基于转录组学的蓖麻耐盐基因的挖掘

李艳肖; 张春兰; 徐兴源; 陈艳秋; 向殿军; 刘鹏; LI Yanxiao; ZHANG Chunlan; XU Xingyuan; CHEN Yanqiu; XIANG Dianjun; LIU Peng

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基于转录组学的蓖麻耐盐基因的挖掘 PDF

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1. 内蒙古民族大学农学院，通辽 028000； 2. 内蒙古民族大学生命科学与食品学院，通辽 028000

最近更新：2023-10-31

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230506002

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摘要

为获取蓖麻耐盐基因的序列信息，挖掘盐胁迫下差异表达基因及相关代谢途径，本研究以盐胁迫（300 mmol/L NaCl）处理0、12和24 h后通篦5号的幼苗真叶为试验材料，借助高通量测序技术进行转录组测序分析。结果表明，在盐胁迫12 h和24 h分别有4822和3103个差异表达基因。对共有的1872个差异表达基因进行共表达模式聚类分析，发现这些基因共有3种表达模式。KEGG代谢通路分析结果显示，缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（ko00280）、植物昼夜节律调控（ko04712）以及淀粉和蔗糖代谢（ko00500）3个通路在盐胁迫适应过程中显著富集；GO功能富集分析结果显示，多数差异表达基因被富集到生物过程中，其中细胞进程（GO：0009987）和响应非生物胁迫（GO：0009628）过程富集到差异表达基因的数目最多。另外，共有19个转录因子参与蓖麻的盐胁迫响应。植物激素信号转导通路中有42个差异表达基因，其中有97.6%的基因分别在12 h和24 h是上调表达的。此外，还筛选出包括光合作用途径、抗氧化调节、Na⁺、K⁺和Ca²⁺转运相关参与蓖麻幼苗盐胁迫的差异表达基因。qRT-PCR结果证明了上述试验结果可靠。综上，该研究可为蓖麻耐盐基因挖掘及盐胁迫适应机制的解析提供理论依据。

关键词

蓖麻; 幼苗; 盐胁迫; 转录组; qRT-PCR

近年来土壤盐渍化日渐严重，这是由气候因素和人为因素共同造成的^［

1-2］。气候驱动的土壤盐渍化是由降雨模式、降雨量和海平面上升综合驱动的，是造成土壤盐渍化的主要原因^{［参考文献 1

百度学术}1］；人为驱动的土壤盐渍化则是因为过度灌溉导致土地中积累了大量的难溶解性盐^{［参考文献 2

百度学术}2］。内蒙古通辽位于中国的东北地区，这里常年干旱少雨且多为沙质土壤，为灌溉型农业，这加剧了当地土壤的盐渍化（>40 mmol/m² NaCl），减少了实际土地的使用面积，更严重的会使作物减产，损害当地农民的利益^{［参考文献 3

百度学术}3］。因此，盐碱地的改良就显得尤为重要。而蓖麻（Ricinus communis）作为目前盐碱地改良的模式植物^{［参考文献 4

百度学术}4］，了解其在盐胁迫下的调控机制是必要的。

植物在盐胁迫环境下主要受两个阶段的影响：早期反应（渗透相）和晚期反应（离子相）^［

5］。早期反应是指植物在短期内通过诱导水分降低而引起渗透胁迫进而损害植物生长，最先损伤植物的根系统，表现出抑制水分吸收、根系生长、叶片发育、新叶减少和蒸腾叶细胞损伤等^{［参考文献 6

百度学术}6］；晚期反应则是指长期的盐胁迫诱导毒性离子的积累导致细胞质中养分不均衡进而损伤植物，主要表现在老叶片凋亡、光合作用减弱和酶活性的抑制等^{［参考文献 6-8}6-8］。为了生存，植物发展了复杂的防御机制来抵消盐胁迫的影响，如渗透调节机制和ROS解毒机制^{［参考文献 9

百度学术}9］。

植物对盐胁迫的适应性是极其复杂的，由多种与胁迫相关性状的复杂信号网络调控，而对盐胁迫的耐受性或敏感性在很大程度上取决于植物的发育阶段^［

10］。如水稻（Oryza sativa）在发芽期、分蘖活跃时期和成熟期对盐胁迫相对耐受，但在苗期（1~3周龄）、穗部萌发期和开花期对盐胁迫非常敏感^{［参考文献 11

百度学术}11］。各种组学研究的兴起为解析植物不同发育时期的识别应激反应提供了便利的条件，如关键基因、蛋白质、代谢产物和复杂信号通路的绘制等^{［参考文献 12

百度学术}12］。转录组学作为其中之一，能够有效地从分子水平上阐明植物的生长，并成功地预测出植物受环境胁迫影响的动态特征^{［参考文献 13

百度学术}13］。葡萄（Vitis vinifera）盐胁迫转录组分析表明，包括活性氧清除、离子运输、热休克蛋白和激素信号在内的多个生物通路参与葡萄盐胁迫的应答机制^{［参考文献 14

百度学术}14］。苦荞（Fagopyrum Tataricum）的转录组分析显示，与氨基酸、脂质和核苷酸代谢相关的基因对盐胁迫反应最强烈，参与苦荞对盐胁迫适应的调控^{［参考文献 15

百度学术}15］。两种不同表型的大白菜（（Brassica rapa）转录组数据显示，在盐胁迫下，耐盐型青花45的差异表达基因明显多于敏盐型碧玉春花，且半乳糖胺醇合成酶和可溶性蛋白合成的增加有助于大白菜适应盐胁迫^{［参考文献 16

百度学术}16］。

蓖麻是原产于非洲的一种多年生草本植物，是世界十大油料作物之一，其籽粒的出油率达到了45%~55%^［

17］。蓖麻油的衍生物现已被广泛应用于工业、机械制造业和美妆行业等，如涂料、润滑剂和化妆品等^{［参考文献 18

百度学术}18］。蓖麻还与红花（Carthamus tinctorius）和鹰嘴豆（Cicer arietinum）共同被列为世界三大耐旱作物，有着极强的耐旱性^{［参考文献 19

百度学术}19］。此外，蓖麻不与粮食作物竞争土地，可以在许多贫瘠的土地上生长，例如在盐碱、干燥和重金属污染的土壤中均表现出良好的适应能力，有效地解决了我国耕地面积不足的现状^{［参考文献 4

百度学术}4］。但是，蓖麻作为双子叶植物，在幼苗阶段易受细菌感染和盐胁迫的危害，导致幼苗存活率降低^{［参考文献 20

百度学术}20］。因此，借助转录组学研究蓖麻幼苗耐盐相关的代谢途径，了解蓖麻响应盐胁迫的分子调控机制，挖掘蓖麻耐盐的优良基因，对使用分子育种手段培育蓖麻耐盐新品种具有重要意义。

1 材料与方法

1.1 材料处理及生理指标测定

试验材料通篦5号由通辽市农业科学院提供，该品种是由哲ImAB₃（母本）和哲蓖2号（父本）杂交，通过系谱法培育而来，是我区主推的经济作物品种，在自然条件下，枯萎病率（约0.1%）和田间倒伏率（平均0.2%）均低，种子的含油量（50.53%）和种子产量（最高可达3484.50 kg/hm²）较高，且比其他品种有较强的抗寒和耐盐碱能力。本研究将籽粒饱满的通篦5号种子在28 ℃催芽后，挑选发芽整齐一致的种子均匀地摆放在发芽盒（规格32 cm×25.5 cm×12 cm）中，在25℃、16 h光照/8 h黑暗（450 μmol/m²·s）、相对湿度70%～75%的光照培养箱中培养，待2片子叶完全展开后开始浇灌1/2 霍格兰营养液，至4叶龄，对幼苗进行300 mmol/L NaCl（1/2霍格兰营养液配制）胁迫处理0、2、4、8、12、24、30和48 h，以未处理（0 h）的幼苗作为对照。分别剪取不同时间处理的相同位置幼苗真叶，并迅速置于液氮罐中存放6 h，然后存于- 80℃冰箱中备用。游离脯氨酸（FP，free proline）含量和超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）活性分别采用茚三酮比色法和氮蓝四唑（NBT，nitro-blue tetrazolium）法测定。3株幼苗的叶片计为1次生物学重复，每个处理重复3次。

1.2 植物总RNA提取、文库构建及测序

使用Total RNA Extractor（Sangon）试剂盒提取植物的总RNA，使用Qubit2.0 RNA检测试剂盒（Life）在Qubit2.0荧光计（Invitrogen）上检测RNA浓度及纯度。将按照时间梯度处理的0、12和24 h这3个时间点的RNA样品分别命名为S0 h、S12 h和S24 h，处理间的3次重复样品分别命名为S0 h-1～S0 h-3、S12 h-1～S12 h-3和S24 h-1～S24 h-3。cDNA文库的构建、质控和测序（Illumina Novaseq 6000）部分由上海生工生物公司完成。

1.3 数据处理、功能注释及差异转录因子筛选

将原始数据经过FastQC评估过滤后，使用Trimmomatic删除含有接头和低质量的序列，得到高质量的Clean reads。使用HISAT2将Clean reads映射到蓖麻的参考基因组（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/？term=Ricinus+communis%5Borgn%5D），统计Mapping信息并评估样品数据质量。使用StringTie（http：//www.ccb.jhu.edu/software/stringtie/）对中靶基因组的序列进行组装，然后利用GffCompare软件与蓖麻的基因组进行比较，发现新的转录区域。使用Hmmer 3.0软件和Pfam（http：//pfam-legacy.xfam.org/）数据库将新基因的编码氨基酸序列进行比对，得到新转录本的注释信息。基因的表达水平直接体现着其转录本的丰度情况，基因的表达量与转录本丰度成正比。为了使基因间和样本间的基因表达水平拥有可比性，使用TPM（Transcripts per million）算法统计单个转录本在RNA池中的比例，计算公式如下：

T P M_{i} = \frac{X_{i}}{L_{i}} \times \frac{1}{\sum_{j} \frac{X_{j}}{L_{j}}} \times 10^{6}

式中 $X_{i}$ 代表总外显子片段/读数， $L_{i}$ 代表外显子长度/kb。|log₂FC| ≥1 且 qValue < 0.05为筛选标准，使用DESeq2筛选出差异表达基因。使用GO和KEGG数据库对差异表达基因进行功能注释和代谢通路富集分析，P值为0.05。

根据PlantTFDB（planttfdb.gao-lab.org）释放的蓖麻转录因子信息，使用Blastn程序将差异表达基因（DEGs，differentially expressed genes）与转录因子的CDS序列进行比对，获得对应差异表达转录因子的基因ID，E-value值设置为1e^-10。使用Excel 2021进行数据统计，SPSS 26.0进行显著差异分析；利用Hiplot（https：//hiplot-academic.com/）科研绘图工具和微生信（http：//www.bioinformatics.com.cn/）绘制气泡富集图；TBtools软件绘制差异表达基因热图。

1.4 qRT-PCR验证

植物总RNA的提取同1.2，取1 μL反转录成单链cDNA并稀释10倍作为PCR扩增的模板，按照2× SG Fast qPCR Master Mix的说明书操作步骤，在LightCycler480 II型PCR仪上完成对基因的扩增。反应程序为：预变性95℃ 3min；变性95℃ 5 s，退火和延伸59℃30 s，45个循环。以RcActin（NC_063262.1）基因作为内参基因，用2 ^{-（∆∆Ct）}法计算基因的相对表达量。为了测量结果的可靠性，每个样品进行了3次生物学重复和3次技术重复，引物的设计使用Primer Premier 5软件，引物的合成委托生工公司，序列详见表1。

表1 试验所需引物

Table 1 Primers required for test

引物名称 Primer name	描述 Description	正向引物序列（5'-3'） Forward primer sequence （5'-3'）	反向引物序列（5'-3'） Reverse primer sequence（5'-3'）
LOC8268921	可能的锌金属蛋白酶EGY3	TGTTCTGTGTTTGGCTTGGG	TGGGGAAAAGGGTGAGGAAA
LOC125370484	谷胱甘肽转移酶U7-like	GTCACAGAGTCGAACTTGCC	TGACCCAATGCTCTCACCTCC
LOC8289823	异柠檬酸脱氢酶［ NADP ］	GATTACTCGCCATGTCCAGC	AGAAGAGAAAGCGAGGCGAT
LOC8270317	半胱氨酸蛋白酶抑制剂5	TCCGCAATCTTTCTCCTGGT	AGAACCTTCCCAACTCCTGC
LOC8263265	番茄红素异构酶	CCCCAATGTCCTTCCCTCTT	GTCATCGACCAACAGAGTGC
LOC8268009	GAST1蛋白	TGATGATGAGGAAGGCAAGC	AGCACAACACTTTTGGCAGA
LOC8276068	β -淀粉酶3	AATCAAGCCATCATGCCGTC	GCAGCATCACAAACACTGGA
RcActin	β-内参	TCCCTCAGTACGTTCCAGCA	CACCTCCATACTCCTCCCT

2 结果与分析

2.1 盐胁迫下蓖麻叶片生理指标测定及表型观察

由图1可知，随着盐胁迫时间的延长，通篦5号幼苗叶片的SOD酶呈现出先升高后降低的趋势，在处理12 h时酶活性最高，较0 h提高了96.98%；游离脯氨酸含量同SOD酶活性的趋势一致，也在12 h时达到最大值，较0 h增加了61.18%。而胁迫后表型图片显示（图1C），叶缘在12 h和24 h较0 h干枯，且叶面萎蔫，表明植株受损伤严重。因此，选取胁迫12 h和24 h的蓖麻叶片进行后续转录组测序。

图1 蓖麻叶片生理指标测定及表型观察

Fig.1 Physiological index measurement and phenotypic observation of castor leaf

柱子上方字母表示在P<0.05水平差异显著

The letters above the column indicate a significant difference at P<0.05 level

2.2 盐胁迫下蓖麻幼苗的转录组分析

对通篦5号盐胁迫处理3个时间梯度的9个RNA样品经Illumina测序后，共得到65.05 Gb的Clean bases，每个文库的Clean reads在39，936，016条以上，Q30均超过93.45%，说明碱基识别的准确性较高。在HISTA 2对Clean reads组装和拼接后，映射到蓖麻基因组的Reads比例为94.97%～98.40%，这些Reads比对到基因组中的单个位置的比例为86.49%～95.30%。将处理0 h、12 h和24 h的RNA样品分别命名为S0 h、S12 h和S24 h，利用Pearson相关性评估样本时发现，S0 h的3次生物学重复间的相关系数分别为0.99、0.97和1，S12 h的3次生物学重复间的相关系数分别为1、0.87和0.9，S24 h的3次生物学重复间的相关系数分别为0.99、1和0.99，相同处理下Pearson相关系数均大于0.8，说明3次生物学重复是可靠的、可重复性较高（图2）。综合以上数据，9个样品的测序结果到达了后续生物学分析要求。

图2 不同盐胁迫时间点转录组间的Pearson相关分析

Fig. 2 Pearson correlation analysis between transcription groups at different salt stress time points

S0 h、S12 h和S24 h分别表示盐胁迫处理0 h、12 h和24 h，-1、-2和-3则分别表示3次生物学重复，下同

S0 h， S12 h， and S24 h represent salt stress treatments at 0 hours， 12 hours， and 24 hours， respectively， while -1， -2， and -3 represent three biological replicates， the same as below

2.3 盐胁迫下差异表达基因筛选及共表达模式分析

根据DESeq2筛选结果，在盐胁迫处理S12 h和S24 h分别鉴定出4822和3103个差异表达基因（相较于S0 h），并且随着胁迫时间的延长上调表达的差异表达基因数目远多于下调表达的差异表达基因数目（图3）。在盐胁迫处理S12 h和S24 h的上调表达基因分别有3298和1609个（相较于S0 h），下调表达基因分别有1524和1494个。在S12 h-vs-S0 h 和S24 h-vs-S0 h有分别独立上调表达的2168和479个基因、分别独立下调表达的778和748个基因，这些基因可能在蓖麻幼苗遭受盐胁迫的早期和后期发挥特定作用（相较于S0 h）。

图3 蓖麻盐胁迫差异表达基因的韦恩图

Fig. 3 Venn diagram of DEGs in castor salt stress

A：上调表达基因的韦恩图；B：下调表达基因的韦恩图；数字表示差异表达基因的数量。S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h分别表示盐胁迫12 h和24 h相较于0 h的差异表达基因，下同

A： Venn diagram of up-regulated genes； B： Venn diagram of down-regulated genes； the numbers indicate the number of DEGs. S12 h-vs-S0 h and S24 h-vs-S0 h represent differentially expressed genes at 12 h and 24 h under salt stress compared to 0 h， respectively， the same as below

对S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h共有的1130个上调表达基因和746个下调表达基因进行共表达模式聚类分析，依据不同盐胁迫处理梯度时间的TPM表达值，绘制这些差异表达基因的不同表达模式（图4）。共有基因的表达模式可以被聚为3类（图4a），上调的基因表达模式可以分为2类，A类与C类，分别有412和746个基因，它们均在0~12 h上调表达，但C类的基因对盐胁迫更敏感，在12~24 h下调表达的幅度比A类大；下调的基因表达模式为B类，这类基因在S0 h有表达峰值，随着盐胁迫时间的增加表达量均低于S0 h（图4b）。差异表达基因的共表达模式分析表明，蓖麻幼苗在响应盐胁迫的过程中存有复杂的调控机制。

图4 差异表达基因的共表达模式分析

Fig. 4 Analysis of DEGs co-expression patterns

a：共有差异表达基因表达聚类；b：共有差异表达基因表达模式

a： Common DEGs expression clustering； b： common DEGs expression patterns

2.4 差异表达基因的功能注释和富集分析

使用KEGG数据库识别蓖麻幼苗盐胁迫反应过程中的关键途径。在盐胁迫处理S12 h-vs-S0 h，识别到1037个差异表达基因被分配到250个途径，其中缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解（ko00280： Valine， leucine and isoleucine degradation）和植物昼夜节律调控（ko04712： Circadian rhythm - plant）显著富集；在S24 h-vs-S0 h有692个差异表达基因被分配到262个代谢通路，其中淀粉和蔗糖代谢（ko00500： Starch and sucrose metabolism）和缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解显著富集（图5）。此外，在蓖麻幼苗遭受盐胁迫的0~24 h中，植物昼夜节律调控通路（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230506002，附表1）和植物-病原相互作用（ko04626： Plant-pathogen interaction）（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230506002，附表1）通路中富集了较多的差异表达基因，推测这些差异表达基因可能在蓖麻的盐胁迫适应过程中起到了关键作用。

图5 蓖麻盐胁迫的KEGG富集途径

Fig. 5 KEGG enrichment pathways of castor under salt stress

为深入了解差异表达基因的功能，当校正后的P值<0.05时，将不同处理间的差异表达基因分配到GO条目，分别富集到183（S12 h-vs-S0 h）和299（S24 h-vs-S0 h）个条目。在生物过程（BP，biological process）、细胞成分（CC，cellular component）和分子功能（MF，molecular function）这3类中，BP所占比例最多，在S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h中分别占61.2%（112个）和54.8%（164个）。而在BP的亚类中，细胞进程（GO：0009987， Cellular process）在S12 h-vs-S0 h中富集差异表达基因条数最多，响应非生物胁迫过程（GO：0009628， Response to abiotic stimulus）在S24 h-vs-S0 h中富集差异表达基因条数最多；MF的亚类中催化活性（GO：0003824， Catalytic activity）在2个时间段均富集差异表达基因条数最多（图6）。

图6 蓖麻差异表达基因的GO富集分析

Fig. 6 GO enrichment analysis of castor DEGs

2.5 差异表达转录因子的分析

在差异表达基因中共鉴定出19个包括WRKY、NAC、AP2/ERF、bZIP、MYB、bHLH和其他转录因子，其中WRKY和AP2/ERF家族基因数量最多，均有3个基因参与蓖麻幼苗盐胁迫的响应（图7）。这些转录因子中有68.4%（13个）在S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h是上调表达的，除ERF109（LOC8275304）在0~24 h持续上调表达，其他12个转录因子均在S12 h有表达峰值，说明这些转录因子是被盐胁迫转录激活而不是被抑制且在盐胁迫早期就积极响应。WRKY31、WRKY24和WRKY75的表达量在盐胁迫处理12 h迅速攀升，表明3个WRKY转录因子参与蓖麻幼苗对于盐胁迫的反应。有31.6%（6个）的转录因子在胁迫处理24 h（相较于S0 h）是下调表达的，表明这些转录因子在盐胁迫下的转录是受到抑制的。因此，这19个转录因子在蓖麻幼苗的耐盐机制中可能发挥着重要作用。

图7 蓖麻转录因子表达热图

Fig. 7 Transcription factor expression heat map of castor

2.6 植物激素信号转导过程中差异表达基因的表达模式

植物激素信号转导产生的一些复合物参与了盐胁迫反应。因此，根据富集到植物激素信号转导（ko04075： Plant hormone signal transduction）过程中上调表达的差异表达基因绘制表达热图（图8）。结果如下，42个基因中均有97.6%分别在S12 h（除LOC8288491 AHP1_ARATH）和S24 h（除LOC8271170 IAA32）上调表达（相较于S0 h），其中生长素信号和脱落酸信号中的基因数目最多，分别有11和10个基因。另外，bZIP23（LOC8275294）、PP2C 51（LOC8274369）、GID1C（LOC8288487）、TIFY 10B（LOC8260450）和TIFY 10A（LOC8259079）在S12 h和S24 h（相较于S0 h）是持续上调表达的，说明这些基因在蓖麻幼苗的盐胁迫反应中被积极诱导表达，参与盐胁迫反应。

图8 植物激素信号转导过程中差异表达基因的表达模式

Fig. 8 The expression pattern of DEGs in plant hormone signal transduction

2.7 蓖麻盐胁迫下差异表达基因分析

2.7.1 光合作用途径相关的差异表达基因分析

高等植物在遭受盐胁迫后会降低光合速率减少水分的流失以缓解环境压力，细胞色素b6/f复合体（Cytochrome b6/f complex）、ATP合酶（ATP synthase）、光系统Ⅰ（PSⅠ，Photosymbol Ⅰ）和光系统Ⅱ（PSⅡ，Photosymbol Ⅱ）等元件共同组成了光合电子传递系统，因此分析蓖麻盐胁迫下差异表达基因的表达情况，能够为渗透胁迫、离子毒害和糖分积累等反馈抑制机制提供参考（图9）。结果共统计到22个与光和电子传递系统相关的差异表达基因，且这些基因均是下调表达的，其中与光合产物电子传递（Photosynthethic electron transport）和PSⅡ相关的差异表达基因较多，分别有7和11个基因（图9A）。另外，有4个基因在组间均差异表达（图9B），包括编码PetF相关基因LOC8267738、ATPF1D相关基因LOC8282133、Psb28相关基因LOC8266704和PsbS相关基因LOC8274074，其中LOC8274074是持续下调表达基因，LOC8282133在盐胁迫S12 h时差异表达倍数最大。综上，在盐胁迫下蓖麻中与光合作用相关基因的表达是被抑制而不是被激活。

图9 参与光合作用途径的差异表达基因分析

Fig. 9 DEGs analysis involved in photosynthesis pathway

A：参与光和电子传递的差异表达基因统计；B：差异表达基因不同处理间的韦恩图；C：共有差异表达基因的差异表达倍数线图；图中down表示基因的差异表达倍数<1，下调表达

A： DEGs statistics involved in light and electron transport； B： The venn diagram of DEGs between different treatments； C： Differential expression fold line of common DEGs； The term down in the figure represents the fold change in gene expression， which is less than 1， indicating downregulated expression

2.7.2 抗氧化调节相关的差异表达基因分析

高等植物在受到盐胁迫后会使体内活性氧（ROS）消除系统被激活，导致参与编码过氧化氢酶（CAT，catalase）途径、过氧化物酶（POD，peroxidase）途径、谷胱甘肽过氧化物酶（GPX，glutathione peroxidase）途径、抗坏血酸-谷胱甘肽（AsA-GSH，ascorbate-glutathione）循环途径和过氧化物酶/硫氧还蛋白（PrxR-Trx，sulfiredoxin peroxiredoxin）等途径的基因被激活表达。因此，分析了与抗氧化调节相关的差异表达基因（图10）。共筛选出29个差异表达基因参与ROS消除，其中参与POD途径和谷胱甘肽-S-转移酶（GST，glutathion-S-transferase）途径的差异表达基因最多，分别有15和14个差异表达基因参与盐胁迫（图10A、B），在盐胁迫S12 h的差异表达基因多于S24 h，且多数基因是下调表达的，说明通蓖5号在盐胁迫早期敏感。此外，分别有13和7个基因分别在S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h独立表达，有5个基因在S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h共同上调表达，其中参与GTS途径的LOC125370484基因是持续上调表达的，有4个基因在胁迫S12 h和S24 h（相较于S0 h）下调表达，其中参与POD途径的LOC8258320基因是持续下调表达的（图10B），且这2个基因的差异表达倍数在同表达模式基因中最高（图10C），说明调控GTS和POD合成基因在蓖麻盐胁迫过程中非常重要。

图10 抗氧化调节相关的差异表达基因

Fig. 10 Antioxidant regulation related DEGs

A：抗氧化酶数量统计；B：差异表达基因不同处理间的韦恩图；C：共有差异表达基因的差异表达倍数线图；图中up和down分别表示基因的差异表达倍数>1和<1，分别表示上调表达基因和下调表达基因，下同

A： Antioxidant enzyme quantity statistics； B： The venn diagram of DEGs between different treatments； C： Differential expression fold line of common DEGs. In the figure， the terms up and down represent the fold change in gene expression， with up indicating an increase in gene expression and down indicating a decrease in gene expression， the same as below

2.7.3 Na⁺、K⁺和Ca²⁺转运相关的差异表达基因分析

本研究共筛选出33个参与Na⁺、K⁺和Ca²⁺转运相关的差异表达基因，其中参与K⁺和Ca²⁺转运的差异表达基因较多，参与Na⁺转运转运的基因较少（图11）。在S12 h-vs-S0 h和S24 h-vs-S0 h组间独立上调表达基因分别有8和3个，独立下调表达基因分别有7和3个；组间共同上调和共同下调表达基因分别有10和2个，其中与Ca²⁺转运相关的LOC107260904和LOC8263392这2个基因在组间是持续下调表达的（图11B、C）。这些结果表明参与蓖麻幼苗在盐胁迫下Na⁺、K⁺和Ca²⁺转运相关的差异表达基因多数是被激活表达而不是被抑制表达，且在胁迫S12 h的差异表达倍数要高于胁迫S24 h（相较于S0 h）（图11C）。

图11 参与Na⁺、K⁺和Ca²⁺转运相关的差异表达基因

Fig. 11 DEGs involved in Na⁺， K⁺ and Ca²⁺ transport

A：Na⁺、K⁺和Ca²⁺相关的差异表达基因数量统计；B：差异表达基因不同处理间的韦恩图；C：共有差异表达基因的差异表达倍数线图

A： Statistics of DEGs related to Na⁺， K⁺ and Ca²⁺； B： The venn diagram of DEGs between different treatments； C： Differential expression fold line of common DEGs

2.8 qRT-PCR验证

为验证转录组测序（RNA-seq）结果的可靠性，筛选了4个持续上调表达的差异表达基因和3个持续下调表达的差异表达基因进行qRT-PCR验证，基因的相对表达量以胁迫0 h作为对照组。结果显示，qRT-PCR与RNA-seq两者表达趋势一致，表明RNA-seq的试验结果是可靠的（图12）。

图12 差异表达基因的测序与qRT-PCR验证结果

Fig. 12 Sequencing and qRT-PCR validation results of DEGs

3 讨论

蓖麻苗期遭受盐胁迫会对植株的根和叶片等组织造成损伤，出现发育迟缓现象，阻遏了其发挥实际的遗传潜力^［

21］。目前，蓖麻耐盐性的研究主要集中在与盐胁迫相关的生理参数的比较上，对其耐盐性分子机制的研究相对较少^{［参考文献 21-22}21-22］。而伴随蓖麻基因组数据的释放，多组学技术已经广泛被应用于蓖麻盐胁迫的研究中^{［参考文献 23-24}23-24］。Wang等^{［参考文献 21

百度学术}21］通过对盐胁迫（100 mmol/L NaCl）下ZB306的转录组学及组蛋白甲基化联合分析发现，盐处理组相较于对照组共筛选出741个差异表达基因（|log₂FC| ≥2； qValue < 0.05），多数基因表达被激活而不是被抑制，且这些差异表达基因的功能多集中在激素信号转导、光合作用、氧化磷酸化、淀粉和蔗糖代谢等通路；Lei等^{［参考文献 24

百度学术}24］通过对野生蓖麻品种和栽培品种（通篦5号）在不同浓度盐胁迫（0、50和100 mmol/L NaCl）处理下的比较转录组学分析显示，两个蓖麻品种在盐胁迫下产生的上调表达基因数目均多于下调表达基因，差异表达基因的KEGG分析结果显示，碳代谢、激素信号转导与淀粉和蔗糖代谢等通路被显著富集。Li等^{［参考文献 25

百度学术}25］认为，100 mmol/L和200 mmol/L NaCl属于低盐胁迫，而300 mmol/L NaCl则属于高盐胁迫。本研究旨在研究高盐胁迫对通篦5号基因表达及代谢通路的影响。结果显示，下调表达基因数目明显少于上调表达基因数目，表明多数基因在盐胁迫下是被激活表达的（图3）；差异表达基因的功能预测结果显示，淀粉和蔗糖代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解显著富集（图5），这与前人研究结果相似^{［参考文献 23-25}23-25］。

3.1 参与蓖麻盐胁迫的差异表达基因

在盐胁迫下植物会产生一系列的细胞反应和分子机制从而缓解或抵消损伤^［

5-9］。转录因子作为植物中一种结构特殊的、调节基因表达的蛋白质分子，其家族成员在植物的盐胁迫应答过程中有着中枢调节和分子开关的功效，如WRKY、NAC、AP2/ERF、bZIP、MYB、bHLH等家族基因会通过直接或间接表达来减轻植株的受损伤程度^{［参考文献 26-30}26-30］。研究发现，过表达WRKY75基因的杨树（Populus）对盐胁迫和渗透胁迫的敏感性强于野生型，且WRKY75基因降低了胁迫下活性氧清除和脯氨酸积累的能力，并且正向调节叶片失水率^{［参考文献 26

百度学术}26］；Gupta等^{［参考文献 27

百度学术}27］为了研究盐胁迫处理对番茄（Lycopersicon esculentum）基因表达和抗氧化活性酶的影响，利用qRT-PCR检测了ERF（SlERF80）和WRKY（SlWRKY31和SlWRKY39）家族基因在盐胁迫（0、10和100 mmol/L NaCl）下的表达能力，结果发现SlERF80、SlWRKY31和SlWRKY39均被诱导表达，且在10 mmol/L浓度下表达活性最强烈，说明这些基因积极地参与番茄对于盐胁迫的响应。另外，过表达PalERF109基因正向调节了转基因杨树的耐盐性^{［参考文献 28

百度学术}28］；OsERF1和OsERF113作为OsSTAP1在盐胁迫调控过程中的下游表达基因，可以提高胁迫过程中的抗氧化酶活性，是增强盐胁迫耐受性的正向调节剂^{［参考文献 29-30}29-30］。相似的是，本研究同样发现了包括WRKY75（LOC8269203）和WRKY31（LOC8285898）在内的3个WRKY家族成员、ERF109（LOC8275304）和ERF113（LOC8285692）在内的3个AP2/ERF家族成员参与蓖麻幼苗盐胁迫响应（图7）。

研究发现，盐胁迫诱导产生的自由基可以通过提高抗氧化酶活性的方式加以清除，从而消除细胞和组织的氧化损伤^［

31-33］。编码抗氧化酶相关基因在清除自由基的过程中起着至关重要的作用，如Luo等^{［参考文献 31

百度学术}31］发现过表达GhSOD1和GhCAT1能够提高棉花（Gossypium spp）植株在盐胁迫下的适应能力，并且共表达GhSOD1和GhCAT1比单独过表达GhSOD1和GhCAT1的植株对盐胁迫的耐受性更强，说明编码SOD和CAT的基因可以相互协作提高植株的耐盐能力；Yan等^{［参考文献 32

百度学术}32］发现过表达CuZnSOD和APX基因在盐敏感型甘薯（Dioscorea esculenta）品种内会增强其耐盐性，且野生型甘薯的根在盐胁迫下较转基因植株发育明显迟缓，且胁迫下的CuZnSOD和APX基因表达量较野生型甘薯显著提高，说明编码SOD和APX基因的上调表达会缓解植株损伤；Qi等^{［参考文献 33

百度学术}33］研究表明转GST基因的拟南芥（Arabidopsis thaliana）中GST和GPX酶活性显著提高，并且在盐胁迫下种子的萌发率和幼苗的耐盐性均得到改善，所以抗氧化酶活性与盐胁迫的适应性密切相关。本研究分别发现了1个编码SOD（LOC8276651）和CAT（LOC8273613）相关基因，并且在盐胁迫早期均上调表达，可能会共同协作来抵御盐胁迫；1个编码GPX（LOC8264294）基因被发现且在盐胁迫的0~24 h保持着较高的表达水平；还鉴定到多个差异表达的编码GST相关基因（图10），推测这些基因的表达会提高蓖麻幼苗的盐胁迫适应能力，这与前人研究结果相似^{［参考文献 31-33}31-33］。

研究表明，K⁺的含量是决定高等植物在高Na⁺环境中生存的关键因素，耐盐植物的主要特征之一就是对K⁺吸收的亲和力高于Na^+［34］。本研究中蓖麻幼苗在盐胁迫下与合成K⁺转运体相关的基因要远多于合成Na⁺转运体相关的基因，且在胁迫前期鉴定到的差异表达基因多于胁迫后期，因此推测蓖麻在盐胁迫下会诱导合成K⁺转运体相关基因的表达来提高对K⁺的亲和力，进而减缓细胞内外的渗透压失衡速率，从而降低蓖麻在盐胁迫下的损伤。Ca²⁺可以通过SOS途径和MAPK途径降低植物本身的Na⁺含量从而维持细胞的渗透压，其作为植物遭受盐胁迫的重要信号，胁迫下Ca²⁺含量会增加^［

14］。本研究发现多个Ca²⁺转运ATP酶合成基因，推测这些基因的差异表达是造成盐胁迫下Ca²⁺含量增加的主要原因。

3.2 参与植物昼夜节律调控通路的差异表达基因

植物昼夜节律调控又被称为植物生物钟调控，在应对非生物胁迫如盐、低温和缺水等环境时会诱导生物钟调控基因的表达来缓解压力^［

35］。开花时间调节因子（GI，GIGANTEA）作为植物昼夜节律调控通路中的关键因子，是连接植物不同生育时期发育和环境应激表达网络的枢纽^{［参考文献 36-37}36-37］。Ke等^{［参考文献 36

百度学术}36］过表达PagGIs基因发现PagGIs使转基因拟南芥的开花提前，并提升了植株对盐胁迫的敏感性；而经过RNAi干扰处理的杨树PagGIs基因则下调表达，这反而提升了杨树的生物量，植株的长势和盐胁迫适应能力均被增强。同样地，本研究鉴定到了1个GI基因LOC8283208，其在12 h的差异表达倍数高于24 h，说明蓖麻幼苗在12 h对盐胁迫响应最敏感，而随着胁迫时间的增加，多基因相互协作会缓解盐胁迫压力，LOC8283208基因的表达量也随之减少，因此，LOC8283208基因也可作为反映蓖麻遭受盐迫害程度的靶标基因（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230506002，附表1）。拟南芥假反应调节因子（PRRs，two-component response regulator）是生物钟通路中的一种转录激活剂，多个PRRs基因的突变会产生对非生物胁迫耐受的表型^{［参考文献 37

百度学术}37］。本研究鉴定到了1个转录活性被激活的基因LOC8271709和1个转录活性被抑制的基因LOC8264789参与蓖麻幼苗的盐胁迫响应（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230506002，附表1）。

3.3 参与植物-病原相互作用的差异表达基因

热休克蛋白HSP90（Heat shock protein90）作为真核细胞生理和应激条件下调节蛋白质平衡的关键分子伴侣，介导植物的非生物胁迫和生物胁迫抗性^［

38］。现已报道拟南芥的HSP90基因在热胁迫和盐胁迫下的表达量增加^{［参考文献 39

百度学术}39］，而小麦的HSP90基因遭受冷胁迫后下调表达^{［参考文献 40

百度学术}40］，Haxim等^{［参考文献 40

百度学术}40］通过转录组学测序发现马齿苋（Portulaca oleracea）胁迫后HSP90基因积极参与植物-病原相互作用通路。本研究发现有2个HSP90基因（LOC8264649、LOC8273552）参与蓖麻幼苗盐胁迫下的植物-病原相互作用通路，并且相较于S0 h在S12和S24 h均是上调表达的（表4），这与前人研究结果一致^{［参考文献 39-40}39-40］。

3.4 参与植物激素信号转导过程的差异表达基因

研究表明，植物激素信号转导过程中的相关基因也积极地参与植物的盐胁迫反应^［

41］。例如，脱落酸（ABA，abscisic acid）作为一种胁迫响应类激素，可迅速识别盐胁迫并积累ABA从而缓解压力^{［参考文献 41

百度学术}41］。核细胞质受体PYR/PYL/RCAR（Pyrabactin resistance/Pyrabactin resistance-like/Regulatory component of ABA receptor receptors）、2型蛋白磷酸酶（PP2C，protein phosphatase 2C）和SNF1相关蛋白激酶（SnRK2，sucrose non-fermenting-1-related protein kinase 2）被认为是ABA信号通路中的核心成分^{［参考文献 42

百度学术}42］。植物在盐胁迫下ABA通路被激活，ABA快速积累并结合PYR/PYL/RCAR抑制PP2CS的活性，PP2CS的失活会激活SnRK2s的转录，SnRK2s会调节ABA响应基因的表达最终调节植物在胁迫下的生理过程^{［参考文献 43

百度学术}43］。本研究检测到蓖麻PP2CS、bZIP和SnRK2s基因上调表达，揭示ABA信号转导与蓖麻的盐胁迫响应有关（图8）。

生长素（Auxin）作为一种促生长激素，在盐胁迫下Auxin转运蛋白AUX1和PIN1/2的定位会发生改变，根组织的Auxin会发生极性运输，Auxin积累量减少，根生长速度会减缓，使植物在盐环境中生存^［

44］。在蓖麻幼苗叶片中检测到4个IAA基因、4个SAUR基因和1个GH3基因等Auxin应答基因，且在盐胁迫反应中均上调表达（图8），推测这些基因在叶片中的积累与根组织的极性运输有关，耐盐性可能与蓖麻的生长受到抑制有关。

油菜素类固醇（BRs，brassinosteroids）是一组植物类固醇激素，参与植物的细胞分裂和伸长、生殖发育、光形态建成、叶片的衰老和各种胁迫反应^［

45］。内源BRs含量的增加在盐胁迫和干旱胁迫中有着积极的作用，Krishna^{［参考文献 46

百度学术}46］发现增强拟南芥中的BRs信号活性可以提高在盐胁迫中的耐受性，BRs缺陷的突变体植株DET2-1表现出对盐胁迫极度敏感且植株生长受到抑制，外源喷施BRs可减轻这种影响^{［参考文献 47

百度学术}47］。Xu等^{［参考文献 48

百度学术}48］发现油菜素类固醇反应性木葡聚糖内转葡糖基化酶/水解酶19和23（XTH19和XTH23）过表达降低了拟南芥中ROS的积累，减轻了盐胁迫下植株的氧化损伤，增强了植株耐盐性。本研究在BR信号转导过程中发现了2个XTH上调表达基因（图8），推测其参与蓖麻盐胁迫过程中ROS的清除。此外，2个上调表达的BSK基因也被鉴定出来（图8），前人研究发现BRI1或BSK5基因的表达能够降低叶片的气孔导度从而适应盐胁迫环境，而BRI1或BSK5基因的缺失导致植物对盐胁迫不耐受^{［参考文献 49

百度学术}49］。

细胞分裂素（CK，cytokinins）调节着植物的细胞分裂、营养分配、叶片衰老、维管和茎分化等一系列发育过程^［

50］。研究发现，盐胁迫下植物根系中的CK合成及地上部分CK供应量的减少会改善胁迫带来的影响，表明CK在渗透应激反应中起负调控作用^{［参考文献 51

百度学术}51］。本研究检测到1个AHP同源基因LOC8288491和1个AHK3同源基因LOC8285483在盐胁迫后上调表达（图8），推测其上调表达可能会抑制CK信号转导，降低CK的合成，从而抑制蓖麻幼苗在盐胁迫下的生长。

乙烯（Ethylene）是一种气体植物激素，在植物的盐响应中有着重要作用^［

52］。据报道乙烯反应受体（ETR1/ETR2，ethylene receptor）、乙烯反应传感器（ERS1/ERS2，ethylene receptor single1/2）和乙烯不敏感4基因（EIN4，ethylene insensitive 4）在无乙烯的环境中是活跃表达的，转录因子EIN3作为盐胁迫下乙烯信号传导的关键成分，在转录水平下是被激活表达的，而且ESE1和ERF1作为EIN3的靶点基因在NaCl胁迫后表达水平也明显增加，表明EIN3基因是胁迫下的正向调节因子，且EIN3基因功能缺失的拟南芥植株表现出对盐环境的高敏感性^{［参考文献 53

百度学术}53］。本研究发现蓖麻EIN3基因（LOC8271154）在盐胁迫下表达量激增，EIN4基因（LOC8268200）转录表达攀升水平略低但均是上调表达的（图8）。乙烯含量的增加抑制着植物的生长，LOC8271154基因的高表达可能与蓖麻的耐盐性有关。

综上，本研究在通篦5号苗期盐胁迫过程中发现了多个响应盐胁迫的关键基因，均可以作为盐胁迫下优秀的靶标基因来探究蓖麻的盐胁迫响应机制。

4 结论

本研究对通篦5号在300 mmol/L NaCl 胁迫下进行RNA-Seq分析，在S12 h和S24 h（相较于S0 h）分别筛选出4822和3103个差异表达基因，其中上调表达的差异基因数目要高于下调表达的差异基因数目。功能注释和富集分析结果表明，差异表达基因主要富集在淀粉和蔗糖代谢以及缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸降解途径。此外，分别有19个转录因子、42个激素传导途径相关基因、29个参与ROS消除途径基因和33个与离子转运相关的基因，这些基因可能在蓖麻幼苗参与盐胁迫响应的过程中发挥重要作用。

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