水稻中胚轴伸长相关候选基因的关联分析

刘金栋; 王雅美; 刘宏岩; 孟云; 叶国友; LIU Jindong; WANG Yamei; Liu Hongyan; MENG Yun; YE Guoyou

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水稻中胚轴伸长相关候选基因的关联分析 PDF

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刘金栋 ^1,2
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王雅美 ^2,3
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刘宏岩 ⁴
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孟云 ^2,4
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叶国友 ^2,5
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1. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081； 2. 中国农业科学院深圳农业基因组研究所，深圳 518120； 3. 中山大学深圳校区农学院，深圳 518107； 4. 海南大学三亚南繁研究院，三亚 572025； 5. 国际水稻研究所，菲律宾马尼拉 090012

最近更新：2023-10-31

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230326001

摘要

旱直播技术可有效提升水稻生产效率。中胚轴长度（ML，mesocotyl length）是影响旱直播水稻出苗和幼苗活力的重要性状。选育长中胚轴品种是促进旱直播技术推广最为经济、有效的方式。旱直播在南亚和东南亚地区的籼稻种植区已有一定推广面积，在粳稻种植区推广面积较少。前人已发现一批中胚轴伸长相关候选基因，但其可靠性及适用性尚待验证。基于已报道的97个中胚轴伸长相关候选基因，在不同来源的TROP和TEMP两个粳稻自然群体开展候选基因关联分析，鉴定到4个显著候选基因，解释4.7%~6.3%和5.4%~6.7%的遗传变异。其中，LOC_Os01g44130、LOC_Os03g50560和LOC_Os05g27790在TROP和TEMP群体中均显著关联，而LOC_Os11g10990和LOC_Os10g20860分别在TROP和TEMP群体中显著关联。候选基因所编码蛋白主要参与植物激素合成与代谢、信号转导和植物生长进程。进一步在TROP群体（LOC_Os05g27790-Hap3和LOC_Os05g27790-Hap6、LOC_Os03g50560-Hap1、LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap3）和TEMP群体（LOC_Os05g27790-Hap6、LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_Os10g20860-Hap5）中分别鉴定到6个和3个可用于分子标记辅助育种的优异单倍型。本研究鉴定到的显著关联候选基因及其优异单倍型可应用于水稻长中胚轴分子育种实践中。

关键词

水稻; 中胚轴; 候选基因; 优异单倍型; 关联分析

水稻（Oryza sativa. L）是最为重要的粮食作物之一。全球有超过50%的人口以稻米为主食。水稻的高产和稳产对于保障我国粮食安全至关重要。水稻生产主要包括传统的育苗移栽和旱直播两种方式。相较于传统移栽，旱直播生产方式无需育苗及移栽，有效降低人力消耗，减少水资源浪费。当前，水稻旱直播方式已在南亚和东南亚地区大面积推广^［

1］。然而，水稻旱直播存在诸多弊端，最为显著的是出苗率低、成苗差、易倒伏。因此，如何促进旱直播水稻快速、高质量的出苗是旱直播推广亟需破解的难题。中胚轴是水稻幼苗胚芽鞘基部和根之间连接的器官。中胚轴的伸长对于籽粒发芽并突破土壤形成幼苗的过程十分重要^{［参考文献 2-3}2-3］。旱直播条件下长中胚轴品种破土能力更强，出苗率较高且长势强^{［参考文献 4

百度学术}4］，采用长中胚轴品种可有效促进旱直播技术的推广^{［参考文献 5-6}5-6］。多数材料中胚轴长度（ML，mesocotyl length）小于2.0 cm，长中胚轴种质不足10%^{［参考文献 6-8}6-8］。因此，挖掘中胚轴伸长相关基因，评价其可用性，可加速长中胚轴分子标记辅助选择（MAS，molecular marker assisted selection）育种，有效促进旱直播推广^{［参考文献 9

百度学术}9］。

中胚轴的伸长受外界环境因素和内部遗传机制共同影响。外界环境中光照、温度和土壤对中胚轴伸长影响最为显著^［

10-11］。中胚轴长度是典型的微效数量遗传性状，由多基因共同控制^{［参考文献 6-8}6-8］。前人在12条染色体上鉴定到近70余个中胚轴长度相关位点，分别解释5.7%~27.8%的表型变异^{［参考文献 4

百度学术}4， 6， 12-21］。Wu等^{［参考文献 14

百度学术}14］利用关联分析在第1、3、4、5、6和9号染色体上定位到12个中胚轴长度相关QTL，其中，第3号染色体上来自Kasalath的等位位点贡献率高达37.6%。Zhao等^{［参考文献 15

百度学术}15］利用GWAS在第3和7号染色体上鉴定到两个控制中胚轴长度的基因并命名为OsML1和OsML2，其表达量显著低于短中胚轴品种。Liu等^{［参考文献 16

百度学术}16］利用207份籼稻种质，发掘到16个中胚轴长度相关位点，分别解释6.3%~15.9%的表型变异。Wang等^{［参考文献 6

百度学术}6］基于12个F₂群体的QTL-seq分析，鉴定到17个中胚轴长度相关位点，分别解释5.3%~14.6%的表型变异。刘畅等^{［参考文献 18

百度学术}18］基于QTL-seq和连锁分析进一步将第3号染色体29.56~33.28 Mb处的中胚轴长度遗传区域缩小到28.89~31.03 Mb。迄今，仅有4个中胚轴长度相关基因被克隆和验证，包括OsGY1^{［参考文献 22

百度学术}22］、OsGSK2^{［参考文献 23

百度学术}23］、OsSMAX1^{［参考文献 24

百度学术}24］和OsPAO5^{［参考文献 17

百度学术}17］。另外，目前水稻中已报道97个中胚轴长度相关候选基因，然而这些基因的可靠性和育种可用性欠缺评估。

基于连锁不平衡（LD）的全基因组关联分析（GWAS，genome wide association study）已成为作物复杂性状遗传机制解析的重要方式^［

25-27］。然而，GWAS所基于的遗传变异为全基因组变异，基于候选基因的关联分析（CAS，candidate gene association study）以基因组功能区内的变异为目标，可更显著地提高基因检测的效应^{［参考文献 28-29}28-29］，目前，已有多项研究通过CAS来评价候选基因的可靠性及其效应大小^{［参考文献 30

百度学术}30］。另外，真正影响个体表型的往往不是单个SNP或InDel变异，而是由多个遗传变异组成的单倍型。因此，针对重要候选基因开展单倍型分析，鉴定优异单倍型，对于MAS育种十分重要。目前，单倍型分析在农作物产量、营养、病害抗性和抗逆相关研究中取得越来越多进展^{［参考文献 30-31}30-31］。

旱直播技术在南亚和东南亚地区的籼稻种植区有一定的推广面积。近年来，3K重测序项目为水稻的遗传解析提供了充分的基因型和表型信息^［

32-34］。基于已发现的中胚轴长度关联位点，筛选到97个已报道候选基因，采用来自于3K重测序项目的TROP（热带粳稻）和TEMP（亚热带粳稻）两个亚群，利用CAS评估这97个候选基因在粳稻育种群体中的效应，并鉴定优异单倍型，为水稻长中胚轴育种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究采用来自于3K重测序项目的两个粳稻亚群（TROP和TEMP）进行中胚轴长度值的CAS分析（TROP所包含材料及表型数据详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230326001，附表1，TEMP所包含材料及表型数据详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230326001，附表2）^［

34］和优异单倍型鉴定。其中，TROP亚群包含334份自然材料，主要包括来源于东南亚和南亚热带地区（如印度尼西亚、菲律宾、马来西亚等）的粳稻；TEMP群体包含210份自然材料，包括来自于东亚地区（如中国、日本和韩国）的粳稻。

表1 已报道水稻中胚轴伸长相关候选基因

Table 1 Reported candidate genes for rice mesocotyl elongation

候选基因	染色体	开始（bp）	终止（bp）	注释	参考文献
Candidate gene	Chromosome	Start	End	Annotation	Reference
LOC_Os01g08220	1	4004946	4003659	赤霉素3-β-双加氧酶2-2	［4］
LOC_Os01g13200	1	7357620	7352175	脱落酸不敏感因子 8	［19］
LOC_Os01g16400	1	9318060	9314159	NB-ARC 结构域蛋白	［42］
LOC_Os01g32940	1	18080300	18079428	假定蛋白	［4］
LOC_Os01g36020	1	19931949	19929043	逆转录组蛋白	［4］
LOC_Os01g44130	1	25298072	25291338	天冬氨酸蛋白酶米蛋白酶-1前体	［4］
LOC_Os01g50970	1	29288718	29285372	表达蛋白	［4］
LOC_Os01g50980	1	29295442	29290326	Cullin家族	［4］
LOC_Os01g50990	1	29299464	29298041	FBD 结构域蛋白	［4］
LOC_Os01g53090	1	30521565	30512276	病原体相关蛋白	［6］
LOC_Os01g66100	1	38385504	38382382	赤霉素20氧化酶2	［6］
LOC_Os01g67430	1	39178676	39177169	脂肪酶	［22］
LOC_Os01g71410	1	41376297	41375172	糖基水解酶家族17	［4］
LOC_Os02g07480	2	3863872	3855934	含转糖基化酶SLT结构域的蛋白质	［15］
LOC_Os02g49230	2	30099674	30094292	CCT/B-box 锌指结构蛋白	［16］
LOC_Os03g06070	3	3045376	3039736	la 结构域蛋白	［4］
LOC_Os03g06139	3	3085989	3075919	ABC-2 类含转运蛋白结构域的蛋白质	［4］
LOC_Os03g39790	3	22138216	22135801	转录组蛋白	［4］
LOC_Os03g40040	3	22244649	22243187	表达蛋白	［4］
LOC_Os03g40084	3	22270021	22268809	表达蛋白	［4］
LOC_Os03g40110	3	22292562	22285683	nop14-l类家族蛋白	［4］
LOC_Os03g40194	3	22351524	22347660	类抗病蛋白 RPP13	［4］
LOC_Os03g40390	3	22445121	22443273	表达蛋白	［4］
LOC_Os03g50540	3	28860136	28855620	2Fe-2S含铁硫簇结合结构域的蛋白质	［18］
LOC_Os03g50550	3	28862894	28861857	STE_MEK_ste7_MAP2K.7-STE激酶	［18］
LOC_Os03g50560	3	28873264	28869065	RNA识别序列蛋白	［18］
LOC_Os03g50570	3	28880854	28875574	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50580	3	28882859	28882515	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50590	3	28891283	28890274	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50600	3	28896432	28896052	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50610	3	28900356	28900024	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50620	3	28906929	28901044	ATP 结合蛋白	［18］
LOC_Os03g50630	3	28913708	28913418	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50644	3	28917706	28916701	表达蛋白	［18］
LOC_Os03g50660	3	28929255	28927914	CACTA， En/Spm亚类转录蛋白	［18］
LOC_Os03g50670	3	28940039	28931768	Ty3-gypsy 亚类逆转录组蛋白	［18］
LOC_Os03g51340	3	29378021	29376077	表达蛋白	［15］
LOC_Os03g53320	3	30603235	30602885	假定蛋白	［15］
LOC_Os03g53340	3	30607164	30603964	HSF-型 DNA-含有结合结构域的蛋白质	［15］
LOC_Os03g56050	3	31925513	31921933	AP2类乙烯反应性转录因子	［6］
LOC_Os03g56060	3	31934624	31930541	CSLC9-纤维素合成酶样家族C	［6］
LOC_Os03g56060	3	31934624	31930541	CSLC9-纤维素合成酶样家族C	［6］
LOC_Os03g57640	3	32852782	32851425	赤霉素受体GID1L2	［6］
LOC_Os03g58290	3	33210400	33207531	吲哚-3-甘油磷酸裂解酶，叶绿体前体	［6］
LOC_Os03g58300	3	33217418	33214533	吲哚-3-甘油磷酸裂解酶，叶绿体前体	［6］
LOC_Os03g58320	3	33228543	33226460	吲哚-3-甘油磷酸裂解酶，叶绿体前体	［6］
LOC_Os04g16350	4	8888963	8885859	逆转录转座子蛋白	［4］
LOC_Os04g17840	4	9786839	9781331	逆转录转座子蛋白	［4］
LOC_Os04g19900	4	11100948	11096093	Ty3-gypsy亚类逆转录转座子蛋白	［4］
LOC_Os04g33360	4	20201885	20200072	赤霉素2-β-双加氧酶7	［8，20］
LOC_Os04g51190	4	30321649	30317693	生长调节因子	［4］
LOC_Os04g51390	4	30438328	30433199	醛糖1差向异构酶	［4］
LOC_Os04g51600	4	30571716	30570016	表达蛋白	［4］
LOC_Os04g58590	4	34837343	34832040	含RNA识别基序蛋白质	［15］
LOC_Os05g10670	5	5848291	5846045	锌指结构家族蛋白CCCH	［8， 16］
LOC_Os05g10770	5	5946866	5940137	jumonji转录因子	［8， 16］
LOC_Os05g11730	5	6661493	6657481	CGMC_GSK.7-CGMC包括CDA， MAPK， GSK3和CLKC激酶	［23］
LOC_Os05g27650	5	16103367	16093366	CACTA， En/Spm 亚类转座子蛋白	［4］
LOC_Os05g27720	5	16145937	16141193	CACTA， En/Spm 亚类转座子蛋白	［4］
LOC_Os05g27740	5	16159660	16156427	表达蛋白	［4］
LOC_Os05g27790	5	16186813	16184117	膜相关DUF588结构域含蛋白	［4］
LOC_Os05g28090	5	16423221	16421457	表达蛋白	［4］
LOC_Os05g39530	5	23201465	23196134	核糖核酸酶P家族蛋白	［4］
LOC_Os06g09660	6	4932177	4926492	生长素响应因子	［6］
LOC_Os06g43690	6	26312412	26303837	WD重复序列蛋白	［4］
LOC_Os06g44070	6	26583748	26581702	逆转录转座子蛋白	［4］
LOC_Os06g44080	6	26588132	26585560	泛素家族蛋白	［4］
LOC_Os07g13634	7	7832311	7815442	细胞分裂素-N-葡萄糖基转移酶 1	［6］
LOC_Os07g22360	7	12552496	12551930	表达蛋白	［8， 15］
LOC_Os07g23990	7	13604623	13589491	含四肽重复结构域的蛋白质	［8， 15］
LOC_Os07g24010	7	13611539	13611075	假定蛋白	［8， 15］
LOC_Os07g24170	7	13729382	13728678	表达蛋白	［8， 15］
LOC_Os07g24190	7	13747256	13741284	CESA3-纤维素合成酶	［8， 15］
LOC_Os07g25460	7	14580334	14574496	含锚蛋白重复结构域的蛋白质	［8， 15］
LOC_Os07g27610	7	16129954	16129694	表达蛋白	［8， 15］
LOC_Os07g27630	7	16135465	16134832	表达蛋白	［15］
LOC_Os07g27680	7	16151880	16150946	表达蛋白	［15］
LOC_Os07g28060	7	16368840	16368462	乙烯受体	［6］
LOC_Os07g39660	7	23772784	23772512	假定蛋白	［15］
LOC_Os08g04240	8	2064909	2063156	富含半胱氨酸的重复分泌蛋白55前体	［6］
LOC_Os08g04340	8	2130615	2129613	含有质体花青素样结构域的蛋白质	［6］
LOC_Os08g04350	8	2134479	2133547	含有质体花青素样结构域的蛋白质	［6］
LOC_Os08g15296	8	9272579	9271631	光系统II反应中心蛋白H	［4］
LOC_Os08g17350	8	10613674	10613092	表达蛋白	［5］
LOC_Os08g41180	8	26016312	26015092	BTB蛋白结构域	［4］
LOC_Os09g03140	9	1505356	1503778	细胞分裂素-O-葡糖基转移酶2	［6］
LOC_Os09g11380	9	6336208	6327584	表达蛋白	［4］
LOC_Os09g11800	9	6598134	6596786	表达蛋白	［15］
LOC_Os09g12000	9	6760348	6759298	假定蛋白	［4］
LOC_Os09g20350	9	12218346	12216432	乙烯响应转录因子	［6］
LOC_Os10g03730	10	1684278	1681080	OsFBX347 - F-box 蛋白结构域	［15］
LOC_Os10g03780	10	1715027	1707818	OsFBX351 - F-box 蛋白结构域	［15］
LOC_Os10g20860	10	10573989	10570876	蛋白酶抑制剂/种子贮藏/LTP家族	［4］
LOC_Os11g10920	11	6034441	6030542	羧基末端蛋白酶	［15］
LOC_Os11g10990	11	6066797	6064996	热激蛋白DnaJ	［15］
LOC_Os12g08780	12	4517346	4515673	黄素单加氧酶	［6］
LOC_Os12g24800	12	14234903	14232903	9-顺式环氧类胡萝卜素双加氧酶1	［6］

表2 用于TROP和TEMP群体表达量分析的极端中胚轴材料

Table 2 The accessions with extreme mesocotyl length in TROP and TEMP panel

TROP群体			TEMP群体
材料代号 Code name	名称 Name	中胚轴长度（cm） Mesocotyl length	材料代号 Code name	名称 Name	中胚轴长度（cm） Mesocotyl length
A	MALAGKIT	4.09	I	LUSITO IRRADIADO 859-85-2	2.05
B	BIKYAT	4.23	J	FU LI HONG	2.08
C	BUNTU DOMBA 1	4.26	K	MAO ZHA NUO	2.11
D	BLUE BELLE	4.38	L	HAN NUO	2.20
E	PANNITHI	0.21	M	CHEONJUDO	0.14
F	KETAN MLANTING	0.35	N	YUNLEN 13	0.14
G	SAMPANG KUNING	0.43	O	MA SHE 8	0.15
H	PANGETAN	0.43	P	LUAN DAO	0.17

1.2 试验方法

1.2.1 幼苗培养与中胚轴长度测定

将籽粒播种于装有营养土的穴盘内（10个×5个），15粒/穴，每份材料种植一穴。随后，称取500 g营养土至托盘内，将播种后的穴盘置于托盘内并取适量去离子水喷洒穴盘与托盘。将处理后的穴盘和托盘置于30℃恒温黑暗培养箱内培养，每日定时浇水。约10 d后将穴盘从培养箱中取出，选取长势均一株系，采用流动水冲洗根部土壤，随后对各株系进行拍照并利用Image J软件（https：//image j.en.softonic.com/）测量中胚轴长度，去除长势较差单株后，每份材料测量约8~15株。

1.2.2 基因型获取

TROP和TEMP群体的基因型数据均来自于水稻3K重测序项目^［

34］，平均测序深度约12×。基于ANNOVAR对核苷酸变异（SNP和InDel）的注释信息^{［参考文献 35

百度学术}35］，提取97个候选基因内部的CDS和启动子（-1500 bp）区域的SNP和Indel变异信息（表1），用于CAS和单倍型分析。单倍型分型基于RFGB数据库（Rice Functional Genomics and Breeding Datase，https：//www.rmbreeding.cn/）^{［参考文献 36

百度学术}36］，主要基于非同义SNP和Indel，在分析过程中过滤掉基因型数据完全一致的遗传变异。

1.2.3 CAS分析

利用筛选后的SNP和Indel进行中胚轴长度的CAS分析。为控制假阳性，CAS分析采用基于PCA（Principal component analysis）+K（Kinship）的混合线性模型（MLM，mixed linear model）（Tassel v5.1）^［

37-40］。TEMP和TROP的PCA分析由GAPIT完成^{［参考文献 41

百度学术}41］。TROP和TEMP群体MLM模型阈值选择P=10^-3。随后，对不同单倍型材料的中胚轴长度平均值进行Duncan分析，鉴定优异单倍型（优异单倍型中胚轴长度在P<0.05水平下显著高于其他单倍型）。

1.2.4 候选基因表达量分析

针对TROP和TEMP群体，分别选取4份极长和极短中胚轴品种（表2），按照1.2.1的方法进行播种，并于第6天取中胚轴用于表达量检测。qRT-PCR引物如表3所示。采用TRIzol法提取总RNA并检测其浓度和纯度，确定RNA模板加样量。反转录合成20 μL cDNA（RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit，Thermo Scientific），并用双蒸水稀释5~10倍，配制qPCR反应体系（ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix），使用2^-ΔΔCT进行基因表达水平数据分析。设置3次重复，以β-Actin和GAPDH管家基因为内参基因对基因表达数据归一化分析。

表3 The primer sequence of the significant candidate gene for expression analysis

引物名称 Primer name	正向引物序列（5′-3′） Forward primer sequence（5′-3′）	反向引物序列（5′-3′） Reverse primer sequence（5′-3′）
β-Actin	AGTGTCTGGATTGGAGGAT	TCTTGGCTTAGCATTCTTG
GAPDH	AAGCCAGCATCCTATGATCAGATT	CGTAACCCAGAATACCCTTGAGTTT
LOC_Os01g44130	TTTGTGTTGACGGTTGTGCT	TTTGCACTCTTCGTTTGCCA
LOC_Os03g50560	GGTTAACAAGCGCATTTGGC	AAGCCCATTCCTCTCTTCCC
LOC_Os05g27790	GCGATCCCGATAACGAACAG	AAGAAGGCCATGCTGATGGA
LOC_Os11g10990	GGGAAGAAGAAGACGGTGGA	ACCTGGTAGTGAGACTCGGA
LOC_Os10g20860	GAGTGTGCATCAACGTGCTA	CCGAGATCAACTGGGAGGTT

表3　显著候选基因表达分析引物序列

2 结果与分析

2.1 基因型和表型分析

本研究选择的97个中胚轴伸长候选基因在水稻12条染色体上均有分布。其中，3号染色体最多，1号和7号染色体其次，2号染色体仅有2个。在97个中胚轴伸长候选基因的CDS和启动子区共鉴定出1819个SNP和911个InDel位点，单基因SNP和InDel变异平均分别为18.7和9.4个，遗传变异在染色体上分布详见图1。TROP群体和TEMP群体均源自于3K重测序项目，为遗传背景相近的亚群。PCA分析结果表明TROP群体前3个主成分的方差解释率分别为23.5%、7.2%和1.6%；TEMP群体前3个主成分方差解释率分别为24.6%、8.2%和2.2%，在两个群体中均存在明显的群体结构。在两群体中，中胚轴长度均呈连续性变异（图2）。TEMP群体和TROP群体的中胚轴长度均呈近似正态分布，TEMP群体表型范围为0.06~2.58 cm，平均值为0.84 cm，标准差和变异系数分别为0.54和64.2%；TROP群体中胚轴长度的变异范围为0.21~4.38 cm，平均值为1.80 cm，标准差和变异系数分别为0.89和49.4%。

图1 已报道97个中胚轴伸长候选基因及其遗传变异在水稻染色体上的分布

Fig. 1 The distribution of 97 mesocotyl elongation candidate genes and their genetic variations on rice chromosomes

图2 TROP和TEMP群体水稻中胚轴长度

Fig. 2 The mesocotyl length of accessions from TROP and TEMP population

2.2 候选基因关联分析

在TROP群体中，基于MLM模型，鉴定到7个SNP与中胚轴长度显著关联，分别位于1号（25.3 Mb）、3号（28.9 Mb）、5号（16.2 Mb）和11号（6.1 Mb）染色体上，解释4.7%~6.3%的表型变异。在TEMP群体中，鉴定到26个SNP与中胚轴长度显著相关，分别位于1号（25.3 Mb）、3号（28.9 Mb）、5号（16.1~16.2 Mb）和10号（10.6 Mb）染色体上，解释5.4%~6.7%的表型变异。其中，LOC_Os01g44130、LOC_Os03g50560和LOC_Os05g27790在TROP和TEMP亚群中均与中胚轴长度显著关联；LOC_Os11g10990仅在TROP群体中与中胚轴长度显著关联，而LOC_Os10g20860仅在TEMP群体中与中胚轴长度显著关联（表4）。将显著关联基因作为候选基因进行下一步分析。

表4 TROP和TEMP群体中胚轴长度候选基因关联分析结果

Table 4 The results of the candidate gene association analysis for mesocotyl length in TROP and TEMP population

亚群	候选基因	标记	染色体	位置（Mb）	P值	表型变异率（%）
Group	Candidate gene	Marker	Chromosome	Position	P-value	Phenotypic variation
TROP	LOC_Os03g50560	rs3_28875586	3	28.9	4.7E-03	4.8
	LOC_Os01g44130	rs1_25293070	1	25.3	2.1E-03	4.8
	LOC_Os01g44130	rs1_25292504	1	25.3	2.2E-03	4.7
	LOC_Os01g44130	rs1_25289678	1	25.3	2.4E-03	4.7
	LOC_Os05g27790	rs5_16182057	5	16.2	1.2E-03	6.3
	LOC_Os05g27790	rs5_16183210	5	16.2	3.2E-03	5.6
	LOC_Os11g10990	rs11_6064185	11	6.1	1.4E-03	6.2
TEMP	LOC_Os03g50560	rs3_28896854	3	28.9	1.1E-04	6.7
	LOC_Os03g50560	rs3_28895506	3	28.9	1.4E-04	6.5
	LOC_Os05g27790	rs5_16143550	5	16.1	1.8E-04	6.4
	LOC_Os05g27790	rs5_16156027	5	16.2	2.0E-04	6.4
	LOC_Os05g27790	rs5_16183705	5	16.2	2.4E-04	6.1
	LOC_Os05g27790	rs5_16090675	5	16.1	2.4E-04	6.2
	LOC_Os05g27790	rs5_16092174	5	16.1	2.5E-04	6.0
	LOC_Os05g27790	rs5_16182057	5	16.2	2.5E-04	6.1
	LOC_Os05g27790	rs5_16157197	5	16.2	2.6E-04	6.1
	LOC_Os05g27790	rs5_16154422	5	16.2	2.8E-04	6.1
	LOC_Os05g27790	rs5_16182344	5	16.2	2.8E-04	6.0
	LOC_Os05g27790	rs5_16159098	5	16.2	2.8E-04	5.9
	LOC_Os05g27790	rs5_16181390	5	16.2	2.8E-04	5.9
	LOC_Os05g27790	rs5_16157357	5	16.2	2.9E-04	6.0
	LOC_Os05g27790	rs5_16091666	5	16.1	2.9E-04	6.1
	LOC_Os05g27790	rs5_16091887	5	16.1	3.1E-04	6.2
	LOC_Os05g27790	rs5_16090954	5	16.1	3.3E-04	5.9
	LOC_Os05g27790	rs5_16155086	5	16.2	3.5E-04	5.9
	LOC_Os03g50560	rs3_28925811	3	28.9	3.7E-04	5.7
	LOC_Os05g27790	rs5_16183210	5	16.2	3.8E-04	5.8
	LOC_Os01g44130	rs1_25290468	1	25.3	4.2E-04	5.6
	LOC_Os05g27790	rs5_16155122	5	16.1	4.7E-04	5.4
	LOC_Os05g27790	rs5_16155087	5	16.1	5.2E-04	5.6
	LOC_Os05g27790	rs5_16143096	5	16.1	5.7E-04	5.6
	LOC_Os10g20860	rs10_10570859	10	10.6	6.0E-04	5.7
	LOC_Os10g20860	rs10_10569618	10	10.6	5.7E-04	5.6

2.3 候选基因单倍型分析

针对LOC_Os01g44130基因在TROP和TEMP群体中的单倍型进行分析，其启动子和CDS区的遗传变异位点共同组成了两种主要单倍型（单倍型频率< 0.05未统计，下同），分别命名为LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_Os01g44130-Hap2。LOC_Os01g44130-Hap1在TROP和TEMP亚群中均为优势单倍型，分布频率分别为96.1%和97.6%。基于LOC_ Os03g50560基因启动子和CDS区的遗传变异位点，共同组成两种主要单倍型，分别命名为LOC_Os03g50560-Hap1和LOC_Os03g50560-Hap2。LOC_Os03g50560-Hap1在两个亚群中均为优势单倍型，分布频率分别为94.6%和92.9%。LOC_Os05g27790基因启动子和CDS区的遗传变异位点组成了7种主要单倍型，命名为LOC_Os05g27790-Hap1~Hap7，在TROP亚群中均有分布。其中，LOC_Os05g27790-Hap1分布频率最高，为45.8%。TEMP群体中存在LOC_Os05g27790-Hap1~Hap3和LOC_Os05g27790-Hap5~Hap6等5种单倍型。其中，LOC_Os05g27790-Hap1所占比例最高，接近64.8%。LOC_Os10g20860仅在TEMP群体中与中胚轴长度显著关联，其遗传变异位点形成5种主要单倍型，命名为LOC_Os10g20860-Hap1~Hap5。分布最为广泛的为LOC_Os10g20860-Hap1，占比接近66.7%。LOC_ Os11g10990仅在TROP群体中与中胚轴长度显著关联，LOC_Os11g10990-Hap1~Hap4，LOC_ Os11g10990- Hap1分布最为广泛，占比近45.3%（表5，详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20230326001，附表3，详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20230326001，附表4）。

表5 TROP和TEMP群体的中胚轴相关优异单倍型

Table 5 Superior haplotypes of mesocotyl length associated genes in TROP and TEMP population

候选基因 Candidate gene	单倍型 Haplotypes	TROP		TEMP
候选基因 Candidate gene	单倍型 Haplotypes	数量 Number	中胚轴长度（cm） Mesocotyl length	数量 Number	中胚轴长度（cm） Mesocotyl length
LOC_Os01g44130	Hap1	321	1.792a	205	0.883a
	Hap2	8	1.670b	5	0.527b
LOC_Os03g50560	Hap1	316	1.788a	195	0.870
	Hap2	3	1.158b	-	-
LOC_Os05g27790	Hap1	153	1.871b	136	0.901b
	Hap2	90	1.559c	3	0.807bc
	Hap3	40	2.042a	49	0.865b
	Hap4	19	1.630bc	-	-
	Hap5	7	1.667bc	10	0.547c
	Hap6	7	2.245a	9	1.003a
	Hap7	5	1.496c	-	-
LOC_Os10g20860	Hap1	-	-	140	0.779c
	Hap2	-	-	21	0.830c
	Hap3	-	-	9	1.051b
	Hap4	-	-	7	0.748c
	Hap5	-	-	6	1.475a
LOC_Os11g10990	Hap1	83	1.967a	-	-
	Hap2	78	1.500b	-	-
	Hap3	15	1.724ab	-	-
	Hap4	7	1.345b	-	-

不同小写字母分别代表P<0.05水平下差异显著；下同。-代表无数据

Different lowercase letters indicate significant at P<0.05 level； The same as below. - means missing

基于多重比较，在TROP群体中鉴定到6种优异单倍型，分别为LOC_Os05g27790-Hap3和LOC_Os05g27790-Hap6、LOC_Os03g50560-Hap1、LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap3；在TEMP群体中也鉴定到3种优异单倍型，分别为LOC_Os05g27790-Hap6、LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_Os10g20860-Hap5。其中，LOC_Os05g27790-Hap6和LOC_Os01g44130-Hap1在TROP和TEMP群体中均为优异单倍型。TROP群体中优异单倍型LOC_Os05g27790-Hap3和LOC_Os05g27790-Hap6对应中胚轴长度分别为2.042 cm和2.245 cm，与其他单倍型存在显著差异（P<0.05）；TEMP群体优异单倍型LOC_Os05g27790-Hap6对应中胚轴长度为1.003 cm，与其他单倍型存在显著差异（P<0.05）。LOC_Os03g50560-Hap1仅在TROP群体中为优异单倍型，对应中胚轴长度为1.788 cm，非优异单倍型LOC_Os03g50560-Hap2为1.158 cm，差异显著（P < 0.05）。LOC_Os01g44130-Hap1在TROP和TEMP群体中均为优异单倍型。其中，TROP群体中优异单倍型LOC_Os01g44130-Hap1对应中胚轴长度为1.792 cm，非优异单倍型LOC_Os01g44130-Hap2对应中胚轴长度为1.670 cm；TEMP群体中优异单倍型LOC_Os01g44130-Hap1对应中胚轴长度为0.883 cm，非优异单倍型LOC_Os01g44130-Hap2对应中胚轴长度为0.527 cm。LOC_Os11g10990仅在TROP群体中与中胚轴长度显著关联，其优异单倍型LOC_Os11g10990-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap3所对应中胚轴长度为1.967 cm和1.724 cm，其他材料所对应中胚轴长度为1.345~1.724 cm，差异显著（P < 0.05）。LOC_Os10g20860仅在TEMP群体中显著，其优异单倍型LOC_Os10g20860-Hap5所对应中胚轴长度为1.475 cm，与其他单倍型存在显著差异（P < 0.05）。

对TROP和TEMP亚群进行单倍型加性效应分析。结果表明，TROP亚群中胚轴长度加性效应显著，随着优异单倍型数目由1个增加到5个，所对应的中胚轴长度由1.20 cm增加至2.32 cm，差异显著（P < 0.05，R²=0.971）。TEMP群体也呈现相同趋势，随着优异单倍型数目由1个增加到3个，中胚轴长度由0.58 cm增加至1.21 cm，差异显著（P<0.05，R²=0.9964）（图3）。

图3 TROP和TEMP群体中胚轴优异单倍型加性效应分析

Fig. 3 Analysis of additive effects of excellent haplotypes of mesocotyl in TROP and TEMP populations

2.4 候选基因表达量分析

采用qRT-PCR对初步筛选的5个候选基因进行表达模式验证。在TROP群体中，LOC_Os01g44130和LOC_Os05g27790在长中胚轴品种表达水平显著低于短中胚轴品种；表明LOC_Os01g44130和LOC_Os05g27790参与并负调控中胚轴伸长。LOC_Os03g50560和LOC_Os11g10990在长中胚轴品种表达水平显著高于短中胚轴品种，表明以上基因参与并正调控中胚轴伸长。在TEMP群体中，LOC_Os01g44130和LOC_Os05g27790在长中胚轴品种表达水平显著低于短中胚轴品种；表明LOC_Os01g44130和LOC_Os05g27790参与并负调控中胚轴伸长。LOC_Os03g50560和LOC_Os10g20860在长中胚轴品种表达水平显著高于短中胚轴品种，表明其参与并正调控中胚轴伸长。在TROP和TEMP群体中，LOC_Os01g44130和LOC_Os05g27790和LOC_Os03g50560在两个亚群中的表达趋势一致（图4）。

图4 TROP和TEMP候选基因在中胚轴极长和极短材料的表达差异

Fig. 4 Relative expression levels of candidate genes between accessions with longer and shorter mesocotyl in TROP and TEMP

材料代号说明同表2

The accession code description is the same as table 2

3 讨论

水稻的中胚轴长度是典型的数量遗传性状，受多基因控制。旱直播技术在多数水稻种植国家已得到大面积推广，是未来水稻生产的发展方向。解析水稻中胚轴伸长遗传机制，加速选育直播稻，对于促进水稻直播生产具有重要作用。当前，水稻直播出苗影响因素研究已有较多报道，且已发掘部分中胚轴长度相关位点，为培育适宜于直播的种质提供参考。虽然已报道近百个中胚轴长度相关候选基因，但这些基因的可应用性尚未得到验证。另外，旱直播在籼稻种植区域已有一定推广面积，粳稻种植区域面积较少。因此，亟需选育长中胚轴粳稻资源。基于此，本研究以97个已报道中胚轴长度关联候选基因为研究对象，采用两个来源不同的粳稻自然群体（TROP和TEMP），基于CAS发掘中胚轴伸长相关基因，鉴定优异单倍型，为创制长中胚轴优异种质提供参考。

中胚轴伸长受到多种调节蛋白和植物激素的调控^［

42］。多项研究表明，生长素（IAA，auxin）^{［参考文献 9

百度学术}9］、赤霉素（GA，gibberellins）^{［参考文献 43-44}43-44］、乙烯（ETH，ethylene）^{［参考文献 22

百度学术}22］、细胞分裂素（CTK，cytokinin）^{［参考文献 45

百度学术}45］和脱落酸（ABA，abscisic acid）^{［参考文献 46

百度学术}46］均能促进中胚轴伸长；而茉莉酸（JA，jasmonic acid）和独脚金内酯（SL，strigolactones）则抑制中胚轴伸长。油菜素内酯（BR，brassinolide）低浓度促进伸长，高浓度则抑制伸长。针对97个候选基因开展CAS，发现LOC_Os05g27790、LOC_Os03g50560、LOC_Os01g44130、LOC_Os10g20860和LOC_Os11g10990与中胚轴伸长显著关联，分别编码RNA识别motif蛋白^{［参考文献 47

百度学术}47］、膜DUF588结构域蛋白^{［参考文献 48

百度学术}48］、水稻天冬氨酸蛋白酶合成前体^{［参考文献 42

百度学术}42］、LTP家族和热激蛋白DnaJ^{［参考文献 49

百度学术}49］。Duf588为膜结构蛋白，可通过参与调控植物细胞伸长、分裂和植物细胞信号通路来调控植物的生长发育。Liang等^{［参考文献 48

百度学术}48］表明Duf588可调节rel1-D的表达调控叶片的发育和对ABA激素的响应。水稻中RNA识别motif蛋白OsRRM参与多项植物激素调节过程，其信号途径和调控机理尚不明晰，还需要进一步研究^{［参考文献 50

百度学术}50］。天冬氨酸蛋白酶（AP，aspartic proteinase）广泛分布于多种生物^{［参考文献 42

百度学术}42］。拟南芥和水稻基因组分别包含69和96个AP基因。其中，拟南芥AsPG1的过表达可通过调节ABA依赖的信号传递响应干旱胁迫^{［参考文献 49

百度学术}49］。LTP家族可结合和转移多种脂质分子，参与植物中各种信号通路的激活和调节^{［参考文献 49

百度学术}49］，与ETH、IAA、ABA、JA和水杨酸的调控紧密关联。HSP40（DnaJ）等热休克蛋白（HSPs）在植物生长和非生物胁迫耐受中发挥重要作用，HSP40基因的过度表达与获得耐热性呈正相关，并导致植物对盐、水和高温胁迫的耐受性增强^{［参考文献 49

百度学术}49，51］。

相较于单个遗传变异，由同一基因不同区域的多个遗传变异所组成的单倍型对于育种更为重要。因此，针对重要基因在评估群体中的单倍型效应分析十分重要。结果表明，不同群体间单倍体分布存在差异，且优势单倍型也存在不同。如LOC_Os05g27790基因包含7个主要单倍型，其中，TROP材料存在所有7种单倍型，分布最广的为LOC_Os05g27790-Hap1（45.8%）和LOC_Os05g27790-Hap2（26.9%），而TEMP群体中存在LOC_Os05g27790-Hap1、LOC_Os05g27790-Hap2、LOC_Os05g27790-Hap3、LOC_Os05g27790-Hap5和LOC_Os05g27790-Hap6等5种单倍型，分布最广的为LOC_Os05g27790-Hap1（64.8%）和LOC_Os05g27790-Hap3（23.3%），LOC_Os05g27790-Hap2比例极低（1.4%）；LOC_Os 03g50560基因包含两种主要单倍型，TROP群体中两种单倍型均存在，分布最广的单倍型为LOC_Os 03g50560-Hap1（94.6%），而LOC_Os03g50560-Hap2比例仅为0.9%，TEMP群体中仅存在LOC_Os03g50560-Hap1（92.9%），其他单倍型分布较少。

加性效应分析表明，显著基因在TROP和TEMP亚群中单倍型累加效应显著。因此，可基于以上基因的优异单倍型开展MAS育种。在TROP和TEMP亚群中，随着优异单倍型数目的增加，中胚轴长度分别由1.20 cm和0.58 cm增加至2.32 cm和1.21 cm。因此，可以通过MAS育种的方式聚合优异单倍型，加速水稻长中胚轴种质选育。不同区域育种历史有较大的差异，且种质资源来源广泛，基于不同区域应选择不同基因和单倍型。本研究在TROP和TEMP群体中分别鉴定到6个和3个优异单倍型。其中，LOC_Os01g44130-Hap1和LOC_ Os05g27790-Hap6在TROP和TEMP群体中均为优异单倍型，具有较强的适应性，在南亚、东南亚和东亚地区的粳稻育种中均可应用。LOC_Os05g27790-Hap3、LOC_Os03g50560-Hap1、LOC_Os11g10990-Hap1和LOC_Os11g10990-Hap3仅适用于TROP群体；LOC_Os10g20860-Hap5仅适用于TEMP群体。携带多个优异单倍型的品系，如TROP群体中来自于印度尼西亚的SIFARASI、KABADOKA、PAE ONGGA、ANENOE和PADI UDANG，马来西亚的ANGKARONG和PINAHULA，菲律宾的SINAPLED、ONOY和BIKYAT；TEMP群体中来自于中国的NAN-29-2、CHING HIS、Diangeng China、MAO ZHA NUO，印度的PUTTIGE和菲律宾的IREQUIN可作为优异亲本应用于直播育种，促进水稻旱直播技术推广。

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