疣粒野生稻<bold>WRKY</bold>基因家族全基因组鉴定和分析

阮孙美; 张攀; 张敏; 曾千春; 张慧; 罗琼; RUAN Sunmei; ZHANG Pan; ZHANG Min; ZENG Qianchun; ZHANG Hui; LUO Qiong

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疣粒野生稻WRKY基因家族全基因组鉴定和分析 PDF

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罗琼 ¹
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1. 云南农业大学植物保护学院/云南生物资源保护与利用国家重点实验室，昆明 650201； 2. 云南农业大学农学与生物技术学院，昆明 650201

最近更新：2024-04-26

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230904001

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摘要

WRKY转录因子是高等植物中成员数量较多的转录因子之一，在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用。疣粒野生稻是栽培稻的近缘野生种，具有耐荫、耐旱和高抗白叶枯病等特性，是改良栽培稻的重要种质资源。本研究利用HMMER、Pfam 、SMART 、TBtools、NCBI软件和网站，在疣粒野生稻基因组中鉴定了94个编码WRKY转录因子的基因（OgWRKYs），不均一分布在12条染色体上，根据其所含WRKY 结构域的数量和锌指结构的特征，分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ组，II组成员最多（52个），与其他物种相似。除含有保守的WRKYGQK七肽序列外，还鉴定到6种变异类型，其中WRKYGHK、WRRYGQK、WRKYAKK和WRKYSQK是植物中首次报道的新变异类型。根据保守结构域分析， OgWRKY61、OgWRKY71和OgWRKY77a可能与植物抗病相关。KEGG pathway富集分析发现，有14个OgWRKY转录因子富集在植物-病原互作通路，其中10个同时富集在MAPK信号通路中。进一步结合顺式作用元件分析结果，推测OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111可能在疣粒野生稻响应生物和非生物胁迫中发挥重要作用。qRT-PCR 分析结果表明，OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88和OgWRKY111基因的表达均受白叶枯病菌PXO99诱导，而OgWRKY96表达受白叶枯病菌侵染抑制。研究结果对疣粒野生稻中优异OgWRKYs基因资源的挖掘具有重要参考价值。

关键词

疣粒野生稻; WRKY转录因子; OgWRKYs; 基因组学; KEGG分析

WRKY转录因子是高等植物中成员数量较多的转录因子之一，在植物的生长发育和衰老、非生物和生物胁迫等过程中发挥着重要的作用^［

1-2］。自1994 年，第1个WRKY 转录因子成员 SPF1 （Sweet-Potato-Factor-1）从甘薯（Ipomoea batatas （L.） Lam.）中克隆^{［参考文献 3-4}3-4］，此后，WRKY转录因子相继在拟南芥^{［参考文献 5

百度学术}5］、水稻^{［参考文献 6

百度学术}6］、大豆^{［参考文献 7

百度学术}7］等多个植物中被鉴定和研究。在过表达 TaWRKY19 基因的拟南芥中，编码脱水敏感元素结合蛋白2A （DREB2A，dehydration responsive element binding protein 2A）、脱水诱导蛋白29A（RD29A，Responsive to Dehydration 29A）、RD29B和冷调蛋白6.6（Cor6.6，Cold-regulated）的基因表达上调，植株对盐、干旱和冷胁迫的耐受性增强^{［参考文献 8

百度学术}8］。甘蔗（Saccharum officinarum L.） ScWRKY5 基因受盐胁迫和干旱胁迫诱导表达^{［参考文献 9

百度学术}9］。辣椒（Capsicum annuum L.）的WRKY蛋白CaWRKY27，可通过调节烟草（Nicotiana tabacum L.）植株中的水杨酸、茉莉酸和乙烯信号通路，增强对青枯雷尔氏菌感染的抗性^{［参考文献 10

百度学术}10］。在拟南芥中过表达水稻的OsWRKY45基因，可提高植株对盐胁迫和干旱胁迫的耐受性^{［参考文献 11

百度学术}11］。过表达OsWRKY13的水稻植株可增强对白叶枯病和稻瘟病的抗性，水杨酸合成和应答相关基因表达激活，茉莉酸合成和应答相关基因表达被抑制，表明OsWRKY13基因通过直接或间接调控水杨酸和茉莉酸上下游基因的表达，参与水稻的抗病性^{［参考文献 12

百度学术}12］。OsWRKY30正调控水稻对白叶枯病、纹枯病、稻瘟病和叶条纹病的抗性^{［参考文献 13-14}13-14］。过表达OsWRKY71基因的水稻植株可增强对水稻白叶枯病菌的抗性^{［参考文献 15

百度学术}15］。最近研究表明，OsWRKY31是MPK信号通路中与稻瘟病抗性相关的一个关键组分^{［参考文献 16

百度学术}16］。此外，AVRPI9相互作用蛋白（ANIP1，Avrpi9-interacting protein1）和OsWRKY62的模块可以调节水稻抗稻瘟病菌的基础防御和Pi9介导的免疫^{［参考文献 17

百度学术}17］。

WRKY 转录因子含有1~2个WRKY结构域，为DNA结合域，由约 60 个氨基酸残基组成，N 端包含典型的WRKYGQK七肽序列^［

18］或WRKYGEK、WRKYGKK、WRKYGRK、WRICGQK、WRMCGQK、WKKYGQK、WIKYGQK、WKRYGQK、WSKYEQK和WRKYSEK等变异序列 ^{［参考文献 19-21}19-21］，C 端包含锌指结构C2H2或C2HC^{［参考文献 18

百度学术}18］。WRKY转录因子可通过WRKY结构域与靶基因启动子区的顺式作用元件W-box （TTGACC/T）特异性结合，以此激活或抑制转录，进而调控下游基因的表达^{［参考文献 22-24}22-24］。根据 WRKY 转录因子所含WRKY 结构域数量和锌指结构的特征，将 WRKY 转录调控因子分为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ 4个组。Ⅰ组WRKY蛋白含有2个WRKY结构域，进一步根据所含锌指结构类型又分为Ia和Ib亚组，分别含C2H2（CX4-5-C-X22-23-H-X1-H）锌指结构和C2HC （C-X5-7-C-X23-H-X1-C）锌指结构^{［参考文献 25

百度学术}25］；Ⅱ组WRKY蛋白含有1个WRKY结构域和一个C2H2锌指结构，根据其锌指结构特征分为IIa，IIb，IIc，IId和IIe 5个亚组；Ⅲ组WRKY蛋白含有1个WRKY结构域和一个C2HC锌指结构；Ⅳ组WRKY蛋白锌指基序部分缺失或完全缺失，但含有1个WRKYGQK基序^{［参考文献 18

百度学术}18， 26-27］。WRKY转录因子的进化分析对理解植物生物多样性的整体机制，以及WRKY基因在植物调控网络中发挥的特殊功能具有重要意义。

稻属有24个种，其中9个种（11个基因组）中的WRKY 转录因子被鉴定和分析 ^［

28］，包括AA基因组的7个种：95个短舌野生稻（Oryza barthii A.Chev.）、93个展颖野生稻（Oryza glumaepatula Steud.）、88个南方野生稻（Oryza meridionalis Ng）、94个尼瓦拉野生稻（Oryza nivara Sharma & Shastry）、94个普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.）、87个非洲栽培稻（Oryza glaberrima Steud.）、98个亚洲栽培稻粳稻亚种日本晴（Oryza sativa subsp. japonica）、籼稻亚种（Oryza sativa subsp. indica）中94个明恢63 和98个R498 ，BB基因组的94个斑点野生稻（Oryza punctata Kotschy ex Steud.）和FF基因组的83个短花药野生稻（Oryza brachyantha A. Chev. & Roehr.） ^{［参考文献 28

百度学术}28］。GG基因组的疣粒野生稻（Oryza meyeriana subsp. granulata）是稻属中已知基因组最大的种^{［参考文献 29

百度学术}29］，具有对白叶枯病菌高抗甚至免疫、抗虫、抗旱、耐荫等特性，但疣粒野生稻基因组中WRKY转录因子系统的生物信息学分析及其在抗病抗逆中的作用还鲜有报道。本研究基于发表的疣粒野生稻全基因组（http：//bigd.big.ac.cn/gwh）和转录组数据^{［参考文献 29-30}29-30］，利用生物信息学手段、对疣粒野生稻WRKY家族基因进行基因组水平上的系统鉴定和分析，为疣粒野生稻中优异OgWRKY基因的挖掘和功能研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 疣粒野生稻基因组中WRKY家族基因鉴定及分类

从Genome Warehouse（http：//bigd.big.ac.cn/gwh）下载疣粒野生稻的基因组数据^［

29］，登录号为GWHAAEL00000000。从 Pfam 数据库（http：//pfam.sanger.ac.uk/）下载WRKY 保守结构域 HMM 隐马尔科夫模型（PF03106）文件。利用 HMMER 3.0进行疣粒野生稻基因组搜索，搜索条件为“含有WRKY结构域”。搜索结果提交到NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）、SMART（http：//smart.embl-heidelberg.de/）和 Pfam 数据库，对序列的保守结构域进行二次鉴定。剔除不含WRKYGQK基序或其变体（WRKYGKK、WRKYGEK、WRKYGRK、WKKYGQK、WKRYGQK和WSKYEQK等）的序列。通过TBtools v1.098769 软件与栽培稻日本晴（Nipponbare）WRKY蛋白进行同源比对，选择与其同源性最高的基因进行命名，其中日本晴中WRKYs蛋白序列在国家水稻数据中心下载（www.ricedata.com）。OgWRKYs蛋白全长序列采用MEGA11中的MUSCLE方法进行多序列比对，按照WRKY结构域进行分组^{［参考文献 27

百度学术}27， 31］。分组后的多序列比对结果通过DNAMAN软件进行可视化。

1.2 染色体定位和共线性分析

利用RagTag工具包^［

32］基于参考基因组把疣粒野生稻基因组组装到染色体水平，TBtools 软件获取染色体长度及OgWRKY 基因在染色体上的位置信息。最后用在线软件MG2C^{［参考文献 33

百度学术}33］进行基因染色体位置可视化。通过TBtools的MCScanX功能进行物种间共线性分析，并采用 TBtools软件进行可视化。

1.3 OgWRKY转录因子系统发育、保守基序和保守结构域分析

利用MEGA 11软件中的MUSCLE进行疣粒野生稻WRKY转录因子的WRKY结构域和全长氨基酸序列比对。基于疣粒野生稻的WRKY结构域（包括N-末端和C-末端结构域）和预测的完整蛋白序列，利用MEGA 11构建邻接系统发育树，bootstrap复制为1000。最后使用ggtree对进化树进行美化^［

34］。通过MEME（http：∥meme suite.org/tools/meme）在线工具预测分析保守基序，基序最大数目设置为10；利用 TBtools v1.098769 软件的基因结构视图（高级）工具将 OgWRKYs进化树数据、meme.xml 文件和多序列比对的保守结构域位置信息绘制为OgWRKY 家族的系统发育进化树、保守基序分布、保守结构域组合图。

1.4 OgWRKY转录因子KEGG富集分析

通过在线工具eggNOG（http：//eggnog-mapper.embl.de/）获取疣粒野生稻的注释文件，使用AnnotationForge构建了疣粒野生稻的Orgdb包org.Oryza granulata.eg.db，然后使用clusterProfiler进行KEGG （Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）富集分析。

1.5 OgWRKYs启动子区域顺式作用元件分析

提取OgWRKYs基因 5'端上游 2000 bp的序列，利用 Plant CARE （http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）网站进行顺式作用元件信息分析，并用 TBtools v1.098769软件的 Simple BioSequence Viewer 工具进行可视化。

1.6 OgWRKYs基因在白叶枯病菌胁迫下的表达分析

利用MiniBEST Plant RNA Extraction Kit试剂盒（TaKaRa 公司）提取接种H₂O（对照）和白叶枯病菌PXO99后0 h、24 h、48 h和72 h的疣粒野生稻叶片总RNA，然后用TOYOBO公司的ReverTra Ace qPCR RT Master Mix RNA反转录试剂盒将总RNA反转录成cDNA。以Actin基因（LOC_Os11g06390）作为内参，使用Promega公司的GoTaq qPCR Master Mix荧光定量试剂盒进行qRT-PCR检测。反应体系10 μL：5 μL qPCR Master Mix，0.25 μL正向引物，0.25 μL反向引物，2 μL cDNA， 2.5 μL ddH₂O。扩增程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，60 ℃退火60 s，40个循环；熔解程序：95 ℃，15 s；60 ℃，15 s；95 ℃，15 s。使用 2^-ΔΔCT 方法测定相对表达水平^［

35］，引物如表1。

表 1 OgWRKY基因表达分析的实时荧光定量引物

Table 1 Real-time fluorescence quantitative primers for OgWRKY gene expression analysis

引物名称 Primer name	引物序列（5'-3'） Primer sequence（5'-3'）
引物名称 Primer name	正向 Forword	反向 Reverse
Actin	GAGTATGATGAGTCGGGTCCAG	ACACCAACAATCCCAAACAGAG
OgWRKY30b	ATGCTTCATCTGCACCACAGGC	TGGTTTCTTGGTGGGAGAATGAAG
OgWRKY53	CGAGTAGTAGAGGCGAGCAAGA	GCTTCCCTTCACCTGCTTCT
OgWRKY88	AGGATTGATGATGGATCTGCTGG	TCGCCACCTATAACCATCATCC
OgWRKY96	ACCACGTCTGGTCTGTCAGGTG	TTCGTGTGGCCTTGATTCACC
OgWRKY111	AGCACCGAATCGTGCTCCATG	TCCAAGAACTCCGTCGTCGTC

2 结果与分析

2.1 疣粒野生稻基因组中WRKY家族基因鉴定

利用软件HMMER 3.0在疣粒野生稻基因组中搜索到98条编码WRKY蛋白的候选DNA序列，其中有4条序列（GWHTAAEL007838、GWHTAAEL017314、GWHTAAEL017324和GWHTAAEL038547）不含编码WRKY结构域的序列（Genome Warehouse（http：//bigd.big.ac.cn/gwh））。最终，在疣粒野生稻基因组中鉴定了94个编码WRKY蛋白的基因（表2）。与其他稻属11个基因组相比^［

28］，在疣粒野生稻基因组中没有鉴定到WRKY40和WRKY60的同源基因，而WRKY23、WRKY46、WRKY64、WRKY66、WRKY69、WRKY77和WRKY114的同源基因在疣粒野生稻基因组中鉴定到2个， WRKY30的同源基因有3个（OgWRKY30a， OgWRKY30b和OgWRKY30c）（表2）。推测WRKY基因家族在稻属不同种中具有组成上的多样性。

表2 OgWRKYs基因相关信息

Table 2 Information related to OgWRKY genes

基因名称 Gene name	MSU基因座 MSU locus	编码区ID CDS ID	氨基酸数量 Number of amino acid	WRKY基序 WRKY motif	锌指类型 Zinc finger type	组/亚组 Group/Subgroup	染色体 Chromosome
OgWRKY1	LOC_Os01g14440	GWHTAAEL025149	560	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	1
OgWRKY2	LOC_Os10g42850	GWHTAAEL017997	307	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	10
OgWRKY3	LOC_Os03g55080	GWHTAAEL008180	193	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	3
OgWRKY4	LOC_Os03g55164	GWHTAAEL008165	423	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	3
OgWRKY5	LOC_Os05g04640	GWHTAAEL018663	505	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	5
OgWRKY6	LOC_Os03g58420	GWHTAAEL049835	388	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	3
OgWRKY7	LOC_Os05g46020	GWHTAAEL027725	228	WRKYGKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	5
OgWRKY8	LOC_Os05g50610	GWHTAAEL012915	326	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	5
OgWRKY9	LOC_Os01g18584	GWHTAAEL003764	559	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	1
OgWRKY10	LOC_Os01g09100	GWHTAAEL016201	208	WRKYGKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY11	LOC_Os01g43650	GWHTAAEL042449	365	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY12	LOC_Os01g43550	GWHTAAEL042440	346	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	1
OgWRKY13	LOC_Os01g54600	GWHTAAEL009521	328	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	1
OgWRKY14	LOC_Os01g53040	GWHTAAEL020175	311	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	1
OgWRKY15	LOC_Os01g46800	GWHTAAEL039613	355	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY16	LOC_Os01g47560	GWHTAAEL009341	366	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY17	LOC_Os01g74140	GWHTAAEL021294	366	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY18	LOC_Os10g18099	GWHTAAEL003187	262	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	10
OgWRKY19	LOC_Os05g49620	GWHTAAEL051876	134	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	5
OgWRKY20	LOC_Os01g60540	GWHTAAEL035800	366	WRKYGQK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY21	LOC_Os01g60640	GWHTAAEL035798	283	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY22	LOC_Os01g60490	GWHTAAEL035802	245	WRKYGQK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY23a	LOC_Os01g53260	GWHTAAEL020198	246	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY23b	LOC_Os01g53260	GWHTAAEL011964	185	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	5
OgWRKY24	LOC_Os01g61080	GWHTAAEL007473	546	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	1
OgWRKY25	LOC_Os08g13840	GWHTAAEL007440	281	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	8
OgWRKY26	LOC_Os01g51690	GWHTAAEL013662	224	WRKYGKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY27	LOC_Os01g40430	GWHTAAEL014181	162	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	1
OgWRKY28	LOC_Os06g44010	GWHTAAEL042148	336	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱa	6
OgWRKY29	LOC_Os07g02060	GWHTAAEL008658	303	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	7
OgWRKY30a	LOC_Os08g38990	GWHTAAEL023546	692	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	8
OgWRKY30b	LOC_Os08g38990	GWHTAAEL032254	699	WRKYGHK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	9
OgWRKY30c	LOC_Os08g38990	GWHTAAEL023550	433	WRKYGQK	NO	Ⅳ	8
OgWRKY31	LOC_Os06g30860	GWHTAAEL010974	383	WRKYGQK	C-X5-C-X23-H-X2-H	Ⅱe	6
OgWRKY32	LOC_Os02g53100	GWHTAAEL017354	555	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	2
OgWRKY34	LOC_Os02g43560	GWHTAAEL010736	236	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	2
OgWRKY35	LOC_Os04g39570	GWHTAAEL040303	602	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	4
OgWRKY36	LOC_Os04g46060	GWHTAAEL006992	244	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	4
OgWRKY37	LOC_Os04g50920	GWHTAAEL016377	458	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	4
OgWRKY39	LOC_Os02g16540	GWHTAAEL019838	347	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	2
OgWRKY42	LOC_Os02g26430	GWHTAAEL048897	256	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	2
OgWRKY43	LOC_Os05g49210	GWHTAAEL011863	601	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	5
OgWRKY45	LOC_Os05g25770	GWHTAAEL048986	318	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	5
OgWRKY46a	LOC_Os11g02480	GWHTAAEL040814	226	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY46b	LOC_Os11g02480	GWHTAAEL009148	224	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	11
OgWRKY47	LOC_Os07g48260	GWHTAAEL014235	293	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	7
OgWRKY48	LOC_Os05g40060	GWHTAAEL042918	247	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	5
OgWRKY49	LOC_Os05g49100	GWHTAAEL042365	418	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	5
OgWRKY51	LOC_Os04g21950	GWHTAAEL034539	326	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	4
OgWRKY53	LOC_Os05g27730	GWHTAAEL032827	503	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	5
OgWRKY54	LOC_Os05g40080	GWHTAAEL042921	322	WRKYGQK	C-X7-C-X26-HXC	Ⅲ	5
OgWRKY55	LOC_Os03g20550	GWHTAAEL025612	210	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	3
OgWRKY56	LOC_Os01g62514	GWHTAAEL024338	342	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY57	LOC_Os12g01180	GWHTAAEL037899	441	WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH	Ⅱc	11
OgWRKY61	LOC_Os11g45850	GWHTAAEL033777	1434	WRRYGQK/WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC/C-X7-C-X23-HXC	Ⅰb	11
OgWRKY62	LOC_Os09g25070	GWHTAAEL040421	298	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱa	9
OgWRKY64a	LOC_Os12g02450	GWHTAAEL040816	315	WRKYGQK	C-X7-C-X34-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY64b	LOC_Os12g02450	GWHTAAEL007837	309	WRKYGQK	C-X7-C-X33-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY65	LOC_Os12g02470	GWHTAAEL034479	333	WRKYGQK	C-X7-C-X30-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY66a	LOC_Os02g47060	GWHTAAEL006945	477	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	2
OgWRKY66b	LOC_Os02g47060	GWHTAAEL043471	227	WRKYSQK	NO	Ⅳ	9
OgWRKY67	LOC_Os05g09020	GWHTAAEL005696	215	WRKYGKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	5
OgWRKY68	LOC_Os04g51560	GWHTAAEL027974	305	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	4
OgWRKY69a	LOC_Os08g29660	GWHTAAEL035782	315	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	8
OgWRKY69b	LOC_Os08g29660	GWHTAAEL015346	405	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	5
OgWRKY70	LOC_Os05g39720	GWHTAAEL050973	573	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	5
OgWRKY71	LOC_Os02g08440	GWHTAAEL038027	342	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱa	2
OgWRKY72	LOC_Os11g29870	GWHTAAEL015332	238	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	11
OgWRKY73	LOC_Os06g05380	GWHTAAEL031376	531	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	6
OgWRKY74	LOC_Os09g16510	GWHTAAEL025256	342	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	9
OgWRKY76	LOC_Os09g25060	GWHTAAEL040423	330	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱa	9
OgWRKY77a	LOC_Os01g40260	GWHTAAEL034111	1021	WRKYAKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	8
OgWRKY77b	LOC_Os01g40260	GWHTAAEL014193	213	WRKYGKK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY79	LOC_Os03g21710	GWHTAAEL014699	357	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	3
OgWRKY80	LOC_Os03g63810	GWHTAAEL014025	372	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	3
OgWRKY81	LOC_Os03g33012	GWHTAAEL013315	364	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	3
OgWRKY84	LOC_Os05g40070	GWHTAAEL042919	264	WRKYGEK	C2XX	Ⅳ	5
OgWRKY87	LOC_Os07g39480	GWHTAAEL027488	617	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	7
OgWRKY88	LOC_Os07g40570	GWHTAAEL023512	364	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	7
OgWRKY89	LOC_Os08g17400	GWHTAAEL015781	401	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	8
OgWRKY94	LOC_Os12g40570	GWHTAAEL024415	437	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	12
OgWRKY96	LOC_Os12g32250	GWHTAAEL050054	442	WRKYGQK/WRKYGQK	C-X4-C-X22-HXH/C-X4-C-X23-HXH	Ⅰa	12
OgWRKY102	LOC_Os01g08710	GWHTAAEL016232	279	WRKYGQK	C-X4-C-X23-HXH	Ⅱc	1
OgWRKY104	LOC_Os11g02520	GWHTAAEL009146	277	WRKYGQK	C-X7-C-X27-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY107	LOC_Os01g09080	GWHTAAEL016202	519	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱb	1
OgWRKY108	LOC_Os01g60600	GWHTAAEL035799	337	WRKYGQK	C-X7-C-X25-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY109	LOC_Os05g03900	GWHTAAEL018707	180	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	5
OgWRKY111	LOC_Os05g50700	GWHTAAEL012910	307	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱe	5
OgWRKY113	LOC_Os06g06360	GWHTAAEL007274	385	WRKYGQK	C-X7-C-X23-HXC	Ⅲ	6
OgWRKY114a	LOC_Os12g02400	GWHTAAEL009150	360	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	11
OgWRKY114b	LOC_Os12g02400	GWHTAAEL038377	324	WRKYGEK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	12
OgWRKY115	LOC_Os07g27670	GWHTAAEL008610	218	WRKYGQK	NO	Ⅳ	7
OgWRKY116	LOC_Os01g60520	GWHTAAEL035801	275	WRKYGQK	C-X7-C-X24-HXC	Ⅲ	1
OgWRKY121	LOC_Os03g53050	GWHTAAEL000091	388	WRKYGQK	C-X5-C-X23-HXH	Ⅱd	8

疣粒野生稻中有两个或三个预测的WRKY基因搜索到日本晴中同一个WRKY基因时，按相似性高低，分别在基因名后加a、b、c，进行区分

When two or three predicted WRKY genes in O.granulata search for the same WRKY gene in Nipponbare， they are distinguished by adding a， b， and c after the gene name according to the similarity

2.2 OgWRKY转录因子分类

参考Xie等 ^［

27］的方法，使用MEGA11中的MUSCLE进行OgWRKYs蛋白的氨基酸全长序列比对和结构域分析， 94个OgWRKY蛋白分为I、II、III和IV 4组。Ⅰ组有12个成员，含有两个WRKY结构域，其中含C2H2（C-X4-C-X22-23-HXH）型锌指基序的为Ia亚组（11个蛋白），含C2HC（C-X7-C-X23-HXC）型锌指基序的为Ib亚组（1个蛋白）。II组有52个成员，含有一个WRKY基序和C2H2型锌指基序，进一步根据锌指基序的序列特征又分为IIa、IIb、IIc、IId和IIe 5个亚组。IIa亚组含有C-X5-CPVKKKVQR基序（4个蛋白）； IIb亚组含有C-X5-CPV（R/K）KQVQRC基序（8个蛋白）； IIc亚组含有C-X4-C基序（22个蛋白）； IId亚组含有C-X5-CPARKHVER基序（7个蛋白）； IIe亚组含有C-X5-C（P/A/M/S）ARK（Q/M）V（E/D）基序（11个蛋白）。Ⅲ组有26个成员，含有一个WRKY基序和一个C2HC型锌指基序。IV组有4个成员，含有WRKY基序，但缺少锌指基序或锌指基序不完整（图1）。

图1 OgWRKYs保守结构域多序列比对（MSA）

Fig.1 OgWRKYs conserved domain multiple sequence alignment （MSA）

蓝色代表100%序列一致性，粉色表示大于75%的序列，青色表示小于75%的序列。红框表示保守的七肽序列，红线表示锌指结构域。Os：水稻；Og：疣粒野生稻

Blue represents 100% sequence consistency， pink represents sequences greater than 75%， cyan represents sequences less than 75%. The red box indicates conserved heptapeptide sequences， and the red line indicates zinc finger domains. Os：Oryza sativa；Og：Oryza granulata

本研究结果表明，Ⅰb亚组也存在于GG染色体组的疣粒野生稻基因组中。疣粒野生稻基因组中绝大多数WRKY成员（78个）都包含保守的WRKYGQK基序，少数为WRKYGHK （1个）、WRKYGKK（5个）、WRKYGEK（7个）、WRRYGQK （1个）、WRKYAKK（1个）和WRKYSQK（1个）变异体，其中WRKYAKK、WRKYGHK 、WRRYGQK 和WRKYSQK，是本研究在疣粒野生稻中鉴定的新变异体（图1，表2）。

2.3 染色体定位和共线性分析

94个OgWRKY基因不均匀地分布在疣粒野生稻的12条染色体上，分布数量最多的是1号染色体（23个），其次是5号染色体（17个），最少的是10号染色体（2个），一些OgWRKY基因在染色体1、5和12上成簇分布（图2），可能由基因重复事件产生。此外，对疣粒野生稻和水稻进行了共线性分析（图3）。结果显示，疣粒野生稻有 64个 OgWRKYs 基因与水稻形成共线性基因对。说明疣粒野生稻和水稻在进化过程中有较高的基因交流和相似性，但在驯化过程中部分WRKY家族基因发生了遗传变异，这些变异可能对水稻的性状和适应性产生影响。

图2 OgWRKY基因家族染色体分布及数量

Fig. 2 Chromosome distribution and number of OgWRKY gene family

图3 疣粒野生稻和水稻WRKY基因家族共线性分析

Fig. 3 Collinearity analysis of WRKY gene families in O. granulata and rice

2.4 OgWRKY转录因子系统发育分析

首先利用MUSCLE对94个OgWRKY蛋白的WRKY结构域序列进行比对，并利用MEGA 11构建具有1000个bootstrap重复的邻接进化树（图4）。Ia亚组OgWRKYs的聚为两个分支，N端结构域聚为IaN支，C端结构域聚为IaC支。Ib亚组只有一个成员OgWRKY61，N端和C端结构域聚在一起，与Ⅲ组成员聚集为一个分支，暗示疣粒野生稻Ib亚组成员可能由III亚组进化而来。II组成员聚为4个分支， IIa和IIb亚组聚为一支，IId和IIe亚组聚为一支。IIc亚组聚为IIc1和IIc2两个分支，大多数IIc亚组成员聚在与IaC分支相邻的IIc1分支中，但OgWRKY35聚在IaC分支中，OgWRKY57聚在IaN分支中，暗示疣粒野生稻IIc亚组和Ia亚组成员之间存在某种进化上的联系。疣粒野生稻Ⅳ组的成员有4个（OgWRKY30c、OgWRKY66b、OgWRKY84和OgWRKY115），分别聚在 IIc1、IIe、Ⅲ和Ⅲ组，表明IV组WRKY基因可以通过其他任何组的WRKY基因失去WRKY结构域的一部分衍生而来。

图4 疣粒野生稻WRKY蛋白的系统发育树

Fig. 4 Phylogenetic tree of WRKY proteins in O.granulata

A：疣粒野生稻WRKY结构域构建的系统发育树；B：疣粒野生稻WRKY蛋白的全长氨基酸序列构建的系统发育树；不同颜色的演化支代表不同的组/亚组，蛋白名称带橘色标示Ⅳ组成员，淡粉色标示Ⅰb亚组成员，紫色标示Ⅱc亚组成员，绿色标示Ⅱd亚组成员，蓝色标示Ⅱe亚组成员

A： Phylogenetic tree constructed by WRKY domain of O.granulata； B： Phylogenetic tree constructed from full-length amino acid sequence of WRKY protein of O.granulata；Different colors of clades represent different groups/subgroups， the protein names are orange for group IV members， light pink for group Ib members， and purple for group Ⅱc members. Members of the Ⅱd subgroup are identified in green， and members of the Ⅱe subgroup are identified in blue

由WRKY结构域构建的系统发育树可能会遗漏一些基因进化的重要信息。为此，进一步利用OgWRKYs蛋白的氨基酸全长序列构建了邻接系统发育树（图4A）。结果显示，蛋白氨基酸全长系统发育树与域树总体相似，但也存在一些差异（图4B）。在结构域树中IIc亚组成员聚在2个分支中，而蛋白氨基酸全长系统发育树中聚为IIc1、IIc2和IIc3三个分支；在结构域树中，IIc亚组成员OgWRKY35与IaC聚在一起，而在蛋白氨基酸全长系统发育树中位于IIc1分支中；在结构域树中的Ⅱd亚组成员OgWRKY6在蛋白氨基酸全长系统发育树中与Ⅱe亚组成员聚在一起；结构域树中Ⅱe亚组成员OgWRKY109在蛋白氨基酸全长系统发育树中与Ⅱd亚组成员聚在同一分支。以上结果进一步表明，疣粒野生稻IIc亚组和Ia亚组成员进化关系密切，并且进一步支持IId和IIe亚组合并为一个亚组的观点。

2.5 OgWRKYs蛋白保守基序和结构域分析

为了进一步了解OgWRKY蛋白基序的相似性和多样性，使用MEME Online软件对OgWRKY蛋白的10个保守基序进行了分析。结果显示，不同OgWRKY蛋白中含有motif数量1~7个不等，同一组或亚组的OgWRKYs具有基本一致的保守基序（图5A）。Ia亚组基序数量最多，含有7个motif。motif 1位于I组的C端WRKY结构域， motif 3位于N端WRKY结构域。除Ⅳ组OgWRKY66b外，所有OgWRKY蛋白均含有motif 1，而motif 3仅存在于Ia亚组蛋白中。Motif 2位于锌指结构域。在Ⅰa亚组中，C端WRKY结构域主要由motif 1、motif 2、motif 4和 motif 7组成。Ⅰa亚组N端WRKY结构域含有motif 3、motif 6和motif 10，motif 10为Ⅰa亚组N端WRKY结构域所特有。在Ⅰb亚组中，N端和C端WRKY结构域都含有motif 1和 motif 2，与半数Ⅲ组WRKY家族成员的所含基序一致。此外，Ⅲ组一些成员的WRKY结构域还含有特有的motif 5。IIa 和IIb亚组含有基序motif 1、 motif 2、motif 7和 motif 9，motif 9为其特有；IId 和IIe亚组含有共同基序motif 1、 motif 2和motif 8，motif 8为IId 和IIe亚组所特有。IId 和IIe亚组区别在于，IIe亚组除OgWRKY31外，其余蛋白皆含有motif 7；而IId 亚组只有OgWRKY6含有motif 7。

图5 OgWRKYs保守基序（A）和保守结构域（B）

Fig.5 Conserved motif （A） and conserved domain（B） of OgWRKYs

系统发育树中，青色代表Ⅰa亚组，灰色代表Ⅰb亚组，粉色代表Ⅱa亚组，黄色代表Ⅱb亚组，紫色代表Ⅱc，绿色代表Ⅱd亚组，蓝色代表Ⅱe亚组，红色代表Ⅲ组，白色代表Ⅳ组

In phylogenetic trees， cyan shading represents subgroup Ⅰa， gray represents subgroup Ⅰb， pink represents subgroup Ⅱa， yellow represents subgroup Ⅱb， purple represents subgroup Ⅱc， green represents subgroup Ⅱd， blue represents subgroup Ⅱe， red represents group Ⅲ， and white represents group Ⅳ

在疣粒野生稻基因组中鉴定的94个WRKY家族基因中，有90个基因都编码含有至少一个约由60个氨基酸组成的典型WRKY结构域，而OgWRKY30c、 OgWRKY66b、OgWRKY84和OgWRKY115的WRKY结构域不完整，鉴定的WRKY结构域只有19~48个氨基酸。除WRKY结构域之外，有15个OgWRKY蛋白还含有其他结构域（图5B）。Ⅰa亚组的OgWRKY30b和Ⅱc亚组的OgWRKY35包含一个PHA03247 Superfamily，但其功能尚不清楚。Ⅰb亚组的OgWRKY61包含NB-ARC、PLN03091和Rx_N结构域。NB-ARC结构域，由植物抗性基因产物和调节子共享，在植物抗性中作为信号基序起作用^［

36］；Rx_N结构域代表植物抗性蛋白中发现的N端结构域；PLN03091功能尚不清楚。Ⅱa亚组 OgWRKY71包含一个bZIP Superfamily结构域，植物bZIP参与调控花的发育、种子成熟、休眠和衰老等诸多生物学过程中担任重要作用^{［参考文献 37

百度学术}37］。Ⅱb亚组 OgWRKY32包含一个MDN1 超家族结构域，Mdn1是一种重要的AAA（与各种活动相关的ATP酶）蛋白，它利用ATP水解产生的能量对核糖体的60S亚基进行物理重塑和重构，从而使其成熟^{［参考文献 38-39}38-39］。Ⅱc亚组的OgWRKY57包含一个ULP1超家族结构域，Ulp1是小泛素样修饰物（SUMO， Small ubiquitin-like modifier）蛋白酶，负责从特定靶蛋白中去除SUMO/Smt3，并将前体小泛素样修饰物加工成其共轭功能形式^{［参考文献 40

百度学术}40］。OgWRKY77a含NB-ARC和RX-CC_like结构域，其中RX-CC_like结构域主要有3种功能：一是具有保守的EDVID基序，参与Rx分子内相互作用；二是与Rx的细胞内辅因子RanGAP2直接相互作用，这种相互作用为Rx抗病功能所必需；三是RX-CC_like结构域本身具有在细胞核内定位的特性，能够影响Rx的亚细胞分布，而Rx的核-质分布对其抗病功能的发挥也有显著影响^{［参考文献 41

百度学术}41］。6个IId亚组的OgWRKYs （OgWRKY25、OgWRKY42、OgWRKY51、OgWRKY68、OgWRKY94和OgWRKY121）中存在植物锌簇结构域（Plant_Zn_clust），与Jiang等^{［参考文献 42

百度学术}42］对药用野生稻的研究结果相似，但植物锌簇结构域功能尚不清楚。以上结果表明，OgWRKY61、OgWRKY71和OgWRKY77a可能与植物抗病相关。

2.6 OgWRKYs 家族KEGG富集分析

对94个OgWRKYs基因进行了KEGG通路富集分析，14个OgWRKY富集在基因植物-病原互作（Plant-pathogen interaction）通路，其中OgWRKY12、OgWRKY24、OgWRKY31、OgWRKY39、OgWRKY53、OgWRKY70、OgWRKY81、OgWRKY88、OgWRKY96、和OgWRKY111同时富集在MAPK信号通路（MAPK signaling pathway）（图6）。除OgWRKY30c的WRKY结构域不完整，功能可能丧失外，这些基因可能在疣粒野生稻抗病抗中具有重要作用。

图 6 OgWRKYs KEGG富集分析

Fig.6 KEGG enrichment analysis of OgWRKYs

A： KEGG富集到的两个通路；B： KEGG 的植物-病原互作通路和MAPK信号通路中富集到的OgWRKYs

A： Two pathways enriched by KEGG； B： OgWRKYs enriched in KEGG's plant-pathogen interaction and MAPK signaling pathway-plant

2.7 OgWRKYs基因的启动子区域顺式元件分析

进一步对上述除OgWRKY30c外的13个基因起始密码子上游2000 bp序列中5个与植物防御应答有关的顺式作用元件进行分析，发现在9个基因中（OgWRKY12、OgWRKY24、OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY70、OgWRKY81、OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111）鉴定到茉莉酸甲酯应答元件（TGACG/ CGTCA-motif）。在OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88和OgWRKY96 的启动子中还鉴定到乙烯响应元件（ERE），在OgWRKY111中还鉴定到水杨酸应答元件（TCA），OgWRKY53中鉴定到参与防御和应激反应的TC富集区（TC-rich repeats）（图7）。

图7 OgWRKYs基因启动子区顺式元件的鉴定

Fig.7 Identification of cis-regulatory elements in the promoter region of the OgWRKYs gene

TGACG-motif：茉莉酸甲酯响应元件； CGTCA-motif：茉莉酸甲酯响应元件； TCA元件：水杨酸响应元件；ERE：乙烯响应元件； TC-rich重复序列：防御和应激反应元件

TGACG-motif： MeJA response element； CGTCA-motif： MeJA response element； TCA element ：SA response element； ERE： Ethylene response element； TC-rich repeat sequences： Defense and stress response elements

2.8 OgWRKYs基因在白叶枯病菌胁迫下的表达分析

为了进一步研究OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111在白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. Oryzae，Xoo）PXO99胁迫下的表达特征，分别检测这5个基因在接种 H₂O（对照）和白叶枯病菌PXO99后0 h，24 h，48 h和72 h的表达水平（图8）。结果显示，同对照相比，OgWRKY30b在接种白叶枯病菌后24 h、48 h和72 h表达水平显著上升，分别为对照的2.3倍、2.04倍和1.62倍。同对照相比，OgWRKY53在接种白叶枯病菌后48 h表达水平显著上调，为对照的1.44倍，而接种后24 h和72 h与对照无显著差异。同对照相比，OgWRKY88在接种白叶枯病菌后0 h表达水平开始上升，并在24 h和48 h显著上调，分别为对照的2.21倍和1.91倍，72 h后与对照无显著差异。同对照相比，OgWRKY96在接种白叶枯病菌后48 h和72 h表达水平降低，分别为对照的0.7倍和0.52倍。同对照相比，OgWRKY111在接种白叶枯病菌后24 h、48 h和72 h后表达水平显著上升，分别为对照的2倍、3.28倍和1.9倍。以上结果表明，OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88和OgWRKY111基因的表达均受白叶枯病菌PXO99诱导，而OgWRKY96表达受白叶枯病菌侵染抑制。

图8 疣粒野生稻OgWRKYs基因接种PXO99后的相对表达水平

Fig. 8 Relative expression level of OgWRKYs gene in O.granulata inoculated with PXO99

不同小写字母表示在 P<0.05 水平上差异显著

Different lowercase letters indicate significant difference at the P<0.05 level

3 讨论

WRKY家族是植物成员数量较多的转录因子家族之一，在植物发育和对生物和非生物胁迫的响应中具有重要作用^［

43］。疣粒野生稻具有高抗细菌性条斑病、免疫白叶枯病菌^{［参考文献 44

百度学术}44］、抗虫、耐旱和耐荫等特性^{［参考文献 45-46}45-46］。2018年发表了第1个疣粒野生稻全基因组和不同组织部位转录组数据^{［参考文献 29

百度学术}29， 47］，2020年发表了第2个疣粒野生稻的组学数据^{［参考文献 48

百度学术}48］，这为本研究利用这些数据从基因组水平上系统分析WRKY家族基因提供了条件。

本研究鉴定了94个 OgWRKYs基因，将其分为4组，Ⅰ（Ia和Ib）、Ⅱ（IIa、IIb、IIc、IId和IIe）Ⅲ、Ⅳ组分别有12、52、26和4个成员。Rinerson 等^［

49］认为Ia亚组是WRKY家族最原始的祖先，其他亚组的WRKY都是从Ia亚组蛋白的C-末端结构域进化而来。本研究的OgWRKYs系统发育分析显示，IIc亚组OgWRKY35的结构域聚集在IaC分支中， OgWRKY57的结构域聚集在IaN分支中。OgWRKY结构域序列分析结果显示，Ⅰa亚组蛋白N端和C端的WRKY结构域皆与IIc亚组WRKY结构域具有一样的锌指模型（C-X4-C-X22-23-HXH）。推测部分Ia亚组WRKY基因是由IIc亚组WRKYs通过复制WRKY结构域进化而来，部分Ⅱc亚组的WRKY基通过Ⅰa亚组丢失N端WRKY结构域进化而来，支持Xu等^{［参考文献 50

百度学术}50］的“Ⅰa亚组直接从古老的IIc 亚组WRKY基因进化而来，大多数IIc WRKY基因从Ia WRKY基因进化而来”的假说。先前报道认为，Ⅲ组WRKYs从Ia和IId亚组进化而来^{［参考文献 51-52}51-52］。本研究发现疣粒野生稻中Ⅲ组WRKY蛋白在WRKY结构域树中与Ⅱc2和IId聚在一个分支，与Ia亚组关系较远，并且所有Ia亚组OgWRKYs成员所含锌指结构为C2H2类型，而所有III组成员所含锌指结构为C2HC类型。以及由于绿色鞭毛藻（ O.lucimarinus）仅含有两个分别属于IIc亚组和III组的WRKY基因^{［参考文献 53-54}53-54］，所以本研究认为Ⅲ组WRKYs从IId亚组进化而来的可能性不大，更倾向于支持Xu等^{［参考文献 50

百度学术}50］的“III组OgWRKYs基因从古老的IIc亚组进化而来” 的观点，这与Jiang等^{［参考文献 42

百度学术}42］药用野生稻的研究结果一致。

Villacastin^［

28］对稻属9个种的11个基因组研究发现，WRKY转录因子 Ib亚组基因仅特异存在于AA基因组中。本研究在GG基因组的疣粒野生稻中鉴定到1个Ib亚组基因OgWRKY61，表明Ib亚组基因并非AA基因组所特有。除保守的WRKYGQK基序外，在稻属不同种的WRKY转录因子家族中还报道了WRKYGEK、WRKYGKK、WKKYGQK、WRMCGQK、WSKYGQK和WVKYGQK变异基序 ^{［参考文献 28

百度学术}28］。在疣粒野生稻WRKY转录因子家族中，除WRKYGQK基序外，共鉴定到WRKYGHK、WRKYGKK、WRKYGEK、WRRYGQK、WRKYAKK和WRKYSQK变异基序，其中WRKYGHK、WRRYGQK、WRKYAKK和WRKYSQK是疣粒野生稻中鉴定的新的变异体。然而在稻属11个基因组中都鉴定到的WKKYGQK基序，普通野生稻、尼瓦拉野生稻、非洲栽培稻、日本晴、明恢63和R498鉴定到的WRMCGQK基序，明恢63、尼瓦拉野生稻和普通野生稻中鉴定到的WVKYGQK基序，日本晴、明恢63和R498鉴定到的WSKYGQK基序在疣粒野生稻中没有鉴定到。这些结果表明，稻属不同种中WRKYGQK基序的进化具有保守性和多样性。

本研究对94个OgWRKYs转录因子进行KEGG富集分析，对其中13个富集在植物-病原互作通路的OgWRKYs进一步结合基因启动子区域进行顺式作用元件分析，推测OgWRKY30b、OgWRKY53、OgWRKY88、OgWRKY 96和OgWRKY111在疣粒野生稻响应生物和非生物逆境中具有重要作用。在水稻植株中过表达OgWRKY30b同源基因OsWRKY30能显著提高水稻植株的耐旱性和白叶枯病抗性 ^［

13， 55］。过表达OgWRKY53的同源基因OsWRKY53的水稻植株叶夹角增加，株高和叶片中纤维素含量降低，白叶枯病抗性下降^{［参考文献 56

百度学术}56］，说明OsWRKY53负调控厚壁组织细胞壁发育和白叶枯病抗性。OgWRKY30b与水稻同源蛋白OsWRKY30的氨基酸序列一致性为56.2%，两个蛋白在N端WRKY结构域（285~343 aa）中有15个氨基酸的差异，在C端WRKY结构域（500~559 aa）内有2个氨基酸的差异，即532 aa的脯氨酸（P）替换为谷氨酰胺（Q）， 543 aa的丝氨酸（S）替换为丙氨酸（A）；OgWRKY53与水稻同源蛋白OsWRKY53的氨基酸序列一致性为85.4%，在N端WRKY结构域（202~261 aa）内有2个氨基酸的差异，而C端WRKY结构域（367~426 aa）内氨基酸序列完全一致（未发表资料）。OgWRKY30b和OgWRKY53与其水稻同源蛋白OsWRKY30和OsWRKY53的氨基酸序列差异是否会导致其功能的异同，还有待进一步研究。除OsWRKY 96/85 受茉莉酸诱导表达^{［参考文献 57

百度学术}57］，OgWRKY88、OgWRKY96和OgWRKY111水稻中同源基因的功能知之甚少。为了进一步验证这5个基因的功能，本研究检测了它们在白叶枯病菌胁迫下的表达水平，结果发现OgWRKY 30b、OgWRKY53、OgWRKY88和OgWRKY111基因的表达均受白叶枯病菌PXO99诱导，而OgWRKY96表达受白叶枯病菌侵染抑制，说明这5个WRKY基因可能参与调控疣粒野生稻对白叶枯病的抗性。疣粒野生稻这些基因的克隆和深入的功能研究将为全面解析WRKY转录因子家族生物学功能提供有价值的新信息。

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