摘要
叶绿素是水稻光合作用的重要色素，叶绿素的合成决定光合作用的效率，影响植物的产量和品质。在本研究中，发现糖原合成酶激酶OsGSK2过表达植株Go-2成熟期呈现叶片深绿色的表型。相比野生型，Go-2植株叶绿素a、叶绿素b以及类胡萝卜素含量显著升高。透射电镜观察结果显示，相比野生型，Go-2植株叶绿体类囊体片层增多。酵母双杂交“一对一”实验证实OsGSK2与Golden2-Like转录因子OsGLK1存在互作，并进一步通过双分子荧光互补实验确认OsGSK2与OsGLK1存在互作。在水稻原生质体中检测双荧光素酶活性发现，相比单转OsGLK1，OsGSK2与OsGLK1共转显著提高下游靶基因的表达水平。荧光定量PCR结果表明，相比野生型，在Go-2植株中OsGLK1直接调控的靶基因OsPORB、OsCAO1、LHCB6等转录水平显著上调。研究结果初步揭示了OsGSK2与OsGLK1互作调控水稻叶绿素合成和叶绿体发育的分子机理，进一步拓展了水稻糖原合成酶激酶的分子功能，丰富了水稻叶色调控的分子网络，为水稻高光合分子育种提供了理论依据。
水稻是我国乃至世界上最重要的粮食作物之一，提供了全球近50%人口的食物来源。水稻增产对保障食物安全和人民生活水平具有极其重要的作
叶绿素在水稻中起着重要的调控作用，涉及到光合作用、生长发育和环境适应等方
OsGSK2编码一个与拟南芥BIN2同源的类GSK3/SHAGGY激酶，广泛参与水稻油菜素内酯（BR，brassinolide）信号转导、株高、籽粒发育、种子萌发、抗病毒等多个细胞信号传导通路和生物学过
相比Go-1，在Go-2植株中OsGSK2的表达水平更高，叶色深绿表型更为显
粳稻中花11和OsGSK2过表达植株Go-
在成熟期，剪取野生型WT（Wild type）和过表达植株Go-2叶片各0.1 g，置于95%无水乙醇中，黑暗放置48 h，利用双通道紫外分光亮度计测定在 663、645、470 nm波长下的吸光值，具体叶绿素含量测定方法参考许子怡
在成熟期，取田间生长的野生型WT和过表达植株Go-2叶片，置于2.5%戊二醛固定液中，抽真空2 h，而后置于4 ℃保存。将固定好的样品避光送至青岛科创质量检测有限公司进行后续样品的处理和透射电镜观察。
设计引物OsGSK2-BD-F/R、OsGLK1-AD-F/R分别扩增基因OsGSK2与OsGLK1的全长编码区，PCR体系如下：cDNA 2μL，引物共2 μL，KOD Mix 46 μL；PCR程序如下：在98 ℃下变性10 s，在55 ℃下退火30 s，在 68 ℃下延伸90 s，33 个循环。接着利用限制性内切酶EcoR I/BamH I酶切结合结构域载体BD（pGBKT7）与激活结构域载体AD（pGADT7）。限制性内切酶购自Takara生物公司，pGBKT7与pGADT7载体由本实验室自行保存。利用南京诺唯赞生物科技股份有限公司的重组试剂盒（#C112-01）进行目的片段和载体融合，而后转化大肠杆菌，挑菌送安徽通用生物有限公司测序，测序结果利用软件BioXM 2.6进行序列比对，确定阳性克隆OsGSK2-BD、OsGLK1-AD。具体操作参考试剂盒说明书。以OsGSK2-BD+AD、BD+OsGLK1-AD为对照组，OsGSK2-BD+OsGLK1-AD为实验组。
将OsGSK2-BD、OsGLK1-AD、AD、BD等质粒进行组合，利用Takara酵母转化试剂盒分别转入酵母感受态细胞AH109（实验室自行保存）中，涂布于酵母缺陷培养基（SD-Leu/-Trp），置于30 ℃培养2~3 d。每个组合挑选3~5个单克隆置于酵母筛选培养基（SD-Ade/-His/-Leu/-Trp）上3~5 d，观察酵母生长情况。
以粳稻中花11叶片cDNA为模板，设计引物OsGSK2-nYFP-F/R、OsGLK1-cYFP-F/R，利用KOD高保真性聚合酶 （TOYOBO，#KOD-201）分别扩增基因OsGSK2与OsGLK1的编码区（去除终止密码子），PCR体系与程序同1.3。用限制性内切酶Pac I/Spe I酶切载体nYFP与cYFP（本实验室自行保存），片段与载体融合及转化如上所述，得到重组质粒OsGSK2-nYFP、OsGLK1-cYFP。载体构建所用引用引物序列如
引物名称 Primer name | 正向引物 （5′-3′） Forward primer （5′-3′） | 反向引物 （5′-3′） Revers primer （5′-3′） | |
|---|---|---|---|
| OsGLK1-AD | GGAGGCCAGTGAATTCATGCTTGCCGTGTCGCCGGC | CGAGCTCGATGGATCCTCATCCACACGCTGGAGGAA | |
| OsGSK2-BD | CATGGAGGCCGAATTCATGGACCAGCCGGCGCCGGC | GCAGGTCGACGGATCCTTAGCTCCCAGTATTGAAGA | |
| OsGLK1-p2YC | CATTTACGAACGATAGTTAATTAAATGCTTGCCGTGTCGCCGGC | CACTGCCACCTCCTCCACTAGTTCCACACGCTGGAGGAA | |
| OsGSK2-p2YN | CATTTACGAACGATAGTTAATTAAATGGACCAGCCGGCGCCGGC | CACTGCCACCTCCTCCACTAGTGCTCCCAGTATTGAAGAA | |
| OsGLK1-pAN580 | CGGAGCTAGCTCTAGAATGCTTGCCGTGTCGCCGGC | TGCTCACCATGGATCCTCCACACGCTGGAGGAA | |
| OsGSK2-pAN580 | CGGAGCTAGCTCTAGAATGGACCAGCCGGCGCCGGC | TGCTCACCATGGATCCGCTCCCAGTATTGAAGA | |
| OsHEMA-PRO-LUC | TTGATATCGAATTCCTGCAGCAACGGCGCGAGAAAGGAAC | TAGAACTAGTGGATCCCAGATCAAGAAAGCACCAGC | |
下划线标出的碱基代表限制性内切酶位点
The underlined bases represent the restriction endonuclease site
将OsGSK2-nYFP、OsGLK1-cYFP等重组质粒转入农杆菌EHA105（本实验室保存）中，进而侵染一月龄的烟草，放置2~3 d，利用激光共聚焦显微镜观察拍照，以OsGSK2-nYFP+cYFP、nYFP+OsGLK1-cYFP为对照组，OsGSK2-nYFP+OsGLK1-cYFP为实验组。BiFC具体操作步骤参考Lan
以粳稻中花11叶片cDNA为模板，设计引物（OsGLK1-pAN580-F/R、OsGSK2-pAN580-F/R）分别扩增基因OsGSK2、OsGLK1的编码区（去除终止密码子），PCR与体系程序同1.3。以粳稻中花11叶片DNA为模板，设计引物（OsHEMA-PRO-LUC-F/R）扩增基因OsHEMA的启动子。PCR体系如下：DNA 2 μL，引物2 μL，KOD Mix 46 μL；PCR程序如下：在98 ℃下变性10 s，在55 ℃下退火30 s，在 68 ℃下延伸2 min，33 个循环。利用限制性内切酶Xba I/BamH I酶切载体pAN580（本实验室自行保存）以及用Pst I/Spe I酶切载体pGreen II 0800-LUC（本实验室自行保存），片段与载体融合及转化如上所述，得到重组质粒OsGLK1-pAN580、OsGSK2-pAN580。载体构建所用引物序列如
OsGLK1-pAN580、OsGSK2-pAN580、pAN580质粒与LUC报告载体质粒OsHEMA-PRO-LUC进行组合，转化水稻原生质体，利用普洛麦格（北京）生物技术有限公司双荧光素酶测定试剂盒检测荧光素酶（LUC，luciferase）活性，设置3个生物学重复。具体操作参考试剂盒说明书和Zhang
在成熟期，取野生型WT和过表达植株Go-2叶片，液氮研磨，置于2.0 mL离心管中，利用天根生化科技（北京）有限公司生产的植物组织 RNA 快速提取试剂盒（RNA Easy Fast kit）提取RNA，置于-80 ℃保存备用。
以野生型WT和过表达植株Go-2叶片cDNA为模板，利用Takara公司生产的TB Gree
基因名称 Gene name | 正向引物（5′-3′） Forward primer （5′-3′） | 反向引物 （5′-3′） Revers primer（5′-3′） |
|---|---|---|
| UBQ | ACCCTGGCTGACTACAACATC | AGTTGACAGCCCTAGGGTG |
| LHCB2 | ACCATGCGCCGCACCGTCAA | ATAGCCCCGCCGTGTCCCAC |
| LHCA3 | ACCAAGAGCGAGGCGGAGATGA | TGGAACTTGAGGCTGGTGAGGATGT |
| LHCA1 | TGCTGGCTTTTGTGGGTTTC | TCTCGGGATGATGATGTCGC |
| LHCB6 | TGGCTCGCTCCCCGGTGACTT | CTCCACGCCTGCCCGACGAA |
| LHCB4 | AGCGCTTCCGCGAGTGCGAGCTCAT | TACGACGACCCATCCACCAG |
| LHCA2 | AGAGCTTGCGGTGGAACGTG | GGATGCCGATCTTGGTCAGG |
与野生型相比，Go-2在成熟期叶片深绿色（
图 1 OsGSK2过表达植株Go-2成熟期叶色表型
Fig.1 Leaf color phenotypes of OsGSK2 overexpressed plant Go-2 at maturity
A：成熟期野生型和Go-2植株表型，比例尺为5 cm；B：成熟期野生型和Go-2植株叶绿素含量测定；*和**分别代表在0.05与0.01水平达到显著与极显著差异，下同
A： At maturity， wild-type and Go-2 plant phenotypes，Bars=5cm； B： Determination of chlorophyll content of wild type and Go-2 plants at maturity；*and ** respectively represent significant and extremely significant differences at the 0.05 and.0.01 levels， the same as below
如
图 2 叶绿体透射电镜观察
Fig.2 Transmission electron microscopy observation of chloroplasts
A，B：野生型的叶绿体透射电镜观察；C，D：Go-2的叶绿体透射电镜观察；A，C 标尺为5 µm；B，D 标尺为1 µm；黑色箭头指示叶绿体类囊体结构
A，B： Transmission electron microscope observation of wild-type chloroplasts；C，D： Chloroplast observation of Go-2 by transmission electron microscope；Bars=5 µm in A and C； Bars=1 µm in B and D； Black arrows indicate chloroplast thylakoid structure
为深入解析OsGSK2调控水稻叶绿体发育和叶绿素合成的分子机理，利用酵母双杂交系统筛选OsGSK2的互作蛋白。如
图 3 酵母双杂交分析
Fig.3 Yeast two hybrid analysis
为进一步验证OsGSK2与OsGLK1互作关系的真实性，构建了OsGSK2与OsGLK1双分子荧光互补载体，侵染烟草，通过激光共聚焦显微镜观察荧光信号，从而确定OsGSK2与OsGLK1的互作。如
图4 双分子荧光互补分析
Fig.4 Bimolecular fluorescence complementary analysis
比例尺为10 µm
GFP： Green fluorescent protein ； DIC： Differential interference contrast； Bars=10 µm
为进一步探究OsGSK2与OsGLK1互作的生物学意义，在水稻原生质体中，通过荧光素酶活性检测分析OsGSK2与OsGLK1互作对其转录活性的影响。如
图5 OsGLK1转录活性分析
Fig.5 OsGLK1 transcription activity analysis
A：转录活性检测过程中使用的载体构建示意图；B：转录活性检测；a和b分别代表OsGLK1、OsGSK2构建的效应子载体；c代表OsHEMA启动子构建的LUC报告载体；d代表以海肾荧光素酶为内参对照
A： Schematic diagram of vector construction used for transactivation assays； B： Transcription activity detection； a and b represent effector vectors constructed by OsGLK1 and OsGSK2，respectively ； c represents the LUC reporter vector constructed by the OsHEMA promoter； d represents the Renilla luciferas as the internal reference control
前期研究，OsGLK1可以直接结合叶绿素合成基因OsPORB、OsCAO1的启动子，进而正调控其表
图6 叶绿素合成基因表达分析
Fig.6 The expression level of chlorophyll synthesis genes
转录因子OsGLK1直接调控6个光捕获复合体亚基（LHCB6、LHCB2、LHCB4、LHCA1、LHCA2、LHCA3）的表达，控制水稻叶绿体发
图7 光合作用相关基因表达分析
Fig.7 The expression level of genes related to photosynthesis
叶色相关突变体是研究水稻叶绿素合成和叶绿体发育的理想材
在本研究中，过表达植株Go-2成熟期叶片呈现深绿色，叶绿素含量显着升高，叶绿体类囊体片层结构增多，证明了OsGSK2正调控水稻叶绿素合成和叶绿体发育。酵母双杂交、双分子荧光互补以及荧光素酶活性检测实验证实OsGSK2与Golden2-Like转录因子OsGLK1互作，并增强OsGLK1的转录活性。此外，OsGLK1下游靶基因（OsPORB、OsCAO1、LHCB6等）的转录水平在过表达植株Go-2体内显著上调。原叶绿素酸酯氧化还原酶B（OsPORB，Protochlorophyllide Oxidoreductase B）催化叶绿素合成中的原叶绿素酸酯光还原成叶绿素酸酯，受高光照诱导迅速上调表达，是维持依赖光的叶绿素合成所必需
在水稻中，Golden2 -Like转录因子有OsGLK1与OsGLK2。本研究证实了OsGSK2与OsGLK1互作，但是OsGSK2与OsGLK2互作关系与OsGLK1与OsGLK2在调控叶绿体发育方面是否存在功能冗余是未知的。此外，OsGSK2编码的产物是激酶，一般会磷酸化互作蛋白，OsGLK1是否是OsGSK2直接磷酸化底物蛋白。这些问题都是我们下一步研究的重点。综上，OsGSK2通过与OsGLK1互作，进而增强OsGLK1的转录激活活性，促进下游叶绿素合成和叶绿体发育相关基因的表达，进而调控水稻叶色。
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