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基于ISSR标记的96份兰属种质资源遗传多样性分析及指纹图谱构建  PDF

  • 魏晓羽 ✉
  • 刘红
  • 马辉
  • 别同德
  • 孙叶 ✉
江苏里下河地区农业科学研究所，扬州225007

最近更新：2024-04-26

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230810003

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摘要

为加强我国兰属种质资源的保护利用，本研究通过ISSR分子标记对96份兰属种质进行多样性分析和指纹图谱构建。结果显示，共筛选出11条可扩增清晰条带的多样性引物，在96份材料共检测67条多态性条带，平均多态性条带比例为73.63%；等位基因数（Na）为1.925，有效等位基因数（Ne）为1.450，Nei′s遗传多样性指数（H）为0.277，Shannon多样性指数（I）为0.427，多态性位点百分比（PPL， percentage of polymorphic loci）为92.54%；种群内基因多样性（Hs）为0.1934，基因分化度（Gst）为0.3009，总遗传多样性指数（Ht）为0.2767，种群间的平均基因流（Nm）为1.1619，种群间的两两遗传分化固定指数值范围为0.002~0.527，平均值为0.325。系统聚类结果表明，兰属种群间遗传分化程度高，8个种群可分为3类，春兰和墨兰为一大类，寒兰、春剑、蕙兰、莲瓣兰、建兰为第二类，杂交种独为一类，与其他两类种群之间的遗传距离较大。主坐标分析表明，莲瓣兰和春兰表现出较远的亲缘关系。本研究筛选出6对引物构建了96个品种的指纹图谱二维码。本研究结果可为今后兰属新品种选育及品种鉴定提供重要依据。

兰属（Cymbidium Sw.）是天门冬目（Asparagales Link）兰科（Orchidaceae Juss.）的主要属之一，其中常见的地生种类，如春兰（Cymbidium goeringii）、蕙兰（C. faberi）、建兰（C. ensifolium）、墨兰（C. sinense）、寒兰（C. kanran）、莲瓣兰（C. tortisepalum）与春剑（C. goeringii var. longibracteatum）等，又统称为中国兰，在中国作为观赏花卉已有1000多年的栽培历史。目前全世界兰属植物共有86个种、4个亚种和12个变种，中国现已公开发表的国产兰属物种有57个种、2个亚种和11个变种［

1］。由于野生兰生存环境逐渐被破坏，原生种质资源逐渐匮乏［2］，通过人工杂交来培育新品种，逐渐成为兰花育种的新趋势。目前市场上现流通的兰花品种存在命名混乱、系谱信息缺乏、亲缘关系复杂等问题［3］，是限制中国兰产业发展的重要因素之一。通过分子标记技术对兰属种质资源进行系统分类、遗传分析以及构建指纹图谱，可为兰属种质资源杂交育种提供参考依据。

分子标记技术以遗传物质为依据，从物种基因组DNA水平直接反映种间和种内的差异，为分类鉴定提供了高效、准确且清晰的方法［

4］，包括微卫星分子标记（ISSR， inter-simple sequence repeat）、随机扩增多态性DNA标记（RAPD， random amplified polymorphic DNA）、简单重复序列标记（SSR， simple sequence repeats）、相关序列扩增多态性标记（SRAP， sequence-related amplified polymorphism）和目标起始密码子多态性标记（ScoT， start codon targeted polymorphism）等，这些标记主要用于兰花种内、种间及品种间的分类鉴定［5］、遗传多样性、亲缘关系分析以及种质资源与种群方面的研究。ISSR分子标记技术操作较为简单，无需测序，实验成本低廉［6］，已广泛应用于兰属的遗传多样性、亲缘关系、居群遗传结构和杂交种质亲缘关系鉴定等研究［7］。吴振兴等［8］用15个ISSR引物在16种兰属植物中扩增出227条多态条带，并认为春兰与春剑的亲缘关系最近。高丽等［9］用11条ISSR引物对湖北省的11个春兰居群进行多样性分析，认为春兰的遗传变异程度远高于其他兰科植物。Wang等［10］对50个春兰品种进行ISSR遗传多样性研究，并分别区分出日本和中国血缘的春兰组成。同样在建兰、寒兰、蕙兰上也均有学者通过ISSR标记进行多样性分析，王宏利等［11］通过6个ISSR引物对39份建兰分析，认为ISSR标记在建兰的品种间具有丰富的多态性，能够很好地揭示建兰品种间的亲缘关系。江亚雯等［12］用ISSR标记区分出江西省12个寒兰居群遗传距离和亲缘关系。帖聪晓等［13］利用12条ISSR引物分析得出，江西省蕙兰居群并没有呈现出按照山脉分布的特点，各山脉间蕙兰居群基因交流有限。ISSR标记在其他兰科作物中也有运用，如白及［14］、无距虾脊兰［15］、西藏杓兰［16］等。但少有学者较全面的结合中国兰属主要种质进行多样性分析。

DNA指纹图谱广泛应用于品种、品系的鉴别，在种质资源保护利用、种质来源分辨、新品种注册和知识产权保护等方面起到关键作用［

17］。构建DNA指纹图谱可利用尽量少的引物区分尽量多的种质资源，以达到提高检测效率、降低成本的目的［18］。

在兰属种质的多样性研究中，多数学者选择单一种质如春兰［

9］、寒兰［12］等进行研究，也有学者选择中国兰属种质进行分析，但其中部分兰属种质数量较少或不具代表性，本研究以7个兰属种质资源（春兰、蕙兰、建兰、寒兰、墨兰、春剑、莲瓣兰）以及1个兰属杂交种质资源为研究对象，各挑选12份种质，进行遗传多样性、居群遗传结构、亲缘关系分析，筛选出具有多态性和分型较好的标记，构建分子指纹图谱，以期为兰属种质资源的分类鉴定、种质创新和新品种选育提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以96份兰属种质资源为材料，共分为8个种群，分别为春兰、蕙兰、建兰、墨兰、寒兰、莲瓣兰、春剑和自育杂交种，每个种群各12份材料，均来自江苏里下河地区农业科学研究所兰属种质资源圃（表1）。选取生长健康植株的幼嫩叶片，置于塑封袋中保存，用于DNA的提取。

表1  96份兰属种质资源
Table 1  List of 96 Cymbidium resources

序号

No.

编号

Code

名称

Name

种

Species

序号

No.

编号

Code

名称

Name

种

Species

序号

No.

编号

Code

名称

Name

种

Species

1 C-1 金昌梅 春兰 33 CJ-9 雨露 春剑 65 A-5 金狮蝶 寒兰
2 C-2 中华丽荷 春兰 34 CJ-10 大红荷 春剑 66 A-6 逍遥 寒兰
3 C-3 永富素 春兰 35 CJ-11 金川明玉 春剑 67 A-7 赤壳素 寒兰
4 C-4 红塔宝鼎 春兰 36 CJ-12 彩云 春剑 68 A-8 紫气东来 寒兰
5 C-5 春一品 春兰 37 M-1 白衣神相 墨兰 69 A-9 寒素 寒兰
6 C-6 鹤市 春兰 38 M-2 巨荷 墨兰 70 A-10 红雀 寒兰
7 C-7 史安梅 春兰 39 M-3 兰阳之松 墨兰 71 A-11 青寒兰 寒兰
8 C-8 花蝴蝶 春兰 40 M-4 福隆 墨兰 72 A-12 紫寒兰 寒兰
9 C-9 碧瑶 春兰 41 M-5 富贵金龙 墨兰 73 J-1 红草红荷 建兰
10 C-10 青钱梅 春兰 42 M-6 东方红神荷 墨兰 74 J-2 暮山紫 建兰
11 C-11 永丰梅 春兰 43 M-7 金华山 墨兰 75 J-3 素台北 建兰
12 C-12 魁字 春兰 44 M-8 日向 墨兰 76 J-4 中华水仙 建兰
13 L-1 小雪素 莲瓣兰 45 M-9 天堂鸟 墨兰 77 J-5 红猫蕊蝶 建兰
14 L-2 荷之冠 莲瓣兰 46 M-10 乾坤蝶 墨兰 78 J-6 红君荷 建兰
15 L-3 映山红 莲瓣兰 47 M-11 龙风彩 墨兰 79 J-7 日月潭之恋 建兰
16 L-4 玉兔 莲瓣兰 48 M-12 金蝶 墨兰 80 J-8 逸红双娇 建兰
17 L-5 满江红 莲瓣兰 49 H-1 金奥素 蕙兰 81 J-9 中岩彩蝶 建兰
18 L-6 太平公主 莲瓣兰 50 H-2 老极品 蕙兰 82 J-10 彩云追月 建兰
19 L-7 胭脂 莲瓣兰 51 H-3 郑孝荷 蕙兰 83 J-11 红月 建兰
20 L-8 心花怒放 莲瓣兰 52 H-4 端蕙梅 蕙兰 84 J-12 倾城 建兰
21 L-9 碧龙红素 莲瓣兰 53 H-5 程梅 蕙兰 85 Z-1 红双喜 杂交种
22 L-10 素蝶 莲瓣兰 54 H-6 解佩 蕙兰 86 Z-2 大友贵 杂交种
23 L-11 剑阳蝶 莲瓣兰 55 H-7 适圆梅 蕙兰 87 Z-3 绯牡丹 杂交种
24 L-12 黑奇素 莲瓣兰 56 H-8 崔梅 蕙兰 88 Z-4 吴凤 杂交种
25 CJ-1 无尘 春剑 57 H-9 江山素 蕙兰 89 Z-5 杨贵素蝶 杂交种
26 CJ-2 边荷锦绣 春剑 58 H-10 扬蕙梅 蕙兰 90 Z-6 桂歌 杂交种
27 CJ-3 红福 春剑 59 H-11 蕊蝶 蕙兰 91 Z-7 江山翠盖 杂交种
28 CJ-4 水晶红素 春剑 60 H-12 庆华梅 蕙兰 92 Z-8 圆宋韩 杂交种
29 CJ-5 西蜀道光 春剑 61 A-1 倩云 寒兰 93 Z-9 蕙蝶 杂交种
30 CJ-6 粉桃 春剑 62 A-2 黑虎蝶 寒兰 94 Z-10 玉韩 杂交种
31 CJ-7 雅女 春剑 63 A-3 仙鹤素 寒兰 95 Z-11 新霞 杂交种
32 CJ-8 玉海棠 春剑 64 A-4 嫦娥 寒兰 96 Z-12 山端 杂交种

1.2 方法

1.2.1 DNA提取

取待试材料生长期的新鲜叶片，根据孙叶等［

19］的改良CTAB法提取DNA，在CTAB提取液中加入2 %的β-巯基乙醇，在1 %琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测DNA纯度及浓度，稀释至20 ng/μL，存于-20 ℃保存备用。

1.2.2 引物筛选及ISSR-PCR扩增

ISSR引物采用哥伦比亚大学（UBC， The University of British Columbia）公布的100条ISSR通用引物序列UBC801-UBC900，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，根据要求将其稀释至100 μmol/L，于-20 ℃低温冰箱保存备用。

参照孙叶等［

19］、黄晓慧等［7］的方法，选用TaKaRa PCR Ex Taq Kit（宝日医生物技术（北京）有限公司），ISSR-PCR扩增反应体系为25 μL，其中1 μL DNA工作液，2.5 μL 10×Ex Taq Buffer，1 μL引物，0.125 μL Ex Taq，2 μL dNTP Mixture，剩余用ddH2O补足。

在每个种群中各挑选两份随机样本，混合后作为该种群的混样模板，对100条ISSR通用引物UBC801-UBC900设置6个梯度的退火温度，用于筛选能扩增出清晰条带的引物，温度梯度为49 ℃、51 ℃、53 ℃、55 ℃、57 ℃、59 ℃，共筛选出11条引物（表2），再对96份种质材料分别扩增检测。在Agilent Sure Cycler 8800 PCR仪上进行PCR扩增，反应程序为：94 ℃预变性2.5 min；94 ℃预变性45 s；49~59 ℃退火45 s，72 ℃延伸2 min，35个循环；72 ℃延伸5 min；4 ℃保温。扩增产物于1.5 %琼脂糖凝胶电泳（1×TAE缓冲液，200 A，60 min）进行分离，G-red核酸染料（北京百泰克生物技术有限公司）染色，在Biotop凝胶成像系统（Fluor Shot EVO SC805，中国）拍照保存。

表2  ISSR引物信息
Table 2  Information of ISSR primers

引物名称

Primer name

引物序列（5′→3′）

Primer sequence（5′→3′）

UBC811 GAGAGAGAGAGAGAGAC
UBC823 TCTCTCTCTCTCTCTCC
UBC824 TCTCTCTCTCTCTCTCG
UBC825 ACACACACACACACACT
UBC826 ACACACACACACACACC
UBC827 ACACACACACACACACG
UBC845 CTCTCTCTCTCTCTCTRG
UBC854 TCTCTCTCTCTCTCTCRG
UBC857 ACACACACACACACACYG
UBC864 ATGATGATGATGATGATG
UBC866 CTCCTCCTCCTCCTCCTC

1.3 数据处理

使用人工读带的方式统计扩增产物的条带数。将电泳图谱中同一迁移位置上有条带的记为“1”，无条带的记为“0”，以此构建0、1数据矩阵。利用Genalex 6.501和Popgen 1.32软件计算多态性位点比例（PPL， percentage of polymorphic loci）、等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、Shannon多样性指数（I）、Nei′s基因多样性指数（H）、Nei’ s遗传距离（D）、基因流（Nm）、基因分化度（Gst）、总遗传多样性指数（Ht）、种群内遗传多样性指数（Hs）和遗传分化固定指数（Fst）等。用NTSYSpc软件构建非加权组平均法（UPGMA，unweighted pair-group method with arithmetic means）聚类图，GenAlEx 6.5开展PCoA分析，Excel绘制主坐标图。

根据引物条带的0、1矩阵值，依次将11条引物条带矩阵值组合成相应的数字信息，利用在线生成二维码软件（http：//cli.im/）生成96份兰属种质的指纹图谱二维码。

2 结果与分析

2.1 引物的多态性分析

根据电泳结果，从100条引物中挑选出可扩增出清晰条带的11条引物（表3），能较好的区分96份种质。用11条引物对96个兰属品种进行扩增，共检测到67个多态性条带，平均多态性条带比例为73.63%，11条引物在8个种群中均能检测出多态性条带，每个引物扩增出的条带在2~10个之间。扩增条带数最多的引物是UBC811，在莲瓣兰中扩增出10个条带，其中有9个多态性条带；而扩增条带数最少的引物是UBC826，在建兰中扩增出2条带，其中2个多态性条带。图1为用引物UBC824扩增到的电泳条带。

表3  ISSR引物扩增产物的多态性
Table 3  Polymorphism of amplification products by ISSR primers

引物

Primers

多态性指标

Polymorphism

寒兰

C. kanran

杂交种

Hybrid

莲瓣兰

C. tortisepalum

墨兰

C. sinense

建兰

C. ensifolium

春兰

C. goeringii

蕙兰

C. faberi

春剑

C. goeringii var. longibracteatum

UBC811 扩增条带数 7 8 10 8 8 8 9 5
多态性条带数 7 8 9 7 5 8 8 5
多态性条带比例（%） 100 100 90 87.50 62.50 100 88.89 100
UBC823 扩增条带数 6 6 5 6 5 4 4 5
多态性条带数 4 5 4 4 4 3 2 5
多态性条带比例（%） 66.67 83.33 80 66.67 80 75 50 100
UBC824 扩增条带数 7 7 5 4 5 6 6 3
多态性条带数 7 7 4 4 5 5 3 2
多态性条带比例（%） 100 100 80 100 100 83.33 50 66.67
UBC825 扩增条带数 4 5 5 4 4 4 4 4
多态性条带数 3 4 3 2 2 3 3 3
多态性条带比例（%） 75 80 60 50 50 75 75 75
UBC826 扩增条带数 5 3 5 3 2 3 4 5
多态性条带数 5 3 4 2 2 3 3 5
多态性条带比例（%） 100 100 80 66.67 100 100 75 100
UBC827 扩增条带数 5 6 6 5 3 5 6 5
多态性条带数 3 5 5 2 2 5 4 2
多态性条带比例（%） 60 83.33 83.33 40 66.67 100 66.67 40
UBC845 扩增条带数 4 4 5 3 5 5 4 5
多态性条带数 4 4 5 2 5 5 4 4
多态性条带比例（%） 100 100 100 66.67 100 100 100 80
UBC854 扩增条带数 4 4 4 4 3 3 3 4
多态性条带数 2 3 3 3 2 1 2 3
多态性条带比例（%） 50 75 75 75 66.67 33.33 66.67 75
UBC857 扩增条带数 7 7 8 7 7 7 7 8
多态性条带数 7 7 7 5 6 6 3 6
多态性条带比例（%） 100 100 87.50 71.43 85.71 85.71 42.86 75
UBC864 扩增条带数 5 6 6 6 5 5 6 6
多态性条带数 2 3 2 3 2 3 3 3
多态性条带比例（%） 40 50 33.33 50 40 60 50 50
UBC866 扩增条带数 4 3 4 4 4 4 4 4
多态性条带数 2 1 1 1 1 1 1 1
多态性条带比例（%） 50 33.33 25 25 25 25 25 25

合计

Sum

扩增条带数 58 59 63 54 51 54 57 54
多态性条带数 46 50 47 35 36 43 36 39
多态性条带比例（%） 79.31 84.75 74.60 64.81 70.59 79.63 63.16 72.22

图1  引物 UBC824 在96份兰属材料中的扩增产物

Fig.1  Amplification profile of 96 cultivars of Cymbidium using primer UBC824

黑色数字1~96为表1中96份兰属种质资源，白色数字1~7为扩增条带；M：2000 bp DNA Marker

The black numbers 1~96 are 96 Cymbidium resources of table 1， the white numbers 1-7 are amplification bands

2.2 遗传多样性分析

由表4可知，在物种水平上，兰属8个种群的等位基因数为1.925，有效等位基因数为1.450，Nei′s基因多样性指数为0.277，Shannon多样性指数为0.427，总多态性位点比例为92.54%。

表4  基于ISSR分子标记的遗传多样性信息
Table 4  Genetic diversity information based on ISSR molecular markers

种群

Population

等位基因数

Na

有效等位基因数

Ne

Nei′s基因多样性指数

H

Shannon多样性指数

I

多态性位点比例（%）PPL
寒兰 C. kanran 1.687 1.352 0.215 0.330 68.66
杂交种 Hybrid 1.746 1.408 0.240 0.364 74.63
莲瓣兰 C. tortisepalum 1.702 1.374 0.219 0.333 70.15
墨兰 C. sinense 1.522 1.282 0.164 0.248 52.24
建兰 C. ensifolium 1.522 1.287 0.171 0.259 52.24
春兰 C. goeringii 1.642 1.326 0.199 0.305 64.18
蕙兰 C. faberi 1.537 1.264 0.160 0.246 53.73
春剑 C. goeringii var. longibracteatum 1.582 1.307 0.180 0.273 58.21
平均 Average 1.618 1.325 0.193 0.295 61.76
物种水平 Species level 1.925 1.450 0.277 0.427 92.54

PPL：Percentage of polymorphic loci

8个种群的等位基因数为1.522~1.746，均值为1.618；有效等位基因数为1.282~1.408，均值为1.325；Nei′s基因多样性指数为0.160~0.240，均值为0.193；Shannon多样性指数为0.246~0.364，均值为0.295。

杂交种种群的多样性最大，等位基因数为1.746，有效等位基因数为1.408，Nei′s基因多样性指数为0.240，Shannon多样性指数为0.364，多态性位点比例为74.63 %。墨兰和建兰的多样性较小，墨兰的等位基因数为1.522，有效等位基因数为1.282，Nei′s基因多样性指数为0.164，Shannon多样性指数为0.248，多态性位点比例为52.24%，建兰的等位基因数为1.522，有效等位基因数为1.287，Nei′s基因多样性指数为0.171，Shannon多样性指数为0.259，多态性位点比例为52.24%。

2.3 种群间的遗传结构分析

根据Popgen分析种群间遗传结构（表5），基因分化度的范围为0.0347~0.9016，基因流的范围为0.0545~13.9015。兰属种群平均总遗传多样性指数为0.2767（标准偏差为0.0251），种群内遗传多样性指数为0.1934（标准偏差为0.0133），基因分化度为0.3009，基因流为1.1619，基因流的变化趋势与基因分化度相反，基因分化度越低，基因流越大。基因分化度显示，有30.09%的遗传多样性存在于种群间，而69.91%的遗传多样性存在于种群内部。种群间的平均基因流接近1，说明各种群间产生了一定程度的遗传分化［

13］。

表5  种群遗传结构参数
Table 5  Genetic structural parameters of Cymbidium

位点

Locus

总遗传多样性指数

Ht

种群内遗传多样性指数

Hs

基因分化度

Gst

基因流

Nm

位点

Locus

总遗传多样性指数

Ht

种群内遗传多样性指数

Hs

基因分化度

Gst

基因流

Nm

UBC811-1 0.1091 0.0925 0.1517 2.7949 UBC825-4 0.309 0.2847 0.0788 5.844
UBC811-2 0.4746 0.2254 0.5252 0.4521 UBC825-5 0.0731 0.0698 0.0446 10.7139
UBC811-3 0.4791 0.2956 0.383 0.8056 UBC826-1 0.4914 0.2025 0.5879 0.3505
UBC811-4 0.4857 0.2107 0.5662 0.383 UBC826-2 0.2458 0.2339 0.0485 9.7989
UBC811-5 0.3069 0.2257 0.2646 1.3896 UBC826-3 0.2884 0.1714 0.4055 0.7329
UBC811-6 0.4085 0.3445 0.1565 2.6942 UBC826-4 0.3064 0.2264 0.2612 1.4144
UBC811-7 0.3458 0.3053 0.117 3.7724 UBC826-5 0.1995 0.1502 0.2469 1.5248
UBC811-8 0.1652 0.1516 0.0828 5.5413 UBC827-1 0.2987 0.178 0.4041 0.7373
UBC811-9 0.2525 0.2243 0.1117 3.9775 UBC827-2 0.1339 0.1027 0.2333 1.6427
UBC811-10 0.0844 0.0784 0.0709 6.5495 UBC827-3 0.3827 0.3282 0.1424 3.0109
UBC823-1 0.479 0.3509 0.2675 1.3694 UBC827-4 0.3155 0.2742 0.1309 3.3195
UBC823-2 0.4534 0.2572 0.4327 0.6556 UBC827-5 0.2156 0.1708 0.208 1.9039
UBC823-3 0.2022 0.0199 0.9016 0.0545 UBC827-6 0.1809 0.1323 0.2686 1.3612
UBC823-4 0.0834 0.0795 0.0473 10.0785 UBC845-1 0.4823 0.3533 0.2674 1.3696
UBC823-5 0.0649 0.0578 0.1089 4.0908 UBC845-2 0.4918 0.4404 0.1046 4.2803
UBC823-6 0.1665 0.1501 0.0987 4.5666 UBC845-3 0.3046 0.2918 0.0421 11.3629
UBC823-7 0.0873 0.0752 0.1388 3.102 UBC845-4 0.2214 0.2049 0.0745 6.209
UBC824-1 0.4178 0.218 0.4782 0.5456 UBC845-5 0.0627 0.0601 0.0414 11.571
UBC824-2 0.4203 0.1909 0.5457 0.4162 UBC854-1 0 0
UBC824-3 0.3827 0.2449 0.3601 0.8884 UBC854-2 0.4797 0.3193 0.3344 0.9951
UBC824-4 0.0421 0.0403 0.0445 10.7279 UBC854-3 0.3508 0.3171 0.0962 4.6972
UBC824-5 0.2908 0.251 0.1371 3.1479 UBC854-4 0.2405 0.1579 0.3437 0.9548
UBC824-6 0.3311 0.2896 0.1253 3.4916 UBC857-1 0.3914 0.1381 0.6472 0.2726
UBC824-7 0.0523 0.0505 0.0347 13.9015 UBC857-2 0.349 0.2005 0.4255 0.6751
UBC825-1 0.4974 0.1574 0.6835 0.2315 UBC857-3 0.4817 0.3919 0.1863 2.1833
UBC825-2 0.3045 0.2712 0.1093 4.0732 UBC857-4 0.396 0.3311 0.164 2.5482
UBC825-3 0 0 UBC857-5 0.3748 0.3129 0.165 2.5299
UBC857-6 0.4941 0.3793 0.2324 1.6518 UBC864-6 0.3166 0.2931 0.0742 6.2419
UBC857-7 0.3754 0.291 0.2248 1.7239 UBC866-1 0 0
UBC857-8 0.0834 0.0795 0.0473 10.0785 UBC866-2 0 0
UBC864-1 0 0 UBC866-3 0.1339 0.1027 0.2333 1.6427
UBC864-2 0.2903 0.1023 0.6475 0.2722 UBC866-4 0.2755 0.2326 0.1557 2.7109
UBC864-3 0.4996 0.1122 0.7755 0.1448 均值Mean 0.2767 0.1934 0.3009 1.1619
UBC864-4 0.1484 0.0572 0.6144 0.3138 标准差SD 0.0251 0.0133
UBC864-5 0.4656 0.4083 0.1229 3.5673

8个兰属种群的方差分析结果（表6）显示，兰属种群内的差异较大，占总差异的98%，而种群间的差异较小，只占总差异的2%，表明兰属种群内的差异为主要差异。

表6  96份兰属种群的分子方差分析
Table 6  Analysis of molecular variance（AMOVA）of 96 Cymbidium populations

变异来源

Source of variation

自由度

df

方差总和

SS

平均方差

MS

变异组分

Est. Var.

变异百分率（%）

PV

种群间Among Populations 7 3.896 0.557 0.007 2
种群内Within Populations 88 41.250 0.469 0.469 98
总计Total 95 45.146 0.476 100

Est. Var.： Variance components； PV： Percentage of variation

当遗传分化固定指数Fst为0~0.05时，认为种群间遗传分化很小；遗传分化固定指数为0.05~0.15时，认为种群间存在中等程度的遗传分化；遗传分化固定指数为0.15~0.25时，种群间遗传分化较大；而遗传分化固定指数＞0.25时，则认为种群间有很大的遗传分化［

16］。对8个种群间的遗传分化固定指数进行估计（图2），8个种群间的两两遗传分化固定指数值范围为0.002~0.527，平均值为0.325（Fst＞0.05），这表明种群间遗传分化程度较大。

图2  8个种群两两间的遗传分化固定指数（Fst）

Fig. 2  The Fst values of pairwise populations during eight Cymbidium cultivars groups

2.4 种群间亲缘关系

由表7可知，8个种群的遗传一致度为0.8376~0.9236，均值为0.8825；遗传距离为0.0795~0.1773，均值为0.1253。最小的遗传距离在建兰和春兰两个种群之间，为0.0795，最大的遗传距离在寒兰和春剑两个种群之间，为0.1773。与遗传距离相反，春剑和寒兰种群间的遗传一致度最小，为0.8376，春兰和建兰种群间的遗传一致度最大，为0.9236，表明遗传距离越大，遗传一致度越小。

表7  兰属种群间遗传一致度与遗传距离
Table 7  Nei's original measures of genetic identity and genetic distance

种群

Populations

寒兰

C. kanran

杂交种

Hybrid

莲瓣兰

C. tortisepalum

墨兰

C. sinense

建兰

C. ensifolium

春兰

C. goeringii

蕙兰

C. faberi

春剑

C. goeringii var. longibracteatum

寒兰C. kanran 0.9115 0.8854 0.8936 0.9119 0.9119 0.8687 0.8376
杂交种Hybrid 0.0926 0.9050 0.9000 0.9101 0.9099 0.8953 0.8554
莲瓣兰C. tortisepalum 0.1217 0.0998 0.9170 0.8504 0.8604 0.8548 0.8815
墨兰C. sinense 0.1125 0.1053 0.0866 0.8846 0.8632 0.8754 0.8478
建兰C. ensifolium 0.0922 0.0942 0.1621 0.1226 0.9236 0.8901 0.8569
春兰C. goeringii 0.0922 0.0944 0.1504 0.1471 0.0795 0.8806 0.8741
蕙兰C. faberi 0.1408 0.1106 0.1568 0.1331 0.1164 0.1271 0.8542

春剑

C. goeringii var. longibracteatum

0.1773 0.1562 0.1261 0.1651 0.1544 0.1346 0.1576

对角线以上为遗传遗传一致度，对角线以下为遗传距离

Above diagonal is Nei's genetic identity and below diagonal is genetic distance

个体聚类（图3）表明，在遗传距离0.668处，可将96份兰属种质分为3类，其中第Ⅰ类共23份种质，包括10份莲瓣兰、12份春剑以及1份杂交种质，第Ⅱ类共6份种质，全部为寒兰，第Ⅲ类共67份种质。其中，J-2（暮山紫）与J-5（红猫蕊蝶）、J-3（素台北）与J-9（中岩彩荷）、M-8（日向）与M-9（天堂鸟）以及CJ-7（雅女）与CJ-8（玉海棠）的遗传距离较近，这些种质都属于相同种群。

图 3  96份兰属种质的UPGMA聚类分析

Fig.3  UPGMA clustering of 96 Cymbidium cultivars

编号同表1

Code is the same as table 1

兰属种群聚类分析（图4）表明，8个兰属种群可为3类，春兰和墨兰为第Ⅰ类，寒兰、春剑、蕙兰、莲瓣兰、建兰为第Ⅱ类，杂交种独为第Ⅲ类，与其他两类类种群之间的遗传距离较大。

图 4  8个兰属种群聚类图

Fig.4  UPGMA clustering of 8 Cymbidium populations

主坐标分析结果（图5）显示，前3个主成分占总变量的16.25%、10.67%和8.52%，共占总变量的35.44%，结果表明兰属种群间多样性较高，这也与上述结果一致。主坐标图中显示，莲瓣兰和春兰分布在主成分1的两端，表现出较远的亲缘关系，寒兰、建兰、蕙兰和墨兰在主成分1中有较多重叠，亲缘关系较近。

图 5  兰属8个种群的主坐标分析

Fig. 5  Principal coordinate analysis of eight Cymbidium cultivars groups

2.5 指纹图谱构建

从11份引物中筛选出能扩增出5条条带以上且能完全区分开所有种质的6条引物，分别为：UCB811、UCB823、UCB824、UCB827、UCB857、UCB864，用于指纹图谱的构建。首先建立每份材料的编码信息，包含种质的属名、种质名称、种质来源以及种质的条带数字信息，其中条带的数字信息是根据种质在不同引物中的条带位置，计算该种质在每条引物条带下的0、1矩阵值，再将该种质6条引物条带的矩阵值组合成相应的数字信息。以“倩云”为例，其属名是“寒兰”，种质名称为“倩云”，种质来源于浙江，再与0、1矩阵值组合起来，它的编码信息为：寒兰，倩云，浙江，0000000100UCB811，0110000UCB823，0010110UCB824，111000UCB827，00100110UCB857，110100UCB864。最后利用在线生成二维码软件 （http：//cli.im/）生成96份兰属种质的指纹图谱二维码（图6），同时二维码底部标注上对应种质名称和种质属名，便于查找。

图 6  兰属96份种质的二维码

Fig. 6  QR code information of 96 Cymbidium germplasm

3 讨论

本研究利用筛选出的11条引物在中96份材料共检测到67个多态性条带。兰属8个种群的等位基因数为1.925，有效等位基因数为1.450，Nei′s基因多样性指数为0.277，Shannon多样性指数为0.427，总多态性位点比例为92.54%，其中，总多态性位点比例高于江西省野生蕙兰［

13］（90.85%）和湖北省野生春兰［9］（63.06%）；Nei′s基因多样性指数高于江西省野生寒兰［12］（0.2649）和浙江省春兰［10］（0.2241），低于建兰［20］（0.584）等，说明兰属8个种群间的遗传多样性较高，总体上种群间的遗传多样性高于种群内。可推测出，兰属种群或因地理位置、生存环境等差异，在种群间仍保持着较高的遗传多样性，春兰等种群种质资源表现出丰富的多样性［21］。

基因流是影响遗传分化的重要因素，Hamrick等［

22］研究显示，基因流Nm>4时，种群间的基因交换相对充分，从而抵抗遗传漂变，防止种群间因遗传漂变而发生遗传分化；当Nm<1，种群间基因交流较少，种群间因遗传漂变及选择作用而产生遗传分化［23］。江亚雯等［12］认为寒兰（Nm=0.6325）是以异交为主的混交类群。高丽等［9］认为11个春兰居群间一定程度的遗传分化（Nm=0.8828）可能是由生境破坏和基因流障碍引起。谢慧敏等［24］认为江西省21个不同地理位置的春兰居群间遗传分化（Nm=0.9366）大于居群内的分化。本研究中，种群间的平均基因流Nm为1.1619，接近1，说明发生了一定程度的遗传漂变，各种群间产生了遗传分化。

基因分化度Gst与Fst关系密切，当一个位点只有2个等位基因时，二者相等；当有多个等位基因时，Gst等于所有等位基因的Fst的加权平均值［

16］，因此对于ISSR标记而言，Gst可与Fst值进行类比并以此判断种群间遗传分化程度。本研究种群内基因多样性指数Hs为0.1934，平均遗传分化系数Gst为0.3009，总遗传多样性Ht为0.2767，8个种群间的两两Fst平均值为0.325（Fst＞0.05），说明种群间遗传分化程度高，这也与Popgen的Fst计算结果0.2391（Fst＞0.05）一致。兰属植物多是以异交为主的混交类群［9］，这与种群间存在一定基因交流的分析结果相符。

彭德镇［

25］采用ISSR分子标记对390个春兰的遗传多样性进行了分析，表明21个居群两两之间的遗传一致度和遗传距离的变化范围分别为0.7769~0.9685和0.0320~0.2971。王宏利等［11］通过UPGMA法进行聚类分析表明供试材料的遗传相似系数在0.500~0.953之间，揭示了建兰品种间的亲缘关系。本研究8个种群的遗传一致度为0.8376~0.9236，均值为0.8825；遗传距离为0.0795~0.1773，均值为0.1253。吴振兴等［8］认为春兰和春剑亲缘关系最近，墨兰与建兰、蕙兰与莲瓣兰亲缘关系较近。孙叶等［17］认为中、日春兰遗传距离较小，中国春兰蝶花品种和日本春兰品种能分组聚类，中国春兰正格花品种和中国春兰杂交种聚类在一起。林榕燕等［26］对44份国兰品种资源进行聚类分析，其中春兰、春剑、莲瓣兰等品种聚为一类；墨兰与建兰分别聚为一类。本研究中，Z1为春兰与豆瓣兰的杂交种，Z2~Z5为日本选育的春兰，Z6~Z12为本单位选育的杂交种，聚类结果中看出，日本春兰与中国春兰间有遗传距离，莲瓣兰和春剑的大部分个体被聚类在一起，春兰、建兰、蕙兰、杂交兰聚类在一起，部分寒兰单独聚类在一起，这与主坐标分析结果一致。对兰属种群进行聚类分析，8个种群为为3类，春兰和墨兰为第Ⅰ类，寒兰、春剑、蕙兰、莲瓣兰、建兰为第Ⅱ类，杂交种独为第Ⅲ类，与其他两类种群之间的遗传距离较大。这与唐源江等［27］、袁媛等［28］认为剑莲兰组与寒蕙兰组亲缘关系最近的结果一致。

本研究利用ISSR标记技术对96份兰属植物的遗传多样性进行分析并构建指纹图谱，分析得出兰属种群间的遗传多样性较高，存在遗传漂变，并发生遗传分化。基于非加权组平均法，将春兰和墨兰聚为第Ⅰ类，寒兰、春剑、蕙兰、莲瓣兰、建兰为第Ⅱ类，杂交种独为第Ⅲ，与其他两类种群之间的遗传距离较大。研究结果可为兰属资源的保护与开发利用提供理论依据。

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