大麻<bold>EST-SSR</bold>遗传结构分析及指纹图谱构建

边境; 王晓楠; 曹焜; 赵越; 王云云; 张晓艳; 孙宇峰; BIAN Jing; WANG Xiaonan; CAO Kun; ZHAO Yue; WANG Yunyun; ZHANG Xiaoyan; SUN Yufeng

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大麻EST-SSR遗传结构分析及指纹图谱构建 PDF

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黑龙江省科学院大庆分院，大庆 163319

最近更新：2023-10-31

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230531001

目录contents

摘要

大麻是一年生草本植物，一种多用途、可持续的作物。迄今为止，关于大麻遗传结构的研究还很少。本研究通过EST-SSR分子标记分析大麻的遗传多样性和种群结构。结果表明，20对引物共扩增出113个清晰条带，其中113个（100%）是多态性的；共检测到232个等位基因，平均每对引物检测到4.0176个等位基因；观测杂合度（Ho）平均为0.7102，期望杂合度（He）平均为0.6935；200个个体香农信息指数介于0.7204～2.4625之间，平均值为1.5368；多态信息含量（PIC）变化范围为0.3519~0.8801，平均为0.6558；平均基因流（Nm）平均值为13.6525。基于种群遗传结构、主成分分析和未加权的算术平均对组法（UPGMA）分析，将大麻材料聚类为3组。不同聚类方法之间结果相似，但3种模型的少数个体植株分布不同。聚类结果、基因多样性和遗传相似系数表明，大麻个体总体亲缘关系较为密切。同时用5对核心引物能够区分参试种质，并为每份种质构建了指纹图谱。研究结果为今后的大麻育种、遗传改良和核心种质资源收集提供了参考。

关键词

大麻; EST-SSR; 遗传多样性; 种群结构

大麻（Cannabis sativa L.），俗称汉麻，是一种草本植物，属于大麻科。它被认为是最古老的栽培植物之一，可用于多个应用领域，从农业和植物修复到食品、饲料、化妆品、建筑和制药行业。根据不同的应用领域，可以从大麻中获得各种具有工业价值的产品，例如纤维和碎屑，生物建筑和隔热材料，具有重要营养和功能特性的种子、面粉、油和具有药理学意义的生物活性化合物^［

1］。

遗传多样性是生物多样性的重要组成部分，是生态系统和物种多样性的基础^［

2-4］。了解种质资源的遗传多样性和结构有助于高效、合理地开发、保护和利用种质资源^{［参考文献 5-6}5-6］。目前，研究人员将多种作物的遗传多样性和种群结构研究作为重要的基础研究，并且开展了许多的相关研究。使用形态学和农艺学特征检测遗传变异，这些特征通常表现出受环境因素强烈影响的多基因遗传。除了环境差异外，地理隔离、系统地理学模式、基因流动和种群动态也会导致选择压力，从而导致空间结构遗传变异。由于基因组中基因的适应性变化，物种将在表型和物候方面进行适应性进化^{［参考文献 7-8}7-8］。然而，由于缺乏大量非模式物种的基因组信息，无法确定与逆境相关的多个候选基因。同时由于这些候选基因在其基因组的局部适应中起着重要作用，因此不容忽视^{［参考文献 9

百度学术}9］。分子标记分析有效地替代了形态学和农艺学特征分析。目前，最常见的遗传多样性分子标记包括SNP、RFLP、RAPD、ISSR、简单序列重复序列（SSR，simple sequence repeat）和AFLP^{［参考文献 10

百度学术}10］。

使用每种技术的选择受到诸如应用的难易程度、基因组覆盖率、成本和自动化兼容性等因素的影响。简单序列重复分子标记是共显性的，符合孟德尔定律。它操作简单，具有高度的重现性和可靠性，能够揭示子代和亲本之间不受基因表达、培养条件或环境条件影响的遗传差异，并且可以显示出大量的多态性^［

11-12］。SSR分子标记广泛应用于植物种质鉴定、遗传多样性、遗传连锁图谱构建、基因定位和克隆以及数量性状位点（QTLs）分析^{［参考文献 13-16}13-16］。由于表达序列标签（EST，expressed sequence tag）-SSR标记来自转录区域，因此它们具有很高的成功扩增率和相关基因注释^{［参考文献 17

百度学术}17］。使用 SSR 分子标记的遗传多样性分析已广泛应用于多种作物^{［参考文献 15

百度学术}15， 18-21］，如多年生黑麦草、紫花苜蓿和小麦。信朋飞等^{［参考文献 22

百度学术}22］利用SSR标记对大麻种质资源进行指纹图谱的构建。大量文献表明，SSR分子标记结果可以揭示近缘物种的亲缘关系，鉴定品种^{［参考文献 23

百度学术}23］。

表达序列标签是剖析复杂性状以及估计分子多样性和种群结构的基础^［

24］，SSR标记价格低廉且易于通过聚合酶链反应检测，因此作为有价值的分子标记被广泛应用于群体筛查。本研究基于前期开发的大麻EST-SSR分子标记^{［参考文献 22

百度学术}22］，筛选适用于大麻纤维用、籽用和花叶用类型及其种群遗传多样性和亲缘关系分析的核心引物，并构建指纹图谱，以期为大麻品种鉴定及种质创新提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料与DNA提取

试验材料为黑龙江省科学院大庆分院审定品种及搜集保存的200份大麻种质资源（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230531001，附表1），包括纤维用类型78份、籽用类型63份、花叶用类型59份。

表1 20条大麻EST-SSR引物的多态性分析

Table 1 Polymorphism analysis of 20 EST-SSR primers of Cannabis

引物 Primer	总条带数 TNB	多态性条带数 NPB	多态性条带百分比（%） PPB	等位基因数 Na	有效等位基因数 Ne	香农信息指数 I	观测杂合度 Ho	期望杂合度 He	多态性信息含量 PIC	遗传分化系数 Fst	基因流 Nm
E11	5	5	100	5	1.6361	0.7204	0.3015	0.3898	0.3519	0.0087	28.4476
E17	5	5	100	16	5.4226	1.8902	0.8200	0.8176	0.7901	0.0105	23.5450
E18	9	9	100	9	2.8520	1.2180	0.7700	0.6510	0.5842	0.0146	16.8654
E20	5	5	100	20	7.8965	2.3713	0.7739	0.8756	0.8620	0.0112	22.0531
E22	6	6	100	14	4.4984	1.8273	0.6550	0.7796	0.7530	0.0088	28.0691
E23	7	7	100	8	3.0620	1.2248	0.8400	0.6751	0.6083	0.0139	17.6978
E24	3	3	100	19	9.0166	2.4625	0.7889	0.8913	0.8801	0.0120	20.5975
E25	6	6	100	15	2.7707	1.5314	0.7300	0.6407	0.6133	0.0088	28.0020
E26	5	5	100	12	6.0606	2.0438	0.6900	0.8371	0.8170	0.0279	8.7112
E27	4	4	100	11	3.2549	1.4694	0.8000	0.6945	0.6560	0.0109	22.7555
E3	6	6	100	9	4.2465	1.5819	0.7300	0.7664	0.7254	0.0611	3.8401
E31	4	4	100	15	6.0146	1.9361	0.9050	0.8358	0.8120	0.0154	16.0308
E32	7	7	100	9	3.5470	1.4486	0.8342	0.7199	0.6751	0.0121	20.4881
E37	8	8	100	10	3.4583	1.4709	0.4900	0.7126	0.6683	0.0418	5.7290
E4	5	5	100	10	2.4153	1.1295	0.7424	0.5875	0.5131	0.0064	38.6339
E40	3	3	100	8	3.9149	1.4935	0.8550	0.7464	0.7015	0.0094	26.2232
E43	2	2	100	18	4.2055	1.9170	0.7839	0.7641	0.7414	0.0096	25.8443
E48	7	7	100	9	1.8701	0.9827	0.5350	0.4664	0.4374	0.0386	6.2266
E6	3	3	100	9	2.4977	1.2097	0.6784	0.6011	0.5493	0.0295	8.2317
E7	5	5	100	6	1.7120	0.8076	0.4800	0.4169	0.3757	0.0061	40.9830
均值 Mean	5.65	5.65	100	11.6	4.0176	1.5368	0.7102	0.6935	0.6558	0.0180	13.6525

TNB： Total number of bands； NPB： Number of polymorphic bands； PPB： Percentage of polymorphic bands

选取大麻叶片0.5 g，运用柱式植物组织基因组DNA抽提试剂盒（上海生工生物技术有限公司）提取DNA。-20℃保存备用。

1.2 EST-SSR引物设计及PCR扩增

从前期开发的EST-SSR引物中随机筛选出40对，由上海生工生物技术有限公司合成。随机选取8个品种的DNA混合样品，对SSR引物进行多态性筛选，筛选出条带清晰、稳定性好的20对引物用于所有材料的PCR扩增，引物序列详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20230531001，附表2。试验所用试剂均购自上海生工生物技术有限公司。

表2 3个大麻种质群的遗传多样性比较分析

Table 2 Comparative analysis of genetic variation for the three groups of Cannabis

群体 Population	样本数量 Sample size	等位基因数 Na	有效等位基因数 Ne	香农信息指数 I	观测杂合度 Ho	期望杂合度 He	多态性信息含量 PIC
纤用Fiber	78	8.90	3.9575	1.5014	0.7556	0.6930	0.6503
花叶用Floral leaf	63	7.60	3.5174	1.3756	0.6616	0.6580	0.6134
籽用Seed	59	9.65	4.0388	1.5545	0.7017	0.7015	0.6602
均值Mean		8.72	3.8379	1.4772	0.7063	0.6840	0.6413

PCR反应体系为25 μL，其中DNA （20~50 ng/μL）1μL，10×Taq Buffer（with MgCl₂）2.5 μL，引物（10 μmol/L）各0.5 μL，Taq酶（5 U/μL）0.2 μL，dNTP（mix）（5 μmol/L）0.5 μL，用dd H₂O补足。PCR扩增程序为 95 ℃ 5.0 min；94 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s， 30个循环；72 ℃延伸10 min。PCR扩增产物的片段大小采用QIAxcel高级毛细管电泳仪检测。

1.3 数据分析

利用BioCalculator软件通过计算各峰的峰数、峰高、峰宽、峰面积等特征，对扩增产物的单次数据进行准确分析。选用的多态性较好的5对引物（E-20、E-24、E-26、E-31、E-17）扩增出的DNA片段按从小到大的顺序排列，将分辨率高，条带清晰记为“1”，无条带或模糊条带记为“0”。

根据电泳结果，在凝胶相同迁移率位置上，有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，构成“0，1”序列数据阵。计算多态位点数及多态率，使用 Excel 2021计算多态性条带数（NPB，the number of polymorphic bands）和多态性条带百分比（PPB，the percentage of polymorphic bands）。GeneAlEx 6.51b2^［

25］软件转换各种文件格式进行不同分析，计算遗传多样性参数，包括等位基因数（Na，the number of alleles）、有效等位基因数（Ne，the effective number of alleles）、香农信息指数（I，Shannon’s information index）、基因流（Nm， gene flow）和遗传分化系数（Fst， the F-Statistic）。利用PIC Calc软件计算各引物多态性信息量（PIC， the polymorphic information content）。使用GeneAlEx 6.51b2软件进行遗传距离分析、主成分分析（PCoA），基于Nei的无偏遗传距离矩阵与 MEGA 5.1进行未加权的算术平均对组法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means）聚类分析^{［参考文献 26

百度学术}26］。

使用 STRUCTURE 2.3.4^［

27］软件分析种群遗传结构，使用基于模型的聚类算法实现贝叶斯框架和马尔可夫链蒙特卡罗（MCMC，markov chain monte carlo）算法。为了确定最佳的亚群数量（K），对范围从2到10的每个K值进行了5次独立运行^{［参考文献 28

百度学术}28］。每次运行都包含10，000步的老化期，然后是100，000次MCMC迭代。根据Evanno等^{［参考文献 29

百度学术}29］开发的模型，估计ΔK参数基于连续K值之间数据对数概率的变化率，以确定最佳K值。

2 结果与分析

2.1 简单序列重复标记的多态性

在PCR反应中，20对SSR引物对200个个体共扩增出113个位点，全部表现出多态性。每个引物组合的多态位点数量从2到9不等，平均为5.65个位点（表1）。20对引物的扩增片段大小不一，在100~300 bp之间变化。所有引物对均具有较高的基因多样性值，鉴定出较高水平的多态性。平均有效等位基因数（Ne）为4.0176个。同时共检测到232个等位基因，每个引物的平均等位基因数（Na）为11.6。引物还表现出较高的香农信息指数（I），200份大麻种质的香农信息指数介于0.7204～2.4625之间，平均值为1.5368。PIC及香农指数最高值均为引物E24。观测杂合度（Ho，observed heterozygosity）的变化范围为0.3015~0.9050，平均值为0.7102，期望杂合度（He，expected heterozygosity）在0.3898~0.8913之间，平均值为0.6935。基因流（Nm）平均值为13.6525，表明存在基因交流（Nm>1）。

2.2 不同种群遗传多样性分析

对3种类型参试群体进行遗传多样性指数分析，结果显示（表2），3个种群平均观测杂合度（Ho）为0.7063，期望杂合度（He）为0.6840，期望杂合度均小于观测杂合度，说明各种群内遗传多样性较高。籽用型群体的等位基因数（Na）为9.65 ，香农信息指数（I）为1.5545，期望杂合度（He）为0.7015，观测杂合度（Ho）为0.7017，PIC值为0.6602，均高于其他两个群体，说明籽用型群体遗传多样性与其他两个类型相比较高。

2.3 群体间的遗传距离和遗传相似度

将200份大麻材料按用途划分为3个种群进行遗传距离比较，如表3所示，3个种群间的遗传距离在0.0314~0.0805范围内，Nei's遗传一致性在0.9227~0.9691范围。籽用型种群与纤用型种群遗传距离最小，基于遗传距离构建的UPGMA聚类树也验证了籽用型与纤用型种群亲缘关系较近（图1）。同时分析3个种群的基因流和遗传分化系数（表4）观察到花叶用种群与其他种群的基因流相对较小，遗传分化系数较大，这可以解释为什么花叶用种群被单独归为一组。

表3 3个种群 Nei's 遗传一致度和遗传距离的无偏估计

Table 3 Unbiased estimation of Nei's genetic identity and genetic distance among three populations

群体

Population

纤用

Fiber

花叶用

Floral leaf

籽用

Seed

纤用Fiber

0.9227

0.9691

花叶用Floral leaf

0.0805

0.9392

籽用Seed

0.0314

0.0627

对角线上方为 Nei's 遗传一致度，对角线下方为 Nei's 遗传距离

Nei's genetic identity is above diagonal and genetic distance is below diagonal

图1 基于遗传距离构建的UPGMA聚类树

Fig. 1 UPGMA clustering tree based on genetic distance

表4 三个种群之间的基因流遗传分化系数

Table 4 Gene flow and genetic differentiation coefficient between the three populations

群体

Population

纤用

Fiber

花叶用

Floral leaf

籽用

Seed

纤用Fiber

8.036

40.137

花叶用Floral leaf

0.030

11.448

籽用Seed

0.011

0.021

对角线上方为基因流（Nm），对角线下方为遗传分化系数（Fst）

Above the diagonal is gene flow （Nm）， below the diagonal is the F-Statistics （Fst）

2.4 种群结构分析

通过UPGMA聚类分析、PCoA分析和遗传结构分析，进一步探讨了基于遗传距离的不同类群和亚类种质之间的关系。使用Structure 2.3.4软件分析了从200个大麻个体扫描的20个SSR引物对的标记。ln P （ K ）随着K的增加而不断变化，没有最大值，无法确定最佳亚群数（图2A）。根据Evanno等^［

29］的方法确定最佳分类号。当ΔK值随K值变化时，一个明显的峰值可以确定为最佳分类数（图2B）。当K=3时，划分为3个类群（图2C）。其中类群1（绿色）113份，主要为纤维型资源，类群2（红色）44份，花叶型资源居多，类群3（蓝色）43份，多为籽用型品种资源。

图2 200份大麻种群结构分析

Fig. 2 Population structure analysis of 200 industrial hemp samples

A： K值对K数的平均对数；B： K和ΔK的数量之间的关系；C：使用 STRUCTURE 2.3.4 软件（ K = 3）确定的大麻种群结构。横坐标数字代表资源序号和用途类型，1、绿色：纤用型；2、红色：花叶型；3、蓝色：籽用型

A： Average logarithm of K value to K number； B： The relationship between the quantities of K and ΔK； C： Population structure of industrial hemp determined using STRUCTURE 2.3.4 software （K = 3）. The horizontal number represents the resource serial number and type of use. 1， green： Fiber type； 2，red： Mosaic type； 3， blue： Seed type

UPGMA树状图表明，种质可以分为3个组群（图3）。200份大麻的聚类个体材料与种群遗传结构分析结果基本相符。基于UPGMA树状图，组群I主要为纤用型大麻资源，组群Ⅱ花叶型资源居多，组群Ⅲ主要为籽用型资源。

图3 基于UPGMA的200份大麻资源聚类分析

Fig. 3 Cluster analysis of 200 industrial hemp resources based on UPGMA

图中编号代表200份大麻个体（与附表1相对应）

The numbers in the figure represent 200 cannabis individuals （corresponding to schedule 1）

对200份大麻个体进行主成分分析（图4），图中位置的距离代表亲缘关系的距离。PCoA结果与UPGMA树状图和种群结构分析结果基本一致。3组大麻个体分布相对集中，表明它们之间的亲缘关系密切。

图4 200份大麻资源遗传多样性的主成分分析

Fig. 4 Principal component analysis of genetic diversity of 200 industrial hemp resources

2.5 指纹图谱的构建

经统计分析，5对引物在200份材料中共检测到25条清晰条带。将筛选出的5对核心引物E-20、E-24、E-26、E-31、E-17依次编号为A~E，依据5对引物扩增的多态性位点，按照指纹图谱构建方法为每一份材料建立SSR指纹图谱代码（表5）。

表5 200份大麻种质指纹图谱

Table 5 Germplasm fingerprints of 200 industrial hemp samples

编号 Code	指纹图谱 Fingerprints	编号Code	指纹图谱 Fingerprints	编号Code	指纹图谱 Fingerprints
1	A00000B00010C01000D00101E00100	34	A00001B00000C10000D10010E10000	67	A01010B01000C10000D00000E00010
2	A01000B11000C00100D00001E00110	35	A00001B00000C10000D10010E10001	68	A00000B01100C11000D10100E00011
3	A00000B10010C00010D00101E00101	36	A10010B00000C10000D00110E10100	69	A01000B00000C01100D00001E00011
4	A00100B01000C01000D00101D00101	37	A01001B10000C01000D10100E00000	70	A00101B01000C11000D00000E00010
5	A00100B01000C00001D01100E00110	38	A10000B00000C00000D10100E01100	71	A01000B01000C01000D00001E00001
6	A00000B01000C00010D00100E00001	39	A10000B10000C00000D00101E00001	72	A00000B00010C11000D10100E00010
7	A10000B01100C01000D01100E00101	40	A01000B00100C11000D10100E00100	73	A00000B10010C01000D01100E00011
8	A01001B00100C00000D10100E00110	41	A10000B01000C01000D01100E00011	74	A00010B01000C10000D10100E00110
9	A00000B00100C00000D01100E00101	42	A00100B01000C00100D10001E00110	75	A00001B00000C11000D10100E00110
10	A10001B10000C10000D10000E00011	43	A00011B00100C11000D10000E00101	76	A01100B01000C10000D10000E00110
11	A10000B10000C01000D00101E00100	44	A01010B00010C01000D00101E00101	77	A01000B00100C01001D10000E00101
12	A00100B01000C00010D10100E00010	45	A00010B11000C01000D00101E00110	78	A01000B01000C10000D00001E00001
13	A00001B01000C01000D10000E00100	46	A00010B01000C10001D00101E00110	79	A00000B00000C10000D00110E10010
14	A00000B01000C10010D01100E00100	47	A10100B01000C10000D00101E00101	80	A01000B01100C10100D10001E00101
15	A01000B00000C01100D00001E00011	48	A01001B11000C01010D00101E00001	81	A00001B00001C01001D00100E00110
16	A01010B01000C01100D10000E00011	49	A00000B01100C10000D00010E00110	82	A01100B01001C01000D10000E01010
17	A00100B00100C00000D00100E00110	50	A10001B00000C00000D10001E01010	83	A00100B11000C01000D00010E10000
18	A10010B01000C01000D00010E00010	51	A10000B01000C00000D10100E11000	84	A00100B00010C00001D10000E00000
19	A00001B00000C01000D00100E00011	52	A01000B00001C01000D00110E00101	85	A01000B10000C01000D00101E00101
20	A00001B00100C00100D11000E01001	53	A01000B10000C00001D10100E00110	86	A00000B00000C00100D00100E00001
21	A01100B00000C00010D01100E01100	54	A01000B01010C00000D00110E00110	87	A01000B01000C00010D10100E01000
22	A00000B00100C11000D00100E00010	55	A00110B01000C10000D01000E01000	88	A10001B01100C00000D00100E00101
23	A00001B00000C10000D01100E	56	A01000B00000C00000D10000E01000	89	A00100B10000C01001D00101E00110
24	A10000B00000C00100D10000E00100	57	A01000B10000C10000D11000E00000	90	A00000B01000C00100D10010E00101
25	A00000B00100C00010D00101E10001	58	A00000B01000C10000D01000E00101	91	A00100B10000C10001D01000E01010
26	A00001B10000C01000D00101E00110	59	A00101B10000C00011D00001E00001	92	A00000B01010C01000D00101E11000
27	A01000B01000C10001D00001E00101	60	A00000B00000C00010D00101E00001	93	A01000B00000C11000D10100E00010
28	A10000B00000C10000D0100E10001	61	A01000B00000C10000D10100E01100	94	A00001B00000C10010D01100E01000
29	A01001B01000C00000D00100E01100	62	A01000B00000C00000D00110E00110	95	A01000B00000C10000D01010E00011
30	A01001B00010C00100D10100E01000	63	A00010B10000C10000D11000E00011	96	A00000B10100C10000D01000E01001
31	A00001B00000C10000D10010E10000	64	A00010B00000C10000D10100E00100	97	A00010B00010C10000D00010E00001
32	A10000B00000C10000D00110E00110	65	A01000B01000C01010D00100E00001	98	A00100B00000C10000D00100E00011
33	A00001B00001C10000D10010E00010	66	A00110B01000C11000D01000E01001	99	A00000B00000C10000D01010E00110
100	A00101B10000C01000D01010E00110	134	A01100B11000C01000D01100E10100	168	A01000B00000C01000D00010E10000
101	A01000B01000C01000D01000E00011	135	A00010B01000C01000D11000E00110	169	A01000B00000C01000D00010E10000
102	A01000B00100C10000D10100E00000	136	A00100B01000C01000D11000E00011	170	A01000B01000C10000D00110E10000
103	A00000B01001C01000D11000E01010	137	A01001B01000C01000D11000E00101	171	A10000B00100C01000D00110E10010
104	A00100B11000C01000D11000E00001	138	A00000B00010C01001D01000E00101	172	A01000B00000C00000D00010E10000
105	A10000B00000C01000D00110E10100	139	A00110B00000C11000D11000E01010	173	A01000B10000C10000D00011E10100
106	A00110B10001C01000D01000E00011	140	A00010B00000C01000D01000E00100	174	A01000B00000C01000D00010E10000
107	A01100B11000C01000D10000E00001	141	A00101B10000C01000D01100E00100	175	A00011B01000C00000D00001E00100
108	A10100B01010C01000D10000E01010	142	A00101B00000C01000D10100E00100	176	A01010B11000C10000D10010E01100
109	A00100B01001C11000D10000E00010	143	A01001B00100C11000D00100E01110	177	A01000B00001C10010D11000E00101
110	A01000B00001C00000D00110E00010	144	A00001B00100C01000D10010E00001	178	A00010B01000C11000D10100E00110
111	A01001B00010C01000D01010E10100	145	A00001B00000C00100D00100E00100	179	A00100B10100C10000D11000E00011
112	A00100B10000C01000D10000E00001	146	A00100B00000C01000D00100E01001	180	A00100B00100C00100D01010E00011
113	A01001B00000C00000D00100E10100	147	A11000B01000C01000D00010E01001	181	A00100B00100C10000D00100E10001
114	A01010B00000C01000D01000E01001	148	A01010B01000C11000D11000E01000	182	A00011B00000C11000D00100E00011
115	A00010B00000C01000D00100E00100	149	A00000B00000C01000D01000E00010	183	A10000B10000C01000D10100E10100
116	A00100B01000C11000D10100E00110	150	A01000B01000C11000D01010E10010	184	A00000B00000C00100D01010E10100
117	A00010B00000C11000D10000E00001	151	A01000B01000C10000D00101E10010	185	A01000B01000C00010D00001E00011
118	A01000B00100C11000D01000E00001	152	A01000B01000C10000D01010E10000	186	A10001B01000C00000D10000E00101
119	A00010B00100C00100D10000E00010	153	A01000B00000C01000D01010E10100	187	A10000B01000C00010D01100E00110
120	A01000B00000C10000D00110E10100	154	A01000B00000C10000D00010E10001	188	A00001B01100C11000D01000E00100
121	A00100B11000C10000D01100E00100	155	A01000B00000C10000D01010E10000	189	A00101B10000C00100D10100E00100
122	A00001B10000C10000D01010E10100	156	A01000B01000C10000D01010E10100	190	A00100B00000C10100D11000E01100
123	A00000B00000C10000D00010E10001	157	A01000B00000C11000D01010E10100	191	A00101B00000C11000D00101E00010
124	A01001B00000C10000D01000E10000	158	A01000B01000C11000D01010E00110	192	A00001B00001C01000D10010E01010
125	A01001B00000C10000D11000E00011	159	A00100B01010C10000D10000E01100	193	A11000B01000C01010D11000E01010
126	A00100B01000C01000D01000E01001	160	A10001B00000C01000D00010E00101	194	A00110B10000C10000D11000E10100
127	A01000B01000C10000D01010E11000	161	A01000B11000C01000D00101E00101	195	A00100B00000C00000D00110E00101
128	A00001B01000C00001D00010E00110	162	A01001B00000C01000D00010E01001	196	A00001B01000C01010D00001E00101
129	A01000B11000C10000D10100E1000	163	A10100B00011C01000D10000E00010	197	A01000B01000C10010D00001E00011
130	A01000B01000C10000D01010E00011	164	A01000B01000C01000D01010E10001	198	A01000B00100C00000D11000E01001
131	A01000B00001C10000D01100E00010	165	A01000B01000C01000D01010E10100	199	A00101B00000C01001D10100E01010
132	A00100B00001C11000D10010E01010	166	A01000B00000C00000D00110E00101	200	A01000B11000C00101D00100E00110
133	A00001B00000C01000D01010E10001	167	A00000B01000C00000D00110E00001

3 讨论

3.1 分子标记多态性分析

EST-SSR是利用现有的EST序列进行电子筛查，然后进行PCR检测^［

30］。使用EST开发SSR，避免了开发SSR引物过程中的克隆和测序步骤，充分利用现有数据，降低了开发成本^{［参考文献 31

百度学术}31］。EST-SSR保守性好，在不同物种间具有良好的通用性，可以区分亲缘关系较近的材料。

探索性条件下基因型间的多态性率被认为是衡量DNA标记多样性分析效率的关键因素。大量研究指出，标记的多态性影响植物的遗传多样性水平。一般而言，使用多态性高的引物比使用多态性差的引物，供试材料的遗传参数更可靠。信朋飞等^［

22］基于大麻EST信息建立SSR标记，为大麻遗传多样性研究提供理论依据。而本研究首次利用EST-SSR标记对大麻种群结构进行分析，从40对EST-SSR引物中筛选出20对引物对大麻种群进行标记。本研究中检测到的高遗传多样性可能是由于使用了为大麻基因组开发的EST-SSR分子标记，可以更好地区分基因位点。香农信息指数（I）介于0.7204~2.4625之间，平均值为1.5368。这一发现表明所选引物能够客观地揭示大麻种质资源的遗传多样性。总体而言，20对EST-SSR引物可以充分分析大麻材料之间的遗传差异。

3.2 大麻材料遗传变异及种群间遗传多样性

本研究根据大麻种质资源用途类型，将其分为3个亚群进行遗传结构分析。各种群香农信息指数介于1.3756～1.5545之间，遗传多样性水平较高。大麻种群的高度遗传多样性可能与该物种的异花授粉有关。有研究表明PIC≥0.5，为高度多态位点；0.25<PIC<0.5，为中度多态位点；PIC≤0.25，为低度多态位点。在本研究中，20对引物PIC值平均为0.6558，说明大麻EST-SSR标记均表现为高度多态性，适合大麻遗传多样性分析。

可以中和种间分化和种内遗传漂变的高度基因流动在异花授粉植物中极为常见，可导致个体或种群之间的遗传多样性较低^［

17］。本研究中，花叶用种群与其他种群之间的大麻基因流（Nm）较小，其他种群之间的Nm较高。Norman等^{［参考文献 32

百度学术}32］提出，Nm < 1表明植物种群间遗传分化程度高，而Nm > 1表明植物种群间遗传分化程度低。George等^{［参考文献 33

百度学术}33］在异花授粉的白三叶草中证实了Norman等^{［参考文献 32

百度学术}32］的理论。由于种群间基因交换频繁，种群间的亲缘关系得以维持，因此种群间的遗传分化不显著。在进化过程中，大麻发生了巨大的遗传变异，与其他种群的遗传物质频繁交换。因此，在遗传育种层面形成了多态性丰富、遗传变异度高的种质资源。不同类型的种质资源收集和引进历史也可能影响基因流动并塑造新的种群遗传结构。

物种的遗传结构受多种因素的相互作用影响，例如种子和花粉的传播模式、种群统计历史、地质事件、地理或生态障碍以及环境因素的发散选择^［

34］。根据3个群体两两之间的Nei's遗传距离，这3个种群被分为三组。籽用型和纤用型亲缘关系最近，同时在田间测评过程中发现籽用型和纤用型品种其外部形态特征较为相似，这可能是由于在育种过程中，将来源相同的品种资源按照不同用途而划分为不同的遗传分支。

3.3 大麻种质资源种群结构

本研究根据种群遗传结构分析，将200份材料分成3个类群，并将来自同一种群的个体也聚类到不同的类群中。在UPGMA聚类图中，花叶用类型的一些单株与籽用型和纤用型单株聚在一起，但在种群结构分析中，花叶用材料独立聚类一组。聚类可能是育种和驯化的结果，对多样性结构影响很大。选择和育种倾向于使植物保持具有经济价值的性状^［

35］。此外，不同的环境也会引起遗传变化，从而影响种群结构的划分。也可能是大麻材料含有不同植物个体的遗传物质，由于所有个体的遗传信息由种群结构整合而成，因此会影响种群的结构。UPGMA聚类是基于大麻材料的遗传距离进行的，将密切相关的材料聚为一组，这可能导致具有不同遗传结构的材料聚集。Shen等^{［参考文献 36

百度学术}36］分析了64份燕麦种质资源的群体遗传结构，也发现同一种族的种质资源聚类成不同的类群。

根据PCoA、UPGMA和STRUCTURE分析，本研究中的大麻种质基本被分为3组。200份大麻单株材料的分类基本符合群体遗传结构分析，但也存在一定差异。这可能是由于不同方法应用了不同的统计原理^［

15］。PCoA可以根据原始数据的相异矩阵提供更有效的分类，这并不严格符合Hardy-Weinberg平衡假设。种群结构分析可以更好地了解遗传多样性，估计种质资源的变异情况，有利于对其进行有效利用。种群遗传结构通过贝叶斯聚类方法按概率将种质分配给亚群，并用于自然异交种群的细分。使用UPGMA分析的种质聚类是基于遗传距离实现的，它显示了种质之间更详细的关系。总的来说，这3种方法对全面了解大麻种群遗传结构可以提供有效的帮助。此外，本研究所揭示的大麻差异性可以评价其在选择亲本组合时具有较高的育种和杂交优势，为选择具有强遗传差异的大麻杂交组合提供依据。

3.4 SSR标记构建指纹图谱

SSRs作为一类具有等位变异高、共显性、检测简单快速、稳定性好等的分子标记，已在遗传多样性分析、指纹构建、性状标记和遗传连锁图谱构建等多个领域得到成熟应用^［

37］。许多农学家和遗传学家对SSRs进行了广泛的研究和应用。本研究选择的5对核心引物，其PIC值在0.7901～0.8801之间，均属于高多态性引物，有利于品种资源鉴定。

4 结论

本研究利用EST-SSR标记对大麻的遗传结构进行分析，并且对200份大麻种质资源进行了指纹图谱的构建。研究结果表明，籽用型种群与纤用型种群遗传距离最小，基于遗传距离构建的UPGMA聚类树也验证了籽用型与纤用型种群亲缘关系较近；同时通过UPGMA聚类分析、PCoA分析和遗传结构分析，进一步确定了200份大麻的聚类个体材料与种群遗传结构分析结果基本相符。分类结果、基因多样性和遗传相似系数表明，大麻个体总体亲缘关系较为密切。同时本研究选取5对核心引物对参试种质构建大麻指纹图谱，利用组合构成了大麻特有的DNA指纹，能够将这些材料逐一地区分开来。结果证实，大麻种质具有足够的遗传多样性。研究结果将为大麻杂交组合、标记辅助改良、种质资源保护和核心种质收集提供分子依据。

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