番茄糖基转移酶基因<bold>SlUDP</bold>提高拟南芥镉胁迫耐性的作用研究

张美玉; 马玉芳; 罗宇芳; 耿鑫鑫; 郭静; 张欣欣; 陈超; 金晓霞; ZHANG Meiyu; MA Yufang; LUO Yufang; GENG Xinxin; GUO Jing; ZHANG Xinxin; CHEN Chao; JIN Xiaoxia

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哈尔滨师范大学生命科学与技术学院/黑龙江省道地野生药材种质资源研究中心，哈尔滨150025

最近更新：2024-08-09

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231023002

目录contents

摘要

镉（Cd）胁迫严重限制植物生长，因此鉴定与植物镉胁迫耐受性相关的基因尤为重要。课题组前期通过转录组数据筛选获得番茄UDP-糖基转移酶基因（SlUDP）响应植株镉胁迫反应。本研究克隆SlUDP基因编码区全长序列，该基因在叶片和果实中表达量较高，受镉胁迫诱导上调表达。酵母耐镉性分析表明，转入SlUDP基因提高了酵母镉胁迫的耐受性。进一步获得SlUDP过表达拟南芥株系，CdCl₂胁迫下（40、60、80 μmol/L），与野生型相比，过表达拟南芥株系的子叶失绿程度下降；发芽率、根长和种子存活率提高，而丙二醛含量下降，可溶性糖含量、超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性增加，且金属离子转运蛋白基因ZIP1、IRT1、CSD1和COPT2的表达水平显著高于野生型。结果表明，SlUDP过表达株系通过调节抗氧化酶系统，提高植株清除活性氧能力，降低膜脂过氧化程度，提高金属离子转运等方面提高植株耐镉性。本研究为糖基转移酶基因在植物耐受镉胁迫中的作用研究提供一定的理论依据，并为园艺植物抗性分子育种提供了候选基因。

关键词

番茄; 镉; 糖基转移酶基因; 抗氧化酶系统; 金属转运基因

重金属如镉（Cd）造成的土壤污染正在全球范围内受到广泛关注，因为重金属不能被降解并在土壤中持续存在^［

1］。此外，这些重金属易被植物吸收，并通过食物链进入人体，影响人体健康^{［参考文献 2-3}2-3］。目前，植物已经进化出多种途径来承受重金属胁迫，其中活性氧清除系统和金属离子转运途径在植物抵抗重金属引起的胁迫中起着重要作用^{［参考文献 4-7}4-7］。糖基转移酶广泛分布在植物中，在生物胁迫和非生物胁迫中起重要作用^{［参考文献 8

百度学术}8］。尿苷二磷酸（UDP，uridine diphosphate）-糖基转移酶（UGTs，glycosyltransferases）是植物中最大的GTs超家族之一。这些酶有助于植物适应非生物胁迫^{［参考文献 9

百度学术}9］。例如，新型糖基转移酶 UGT2在调节水稻耐盐性方面起着重要作用，在盐胁迫处理的水培条件下，过表达UGT2的幼苗比野生型生长更好，而突变株系则遭受更严重的生长抑制^{［参考文献 10

百度学术}10］。水稻基因GmUGT73F4能够与金属硫蛋白4（MT4，metallothionein 4）相互作用，响应盐、干旱、冷胁迫以及脱落酸诱导，这可能是通过上调胁迫相关基因和清除活性氧来实现的，同时，GmUGT73F4在增强植物种子活力和对非生物胁迫的耐受性方面发挥着重要作用^{［参考文献 11

百度学术}11］。牵牛基因PhUGT51可以被盐胁迫快速诱导，其过量表达导致耐盐性显著增加^{［参考文献 12

百度学术}12］。此前，从冬凌草中扩增出UDP-糖基转移酶基因IrUGT86A1，在氯化钠、茉莉酸甲酯和脱落酸作用下可以调节IrUGT86A1基因在冬凌草中的表达^{［参考文献 13

百度学术}13］。UDP-糖基转移酶在调节植物衰老和应对非生物胁迫方面发挥着关键作用^{［参考文献 14

百度学术}14］，例如，糖基转移酶基因UGT76B1可能在调节植物衰老中具有重要且特定的作用^{［参考文献 15

百度学术}15］。拟南芥AtUGT74E2基因的过表达可以促进拟南芥种子萌发^{［参考文献 16

百度学术}16］，拟南芥UGT76C2基因表达使植物能够应对缺水并参与干旱胁迫^{［参考文献 17

百度学术}17］。同样，茶树UDP-葡萄糖基转移酶基因UGT91Q2表达受到冷胁迫的强烈诱导，并且特异性催化橙花叔醇的糖基化，茶树吸收空气中的橙花叔醇并将其转化为葡萄糖苷，从而增强茶树的冷胁迫耐受^{［参考文献 18

百度学术}18］。在吲哚-3-丁酸的作用下拟南芥糖基转移酶基因UGT74E2被证明参与水分胁迫响应的调节^{［参考文献 19

百度学术}19］。

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界上最重要的园艺作物之一，其产量和需求量非常巨大，作为设施栽培的重要园艺蔬菜，其受到镉胁迫的污染影响也很严重^［

20］，因此研究番茄的镉（Cd）抗性机制非常重要。尽管已有一些对植物糖基转移酶的功能研究报道（如拟南芥、水稻、玉米和小麦），但研究糖基转移酶在番茄镉耐受性中作用的报告较少。本研究通过前期转录组数据筛选获得番茄糖基转移酶基因SlUDP，其响应番茄植株的镉胁迫应答。在克隆SlUDP基因CDS全长序列的基础之上，进一步分析该基因组织表达特征和镉胁迫诱导表达特性，利用酵母转化系统和拟南芥遗传转化系统，分析SlUDP基因在调控酵母和拟南芥植株镉胁迫抗性方面的作用，为糖基转移酶基因在植物抵抗镉胁迫中的作用研究提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究试验材料是本实验室保存的番茄商品种红罗成和哥伦比亚野生型拟南芥。将红罗成种子置于1∶1的泥炭土和蛭石混合物中，播种于营养钵（6.5 cm×6.5 cm）中，一钵一株，将营养钵置于温室，培养条件为温度22~26℃，光照16 h，避光8 h，且相对湿度保持在60%~70%。酿酒酵母感受态INVSC1菌株由上海唯地生物和中宜生物公司提供。根癌农杆菌GV3101和植物表达载体pGM-T质粒为本实验室保存。

1.2 SlUDP基因的克隆与生物信息学分析

采用4叶期番茄植株叶片进行基因克隆，利用PCR技术扩增基因CDS全长。半定量PCR反应体系12.5 μL：模板cDNA 1 μL，上下游引物各1 μL，Mix酶6.25 μL，ddH₂O 3.25 μL。半定量PCR反应条件：在95 ℃ 预变性2 min；96 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35次循环；72 ℃终延伸5 min。引物设计见表1。将番茄SlUDP基因CDS连接到克隆载体pGM-T中形成pGM-T-SlUDP重组质粒，测序后分析序列信息。使用NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih. gov/）进行序列比对，分别与马铃薯（Solanum tuberosum L.）、辣椒（Capsicum annuum L.）、烟草（Nicotiana benthamiana L.）、橄榄（Olea europaea var. sylvestris）、栀子花（Gardenia jasminoides J.Ellis）、咖啡（Coffea arabica L.）、柳树（Salix babylonica L.）、梨树（Pyrus spp）和越橘（Vaccinium darrowii）进行比较，并利用MEGA5.0软件构建系统发育进化树。

表1 引物序列汇总

Table 1 Summary of primer sequences

引物名称 Primer name	引物序列 Primer sequence	用途 Use
SlUDP-F	AATGGAGGGAGTGAC	过表达载体构建
SlUDP-R	AAAGTGTTTCCAGGTC
SlUDP-D-F	GGGGTACCAAGTTGCTGTGGTTATGGTG（Kpn I）
SlUDP-D-R	AACTGCAGAAAGGGGTGCCAGTAGG（Pst I）
SlUDP-MF	GGGGTACCATGGCATCAACAACAAACCATGTAAAT（Kpn I）	构建酵母重组质粒
SlUDP-MR	GCTCTAGACTATCTAGTGATGTGGGCAACAAAAGAT（Xba I）
SlActin11-qF	AAGATCCCATTCGTCCCCAT	内参引物
SlActin11-qR	CAAGAGCCTCAAGGAGAGTTGG
AtActin7-qF	TCGTTTCGCTTTCCTTAG
AtActin7-qR	CTTCACCATTCCAGTTCC
SlUDP -qF	GAGCAACAGTAATGGAGGGAGTGAC	实时定量PCR分析
SlUDP -qR	TTCTCCGTAAAGTGTTTCCAGGTC
ZIP1-qF	AGACACCATAAAGCCACTCA
ZIP1-qR	TTTCCTGTAGCCTAAACCAC
IRT1-qF	TGGGTCTTGGCGGTTGTATC
IRT1-qR	CCGAATGGTGTTGTTACCGC
COPT2-qF	CCTTTCGTATTTGGTGATGCT
COPT2-qR	AAACACCTGCGTTAAAGGAC
CSD1-qF	TCCATGCAGACCCTGATGAC
CSD1-qR	CCTGGAGACCAATGATGCC
GSH1-qF	TTTGAGCAGTATGTTGACTACGCAC
GSH1-qR	GCAGTTCACCAGGGAGACAGG

下划线表示限制性内切酶识别位点

The underlined line indicates the restriction enzyme recognition site

1.3 SlUDP基因的qRT-PCR表达特性分析

取4月龄番茄植株的主茎、侧茎、叶、根、花和果实，研究SlUDP在以上组织中的表达量；分别选用0、20、40、60、80和100 μmol/L浓度的CdCl₂胁迫番茄植株 12 h，取胁迫后番茄植株根和叶，研究不同浓度镉胁迫下SlUDP表达的变化；选用50 μmol/L镉胁迫番茄植株，分别取胁迫后0、1、2、3、4和5 d植株的根和叶，测定SlUDP基因表达量，研究镉胁迫下不同时间点SlUDP表达的变化。

1.4 RNA分离和实时荧光定量PCR

使用FOREGENE测定法^［

21］从番茄叶和根中分离总RNA，并使用ReverTra AceTM qPCR RT试剂盒合成cDNA。采用qRT-PCR方法研究基因表达量变化，反应体系为9.5 μL ddH₂O、1 μL SlUDP-qR （10 μmol/L）、1 μL SlUDP-qF （10 μmol/L）、12.5 μL 10×PCR Buffer Mix、1 μL cDNA，共25 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环，72 ℃ 5 min，以SlActin11为对照。引物序列如表1所示，委托上海生工工程有限公司合成。基因相对表达量采用2^-ΔΔCt法计算^{［参考文献 22

百度学术}22］，使用SPSS 20.0软件对数据进行统计学分析。

1.5 转SlUDP基因酵母的镉胁迫抗性分析

将番茄SlUDP基因CDS区克隆回收片段与pYES2质粒连接，构建重组质粒pYES2-SlUDP，并将重组质粒转化至酿酒酵母INVSC1菌株，方法见说明书。提取重组质粒INVSC1-pYES2-SlUDP，送往上海生工工程有限公司，测序筛选出阳性克隆。采用浓度为0、20、40、60、80和100 μmol/L的CdCl₂分别处理含重组质粒的酵母菌株INVSC1-pYES2-SlUDP（以下简称为pYES2-SlUDP）和含有空载体的对照菌株INVSC1-pYES2（以下简称为pYES2），振荡培养20~24 h，收集菌液，将菌液依次稀释10、100、1000、10000、100000倍，取2 μL稀释菌液接种于固体培养基，30 ℃倒置培养2~3 d，观察菌落生长情况。取10 μL菌液接种于10 mL液体选择培养基中，置于30 ℃下振荡培养36 h，测定菌液OD₆₀₀值。每个试验设置3次重复，所得数据用SPSS软件进行分析。

1.6 过表达SlUDP基因载体的构建和转基因拟南芥的鉴定

利用花序侵染法^［

23］，将含有pGM-SlUDP重组质粒的根癌农杆菌GV3101侵染野生型拟南芥而获得转基因拟南芥植株。在含有抗生素的（50 mg/L卡那&利福平）MS固体培养基上筛选阳性植株，并进行半定量PCR和qRT-PCR鉴定，获得两个转基因株系SlUDP-OE1和SlUDP-OE2。取拟南芥野生型（WT， wild type）和转基因株系SlUDP-OE1、SlUDP-OE2叶片各0.1 g，提取RNA，逆转录获得cDNA。PCR反应体系：9.5 μL ddH₂O、1 μL SlUDP-qR （10 μmol/L）、1 μL SlUDP-qF （10 μmol/L）、12.5 μL 10×PCR Buffer Mix、1 μL cDNA，共25 μL。PCR反应程序为94 ℃ 5 min；94 ℃ 10 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，35个循环；72 ℃ 5 min，以SlActin11为对照，对转基因型进行检测。将转基因拟南芥种子春化3 d，培养室培养4 d后，置于含有不同浓度CdCl₂（0、40、60和80 μmol/L）的MS培养基中竖直培养7 d，每隔24 h统计一次，共7次，随后统计转基因拟南芥植株发芽率、子叶失绿和根长。发芽率=发芽的种子数/种子总数×100%，子叶失绿=叶片变黄数量/叶片总数量×100%，根长使用游标卡尺进行测量。将转基因拟南芥植株和野生型移入草炭土中培育，室温24℃，光照16 h/8 h，培养15 d后对植株表型进行观察，查看存活植株个数。

1.7 转基因植株生理响应指标的测量

将1.6鉴定获得的拟南芥转SlUDP基因阳性材料和野生型同时种植生长至35 d，用60 μmol/L CdCl₂处理拟南芥，选取拟南芥叶片，测定其超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）活性^［

24］和过氧化物酶（POD，peroxidase）活性^{［参考文献 25

百度学术}25］，丙二醛（MDA，malondialdehyde）含量^{［参考文献 26

百度学术}26］和可溶性糖含量^{［参考文献 27

百度学术}27］等生理响应指标。

1.8 活性氧清除系统和金属转运相关基因的定量表达分析

取生长28 d的转基因拟南芥SlUDP-OE1、SlUDP-OE2两个阳性株系和野生型拟南芥用CdCl₂（60 μmol/L）处理，以双蒸水处理作为对照，在0 h、3 h和6 h时剪取叶片0.1 g（设置3次生物学重复），采用qRT-PCR方法，反应体系和程序如1.4，以AtActin7基因为内参，对重金属胁迫下转基因拟南芥的活性氧清除系统基因（CSD1、GSH1）和金属离子转运基因（ZIP1、IRT1、COPT2）进行定量表达分析，引物见表1。

2 结果与分析

2.1 番茄SlUDP基因的克隆和生物信息学分析

SlUDP基因序列长度为1486 bp（图1A），该基因编码的蛋白质序列与马铃薯蛋白质序列关系最密切，其次是烟草和辣椒（图1B）。此外，SlUDP蛋白序列与多种植物的序列相似，例如马铃薯，胡椒，烟草等，表明该蛋白序列具有高度保守性（图1C）。

图1 重组质粒的双酶切鉴定和SlUDP蛋白的生物信息学分析

Fig .1 Double digestion identification of recombinant plasmid and bioinformatics analysis of SlUDP protein

A：SlUDP基因克隆重组质粒鉴定；M1：2000 Marker；M2：15000 Marker；1：空白对照；2、3：SlUDP基因克隆重组质粒酶切条带；B：SlUDP进化树分析；红点代表本研究中克隆基因所编码的蛋白质；C：SlUDP蛋白的氨基酸序列比对结果

A： SlUDP gene cloning recombinant plasmid identification；1： Blank control；2，3： SlUDP gene cloning recombinant plasmid enzyme bands； B： SlUDP evolutionary tree analysis； The red dots represent the proteins encoded by the cloned genes in this study； C： Amino acid sequence alignment of SlUDP protein

2.2 镉胁迫下番茄SlUDP基因表达模式分析

SlUDP基因在番茄不同组织中的表达分析结果表明，50 μmol/L CdCl₂胁迫番茄植株12 h时，SlUDP基因在主茎、叶片、根部、侧茎、花和果实中均有表达，特别是在叶片和果实中的表达高于其他组织，SlUDP基因在叶片中的表达量是主茎的8.4倍； SlUDP基因在果实中的表达量是主茎的 5.8 倍； SlUDP基因在根和侧茎的表达量约是主茎的3倍（图2A）。此外，相同镉浓度不同处理时间基因的表达分析表明，在番茄植株的根系中，与对照0 d相比，镉胁迫4 d后SlUDP基因表达量增加，在镉胁迫5 d后是对照0 d的6.2倍（图2B）。镉胁迫2 d后，SlUDP基因在番茄叶片中的表达量比对照0 d高17.5倍（最大值为22.1倍）（图2C）。不同浓度镉胁迫处理试验表明，用不同浓度（20、40、60、80和100 μmol/L）的CdCl₂胁迫番茄植株12 h，60 μmol/L CdCl₂胁迫后，SlUDP基因在番茄根中的表达量比对照0 μmol/L高7倍（最大值为7.6）（图2D），40 μmol/L CdCl₂胁迫后，SlUDP基因在番茄叶片中的表达量比对照高11.2倍（最大值为11.2）（图2E）。这些结果表明，镉胁迫上调了SlUDP基因在叶片和根系中的表达。

图2 重金属镉胁迫下番茄幼苗SlUDP基因表达模式分析

Fig. 2 Analysis of SlUDP gene expression patterns in tomato seedlings under heavy metal Cd stress

A：SlUDP基因在番茄不同组织中的表达模式； B、C：不同时间镉处理下SlUDP基因在番茄根和叶片中的表达； D、E：不同镉浓度处理下SlUDP基因在番茄根和叶片中的表达；数值是具有标准误差线的3个重复的平均值，不同的字母在P<0.05时表示显著差异

A： Expression patterns of SlUDP gene in different tissues of tomato； B，C： SlUDP gene expression in tomato root and leaf under different time cadmium treatment； D，E： Expression of SlUDP gene in tomato roots and leaves under different cadmium concentrations； The value is the average of three replicates with a standard error line， with different letters indicating significant differences at P<0.05

2.3 镉胁迫下重组酵母菌株的耐镉性分析

20 µmol/L镉胁迫时pYES2和pYES2-SlUDP没有明显差别，100 µmol/L CdCl₂处理时含有pYES2-SlUDP质粒的酵母菌株比80 µmol/L CdCl₂处理时含有pYES2-SlUDP质粒的酵母菌株长势弱，100 µmol/L CdCl₂处理时对照在稀释1000倍下菌落未发现生长，而pYES2-SlUDP菌落仍可以生长（图3）。挑取pYES2-SlUDP和pYES2单菌落摇菌，进行OD₆₀₀值测定，对酵母在镉胁迫下进行定量分析。随着Cd胁迫浓度的增加，酵母OD₆₀₀的值不断降低，但pYES2-SlUDP一直高于pYES2，且高浓度时达到差异显著性（图4）。结果显示随着镉胁迫的处理浓度逐渐升高，SlUDP基因显著提高了酵母对镉胁迫的抗性。

图3 转SlUDP基因酵母在不同浓度镉胁迫处理后的表型分析

Fig.3 Phenotype analysis of yeast with SlUDP gene under different stress

图4 转SlUDP基因酵母在镉胁迫处理后的存活率分析

Fig. 4 Survival rate of SlUDP transgenic yeast under Cd stress

*表示处理组和对照组之间3次重复的平均值在P <0.05水平上差异显著；下同

* indicates that the mean of the three replicates between the treatment group and the control group was significantly different at the P <0.05 level；The same as below

2.4 过表达转基因拟南芥种子萌发耐镉性鉴定

荧光定量PCR分析表明， SlUDP基因在SlUDP-OE1和SlUDP-OE2中的表达水平分别是野生型植株的80倍和64倍（图5A）。在第3天时比较SlUDP过表达拟南芥株系与野生型拟南芥的发芽率，40 µmol/L CdCl₂处理条件下，SlUDP过表达拟南芥平均发芽率是野生型的1.2倍（图5C）；60 µmol/L CdCl₂胁迫下，过表达拟南芥植株平均发芽率是野生型的1.58倍（图5D）；而80 µmol/L CdCl₂胁迫下是野生型的1.9 倍（图5E）。这些结果表明，SlUDP基因可能减弱镉胁迫对种子发芽率的抑制作用。

图5 转基因拟南芥的鉴定及发芽率分析

Fig 5 Identification and germination rate analysis of transgenic Arabidopsis thaliana

A：qRT-PCR验证；B~E：不同浓度CdCl₂胁迫下（0，40，60，80 µmol/L）的发芽试验； WT：野生型拟南芥；下同

A：qRT-PCR validation test； B-E： Germination test under different concentrations of CdCl₂ stress （0，40，60，80 µmol/L），OE-1：SlUDP-OE1，OE-2：SlUDP-OE2，WT： Wild type；The same as below

2.5 SlUDP基因的过表达提高拟南芥植株对镉胁迫的耐受性

野生型种子（本实验室保存哥伦比亚野生型拟南芥种子）和SlUDP-OE拟南芥种子在不同浓度镉胁迫下生长7 d时，未进行胁迫处理的种子生长无显著差异（图6A）。然而，暴露于40 μmol/L CdCl₂时，与野生型植株相比，SlUDP过表达拟南芥植株失绿更缓慢。在60 μmol/L CdCl₂胁迫时，SlUDP过表达植株的平均失绿程度（87%）高于野生型拟南芥植株（58%）。在80 μmol/L CdCl₂胁迫时，SlUDP过表达植株的平均失绿程度（70%）高于野生型拟南芥植株（40%）（图6C）。SlUDP过表达拟南芥植株在60 μmol/L和80 μmol/L CdCl₂胁迫时的平均根长分别为7.2 cm和6.0 cm，野生型植株的根长分别为4.0 cm和2.0 cm，说明在高镉胁迫下，SlUDP过表达拟南芥植株对镉毒害的耐受性增强（图6B）。为了解野生型和SlUDP过表达拟南芥植株在镉胁迫下的存活情况，将这些植株在不同的镉浓度下生长15 d。野生型植株在80 μmol/L CdCl₂条件下的存活率低于10%，40 μmol/L和60 μmol/L CdCl₂的存活率低于50%。另一方面，SlUDP过表达拟南芥植株在80 μmol/L CdCl₂条件下存活率接近50%，40 μmol/L和60 μmol/L CdCl₂条件下的存活率高于50%，说明SlUDP过表达拟南芥植株受镉胁迫危害的影响较小（图6D）。以上结果表明，SlUDP基因的过表达提高了拟南芥植株对镉胁迫的耐受性。

图6 不同浓度Cdcl₂胁迫后拟南芥的子叶失绿、根长及表型分析

Fig. 6 Leaf greening， root length and phenotypic analysis of Arabidopsis mustard under different concentrations of CdCl₂ stress

A~C：不同浓度CdCl₂胁迫后拟南芥表型；A图上方为WT，左下侧为OE-1，右下侧为OE-2；D：不同浓度Cdcl₂胁迫后拟南芥的存活率、子叶失绿、根长的统计数据

A-C： Arabidopsis phenotype after CdCl₂ stress at different concentrations；The top of Figure A is WT， the left side is OE-1， and the right side is OE-2；D： Statistical data of survival rate， greenness of cotyledon， and root length of Arabidopsis after CdCl₂ stress at different concentrations

（图7）

图7 镉胁迫拟南芥丙二醛、可溶性糖、超氧化物歧化酶和过氧化物酶含量的测定

Fig.7 Determination of MDA， soluble sugar， SOD and POD contents in Arabidopsis thaliana under CdCl₂stress

MDA：Malondialdehyde； POD：Peroxidase；SOD：Superoxide dismutase

2.6 SlUDP过表达拟南芥植株生理指标的测定

在正常生长条件下，野生型和SlUDP过表达拟南芥植株的丙二醛和可溶性糖含量以及超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性无显著差异。然而，60 μmol/L CdCl₂胁迫处理时，与野生型植株相比，SlUDP过表达拟南芥植株的丙二醛含量降低而可溶性糖含量有所增加，丙二醛含量下降约1.4倍、可溶性糖含量增加至约1.8倍，超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性也显著增加，超氧化物歧化酶活性、过氧化物酶活性分别增加至约1.25倍、2倍（图7）。结果表明，SlUDP的过表达导致抗氧化酶系统的变化，提高植株清除活性氧的能力，降低膜质过氧化的程度，赋予植物更好的耐镉性。

2.7 转基因拟南芥金属离子转运蛋白基因表达分析

在镉胁迫下，SlUDP过表达拟南芥植株金属离子转运蛋白基因ZIP1、IRT1、CSD1和COPT2的表达水平显著高于野生型植株。在镉胁迫3 h时，这些基因的表达量显著升高，金属离子转运相关基因（ZIP1、IRT1、COPT2和CSD1）在过表达植株中的表达量分别约为野生型植株的3.1倍、1.5倍、1.6倍、2.1倍。结果表明，SlUDP过表达株系中ZIP1、IRT1、COPT2和CSD1基因在增强植物镉胁迫中起到一定作用，SlUDP基因可能通过调节金属离子的转运来缓解金属离子对植物造成的损伤。GSH1基因在SlUDP-OE1处理3 h和6 h时的表达量都低于野生型拟南芥，初步推测SlUDP基因提高镉胁迫的过程与谷胱甘肽途径相关性不大（图8）。

图8 镉胁迫处理下SlUDP-OE1、SlUDP-OE2中ZIP1、IRT1、COPT2、GSH1和CSD1基因的表达

Fig. 8 Expressions of ZIP1， IRT1， COPT2， GSH1 and CSD1 genes in SlUDP-OE1 and SlUDP-OE2 treated by CdCl₂

3 讨论

本研究对番茄糖基转移酶基因SlUDP进行克隆、生物信息学分析和基因表达特性分析，并且进行了酵母和拟南芥转基因功能验证，研究其调控植株镉胁迫的生物学功能。结果表明，番茄SlUDP基因序列与马铃薯序列同源，这与之前的研究结果一致^［

28］。此外，番茄SlUDP基因在茄子、水稻、辣椒等物种中具有同源物。植物中的糖基转移酶（GTs，Glycosyl Transferases）已被研究与多种非生物胁迫有关，例如高温，干旱和高盐等，干旱等胁迫通常与糖基转移酶对脱落酸稳态的调节有关^{［参考文献 29

百度学术}29］，UGT71B6可以应对干旱胁迫，然而，尚未报道SlUDP对植株镉胁迫耐性的相关作用^{［参考文献 30

百度学术}30］。研究表明，当植物暴露于镉胁迫时，SlUDP基因的表达会周期性地发生变化，表明SlUDP基因表达对植物的影响具有时间依赖性，但是原因尚不清楚。当植物受到生理和生化胁迫时，糖基转移酶作为渗透压调节剂，可以通过合成蛋白质来保护植物免受伤害^{［参考文献 31-32}31-32］。研究发现，控制离子转运蛋白的表达和活性直接影响植物的生长^{［参考文献 33-35}33-35］。 Liu等^{［参考文献 36

百度学术}36］发现UGT71C5的低表达导致种子萌发延迟，而UGT71C5的过表达加速种子萌发。此外，UGT71C5突变导致拟南芥脱落酸水平升高，而UGT71C5的过表达导致脱落酸水平降低，表明UGT71C5通过调节脱落酸水平影响种子萌发。此前，使用酵母系统证明ZmDHN15基因的过表达可以有效提高冷胁迫的耐受性^{［参考文献 37

百度学术}37］。同样，含有小麦TaNCL2-A基因的酵母生长速率更高，TaNCL2-A可以减轻酵母中镉毒性^{［参考文献 38

百度学术}38］。Ni等^{［参考文献 39

百度学术}39］也发现llCDT1赋予酵母和拟南芥对镉胁迫的耐受性。在40 μmol/L CdCl₂处理条件下，第3天SlUDP过表达拟南芥发芽率是野生型植株的1.2倍左右。在60 μmol/L Cdcl₂胁迫下，过表达拟南芥植株发芽率是野生型植株的1.58倍左右，而80 μmol/L Cdcl₂胁迫下发芽率比野生型植株高约1.9 倍。结果表明，SlUDP基因参与植物对镉胁迫的响应。与野生型相比，在镉胁迫下，SlUDP过表达拟南芥的生长没有显著抑制，表明这可能与缓解了种子发芽有关，需要进一步的研究来更详细地了解其机制。随着镉浓度的增加，种子的发芽率受到抑制，但SlUDP过表达拟南芥对镉的耐受性高于野生型植株。在80 μmol/L CdCl₂处理下，野生型植株大部分枯萎或死亡，成活率低于10%。然而，SlUDP过表达拟南芥的存活率接近50%。

丙二醛通常用于反映植物中膜脂过氧化的程度。在本项研究中，在高镉浓度下，发现SlUDP的过表达拟南芥植株丙二醛含量比野生型植株降低约1.4倍，说明在过表达株系中镉胁迫造成的氧化损伤显著低于野生型拟南芥。此外，过表达拟南芥植株可溶性糖含量和超氧化物歧化酶、过氧化物酶活性显著增加，再次表明这些植株对胁迫造成的氧化损伤耐受性增强。在60 μmol/L CdCl₂处理下，过表达SlUDP拟南芥植株的可溶性糖含量增加至约1.8倍。这些结果表明，SlUDP基因通过调控拟南芥可溶性糖含量来响应胁迫，提高植物对镉胁迫的耐受性。Chen等^［

40］表明CmWRKY15-1通过增加保护酶体系的活性，可提高菊花对白锈病的抗性。Sun等^{［参考文献 41

百度学术}41］表明耐旱基因ZmMYB48过表达可增强玉米光合性能，诱导抗氧化酶活性和脯氨酸含量增加，降低丙二醛含量。本研究表明在60 μmol/L CdCl₂处理下，SlUDP的过表达拟南芥植株的过氧化物酶和超氧化物歧化酶活性显著高于野生型植株，表明SlUDP基因可以提高抗氧化酶的活性，减轻镉的毒性作用。此前， Meng等^{［参考文献 42

百度学术}42］发现 ZIP 家族蛋白包括ZIP1和IRT1，ZIP1和 IRT1都可以转运镉，IRT1可以介导镉摄取效率低的过程。这些结果表明这些蛋白质对镉应激的作用。本研究ZIP1和IRT1基因在表达SlUDP的植株中的表达水平显著高于野生型植株，表明这些蛋白质对镉应激的作用与上述结果一致。

4 结论

本研究克隆了番茄的SlUDP基因，并研究了该基因在番茄植株不同组织中的表达。结果表明当番茄植株暴露于镉胁迫时，该基因在不同组织中的表达显著增加。利用酵母表达系统验证了SlUDP基因介导镉胁迫耐性的功能。此外，镉胁迫下在SlUDP过表达转基因拟南芥植株中，种子发芽率高于野生型植株。SlUDP过表达植株导致胁迫下丙二醛水平降低，可溶性糖水平升高，超氧化物歧化酶和过氧化物酶活性升高。结果表明，番茄SlUDP基因超量表达可以提高拟南芥植株的镉胁迫耐受性，抗氧化酶系统和金属离子转运蛋白可能参与其中。

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