机选取RNA-seq结果中8个具有不同表达水平基因进行RT-qPCR的验证。结果表明，RNA-seq与RT-qPCR基因表达趋势一致（图10），证明了转录组数据的可靠性。

图10 转录组测序数据的RT-qPCR验证

Fig.10 RNA sequencing data accuracy was verified by RT-qPCR

3 讨论

高能重离子束与传统诱变剂γ射线辐照诱导具有不同的突变谱^［

17］。利用⁴He、¹²C、⁴⁰Ar等重离子束对植物进行辐照研究发现，重离子辐照植物能产生显著的生物效应^{［参考文献 26

百度学术}26］。近年来，⁷Li离子束作为一种新型诱变剂进行诱变效应研究发现，其对植物生长发育有抑制效应^{［参考文献 14

百度学术}14］。本研究结果显示，⁷Li离子束辐照后，小麦幼苗叶片呈现叶脉失绿至开裂，出现卷叶，仅在75 Gy出现抑制效应。然而，γ射线辐照小麦后幼苗的苗高和根长均受到显著抑制，且随着辐射剂量增加抑制越显著。结果表明，⁷Li离子束辐照对小麦幼苗生长的抑制效应程度比γ射线低，但幼苗均出现叶脉失绿至开裂。⁷Li离子束作为新型诱变剂可能诱发与γ射线不同的突变效应。

电离辐射可以直接和间接影响植物细胞活性^［

27］，通过植物细胞内水分解产生活性氧攻击DNA ^{［参考文献 28

百度学术}28］，导致DNA损伤^{［参考文献 29

百度学术}29］。DNA损伤可以影响M₁代幼苗的生长发育，甚至诱发死亡或不育现象，同时也是使遗传物质产生突变的关键因素^{［参考文献 30

百度学术}30］。本研究表明，⁷Li离子束与γ射线辐照均对小麦DNA造成了显著损伤，但⁷Li离子束辐照造成的损伤程度比γ射线低。然而，Yuichiro等^{［参考文献 31

百度学术}31］研究发现，碳离子束辐照烟草细胞后，造成的DNA损伤程度比γ射线更大。结果说明，DNA损伤程度可能与离子束种类相关。

近年来，转录组数据分析成为解析植物响应胁迫的基因调控网络的有效方法^［

32］。通过转录组数据分析表明，⁷Li离子束辐照诱导的差异表达基因数量远少于γ射线。差异表达基因的GO分析结果表明，⁷Li离子束辐照后，差异表达基因显著富集在细胞壁等生物大分子的分解与合成，如纤维素生物合成过程、细胞壁组织、细胞壁大分子分解代谢过程和纤维素合成酶（UDP形成）活性等。细胞壁是组成植物细胞的重要部分，对植物的器官发育和形态建成等方面起作用^{［参考文献 33

百度学术}33］。Zhang等^{［参考文献 34

百度学术}34］发现细胞壁细胞发育不良会导致水稻叶片卷曲，说明⁷Li离子束辐照可能调控小麦细胞壁的合成和分解，以此使小麦应对⁷Li离子束引起的损伤，并使小麦幼苗叶脉失绿至开裂，导致叶片卷曲。γ射线辐照后，差异表达基因显著富集在光合作用代谢过程，如碳水化合物代谢过程、光合系统的光捕获和光系统I反应中心等。光合作用是植物响应外界环境变化的重要途经之一，也是绿色植物的基本物质和能量的来源^{［参考文献 35

百度学术}35］，只有进行光合作用植物才能生长发育^{［参考文献 36-37}36-37］。说明γ射线辐照可能影响小麦的光合作用代谢，并以此抑制小麦的苗高和根长，这与小麦幼苗形态学差异一致。KEGG分析结果表明， ⁷Li离子束辐照诱导的差异表达基因显著富集在甘油脂类代谢等通路。甘油脂质作为植物中含量最丰富的脂质之一，在植物生长、发育和逆境胁迫反应过程中发挥着重要作用^{［参考文献 38

百度学术}38］。原静静等^{［参考文献 39

百度学术}39］发现党参在干旱胁迫下，体内脂类代谢物发生显著变化。Li等^{［参考文献 40

百度学术}40］发现拟南芥的鞘脂代谢相关基因参与响应氧化胁迫过程。说明小麦可能通过调控甘油脂类代谢通路以应对⁷Li离子束引起的损伤。γ射线辐照诱导的差异表达基因显著富集在光合作用-天线蛋白等通路，说明γ射线辐照可能通过改变光合作用代谢通路抑制小麦生长。结果说明，⁷Li离子束辐照能调控与γ射线不同的代谢途径响应辐照引起的损伤。

在受到非生物胁迫时植物会激活复杂的生物反应调节，而这些反应需要许多重要的调节因子参与，如转录因子^［

41］。转录因子是信号转导中的关键部分，与顺式元件相互作用，与特定下游基因的启动子结合调控基因的表达，在植物的发育、进化和相应环境胁迫^{［参考文献 42-43}42-43］反应中发挥着重要作用。研究表明，MYB^{［参考文献 44

百度学术}44］、WRKY^{［参考文献 45

百度学术}45］、bHLH^{［参考文献 46

百度学术}46］和NAC^{［参考文献 47

百度学术}47］是植物对非生物胁迫应答的重要转录因子。在向日葵（Helianthus annuus L.）叶片和根中的MYB转录因子基因表达下调响应盐胁迫^{［参考文献 48

百度学术}48］，在遏蓝菜（Thlaspi caerulescens L.）中也发现了WRKY转录因子基因表达下调以响应盐胁迫^{［参考文献 49

百度学术}49］，表明这类转录因子可以作为负向调控因子参与植物对非生物胁迫的响应。Hwang等^{［参考文献 50

百度学术}50］发现γ射线和碳离子辐照水稻后，MYB、WRKY、bHLH和NAC等转录因子的表达受到显著抑制。本研究中，⁷Li离子束辐照诱导的MYB、WRKY、bHLH和NAC等转录因子中大部分表达水平呈下降趋势，说明⁷Li离子束辐照能诱导这类转录因子基因表达下调以响应辐照引起的小麦损伤。本研究鉴定出几种电离辐射特异转录因子，如ARR-B和HSF；在质子束辐照后的豇豆（Vigna unguiculata （L.）Walp）中也发现这类转录因子^{［参考文献 51

百度学术}51］。Dof转录因子具有调节植物新陈代谢、组织分化和生长发育的功能^{［参考文献 52-53}52-53］，且Dof过表达会导致生长缺陷^{［参考文献 54

百度学术}54］，在本研究中Dof被γ射线辐照特异诱导，因此推测γ射线辐照对小麦幼苗的抑制效应可能与Dof家族转录因子的高表达密切相关。此外，E2F/DP^{［参考文献 55

百度学术}55］和Whirly^{［参考文献 24

百度学术}24］是调控植物DNA复制和修复的重要转录因子，Maréchal等^{［参考文献 56

百度学术}56］发现Whirly蛋白能维持拟南芥质体基因组的稳定，Wang等^{［参考文献 24

百度学术}24］发现Whirly能维持叶绿体基因组的完整性。本研究结果显示， ⁷Li离子束辐照特异诱导了2个Whirly转录因子，以此来修复⁷Li离子束辐照造成的DNA损伤，而γ射线特异诱导了1个E2F/DP的转录因子调控DNA损伤修复。以上结果表明，MYB、WRKY、bHLH和NAC等转录因子在响应⁷Li离子束辐照中具有重要作用，且⁷Li离子束和γ射线辐照诱导了不同转录因子参与DNA损伤修复。

4 结论

本研究解析了⁷Li离子束辐照小麦的特异生物学效应。彗星电泳数据结合转录组数据分析结果表明，与γ射线相比，⁷Li离子束辐照引起的小麦幼苗生长抑制程度低；⁷Li离子束辐照能特异诱导细胞壁合成与代谢和甘油脂类代谢等通路来响应⁷Li离子束辐照引起的损伤；此外⁷Li离子束辐照特异诱导了Whirly转录因子调控DNA损伤修复，说明⁷Li离子束是一种区别于γ射线的新型诱变剂。本研究结果为今后利用⁷Li离子束进行诱变育种提供了重要参考。

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