摘要
以抗叶锈病小麦品系Hussar的衍生品系H103P为抗病亲本，郑州5389为感病亲本杂交得到的234个F4家系群体为材料，进行抗叶锈病基因定位分析。利用带有不同毒力的16个叶锈菌生理小种进行苗期抗叶锈性鉴定，结果表明周麦22及携带Lr13、Lr23和Lr16单基因的载体品种对16个叶锈菌生理小种均表现感病，H103P对除PHKT外的所有小种表现抗病，表明H103P抗叶锈性与携带Lr13、Lr23和Lr16单基因的载体品种不同。利用5种强毒力混合菌种（THTT、PHT
小麦叶锈病分布范围广泛，其病原菌为叶锈菌（Puccinia triticina
Hussar是来自英格兰的普通小麦品种，其亲本组合为Squadron/Rendezvou
小麦材料：抗病亲本H103P和感病亲本郑州5389以及二者杂交后所得的234个F4家系群体、周麦22（含抗性基因LrZH22）、携带Lr13、Lr16、Lr23单基因载体品种、慢锈对照品种SAAR。以上所有的小麦材料均由河北农业大学生防与分子植病实验室提供。
菌种材料：苗期鉴定所用的16种不同毒力的叶锈菌生理小种：FHJ
将H103P、郑州5389、周麦22、Lr13载体品种、Lr16载体品种、Lr23载体品种种于高度、直径均为9.5cm的花盆中，每盆每个品种15粒，每品种各种植16套置于河北农业大学温室内，待小麦材料长至一叶一心时，采用扫抹
2021年10月中旬将H103P和郑州5389以及二者杂交后所得的234个F4家系群体、慢锈对照品种SAAR、周麦22及Lr13载体品种种植于河北省保定市试验田，行距25 cm，行长75 cm，每个材料播种1行，每10行材料种植1行郑州5389便于鉴定，并将郑州5389垂直于播种行种植作为诱发行。保护行种植黑麦，可以有效的防止周围田地被传染，常规田间管理。
2022年4月中旬，小麦拔节期时将5种强毒力混合菌种孢子配置成0.05%浓度的孢子悬浮液，均匀喷洒至诱发行，常规田间管理。诱发行发病后会自然传染待测材料，待郑州5389严重度达到80%时进行第1次病害调查；之后每隔1周进行1次病害调查；直至郑州5389发病100%时进行最后1次调查。并以最后1次调查的严重度最高值作为成株期叶锈病最终严重度。参照Peterson
参考Sharp
LrZH22和Lr13是同一个基因，为检测H103P中含有的抗叶锈病基因与Lr13的关系，利用Lr13的特异性引物（上游引物：TGCACATGGATATG CGGAGA；下游引物：GCTTTGAGTTGCCCATGC TC）对H103P和郑州5389的扩增产物进行特异性酶切，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。SSR引物PCR反应总体系和反应程序同1.4。
SSR引物酶切反应体系：SSR引物PCR产物8 μL、Hind Ⅲ 酶0.5 μL（New England Biolabs（NEB）购买）、buffer 1 μL。SSR引物酶切反应：37 ℃ 90 min；10 ℃保存。
苗期接菌鉴定结果表明，郑州5389、周麦22以及Lr13、Lr16和Lr23载体品种对16个生理小种均感病，H103P对除PHKT以外的所有小种表现抗病。表明H103P的抗叶锈性比郑州5389、周麦22以及Lr13、Lr16和Lr23载体品种更好（
品种 Varieties | 基因 Gene | 叶锈菌侵染型 Leaf rust fungus infection type | |||||||||||||||
|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
FH J | FH T | FH K | PH T | FH JT | TH PS | TH DP | KG TT | FH K | TH TT | NH KP | PH KS | FH T | PH T | FH J | PH KT | ||
| H103P | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 2+ | 1 | 1 | 2 | 2+ | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 2 | 3 | |
|
郑州5389 Zhengzhou 5389 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | |
|
周麦22 Zhoumai 22 | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 | 3 | 4 | |
| 载体品种 Carrier variety | Lr13 | 4 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 3 | 4 | 4 | 4 | 3 | 4 | 4 | 4 | 3 | 3 |
| Lr16 | 4 | 3 | 4 | 3 | 3 | 4 | 3 | 4 | 4 | 3 | 4 | 4 | 3 | 4 | 4 | 3 | |
| Lr23 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 3 | 3 | 4 | 3 | 4 | 3 | 4 | 3 | 4 | 3 | |
+表示小麦材料侵染程度比该等级的正常水平高
+indicates that the degree of infection of wheat materials is higher than the normal level of this grade
图1 不同品种对叶锈菌生理小种THDP的侵染型
Fig.1 Infection type of different varieties on the physiological race THDP of leaf rust fungus
Hussar的衍生品系H103P、郑州5389、慢锈对照品种SAAR、周麦22以及Lr13载体品种田间鉴定结果表明， H103P、SAAR、周麦22以及Lr13载体品种田间表现型均为慢锈性（
品种 Varieties | 最终严重度（%） Final disease severity | 抗性 Resistance |
|---|---|---|
| H103P | 10 | 慢锈性 |
|
郑州5389 Zhengzhou 5389 | 100 | 高感 |
|
周麦22 Zhoumai 22 | 15 | 慢锈性 |
|
Lr13载体品种 Lr13 carrier variety | 18 | 慢锈性 |
| SAAR | 5 | 慢锈性 |
H103P和郑州5389以及二者杂交后所得的234个F4家系群体田间抗叶锈性鉴定结果表明，H103P严重度为10%，郑州5389严重度为100%， 234个F4家系群体最终严重度在5%~100%范围（
图2 F4家系群体田间严重度分布
Fig.2 Severity distribution of F4 family populations in the field
在亲本间筛选了小麦染色体上的481对SSR引物，其中在2B染色体上的引物多态性占比最大，为77%，因此使用2B染色体上的SSR引物，筛选在亲本间表现多态性的引物，再将这些引物在构建好的抗感池进行筛选，最终筛选到Xgwm148（F：GTGA GGCAGCAAGAGAGAAA；R：CAAAGCTTGACT CAGACCAAA）、Xgwm374（F：ATAGTGTGTTGC ATGCTGTGTG；R：TCTAATTAGCGTTGGCTGCC）及Xgwm474（F：ATGCTATTAAACTAGCATGTGTC G；R：AGTGGAAACATCATTCCTGGTA）共3个标记与Hussar衍生品系H103P中的抗叶锈病基因连锁。
通过Joinmap 4.0软件分析，发现1个位于2BS染色体上的小麦抗叶锈病基因，暂命名为LrHu。距离LrHu最近的标记为Xgwm148，LrHu在其一侧15.6 cM处（
图3 Xgwm148引物扩增F4家系PCR产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳部分结果
Fig. 3 Electrophoresis of PCR products amplified with SSR marker Xgwm148 on polyacrylamide gels
M：PBR322/Msp I Marker；P1：H103P；P2：郑州5389；Br：抗病池；Bs：感病池；R：抗病F4家系；S：感病F4家系
P1： H103P； P2： Zhengzhou5389； Br：Resistant bulk； Bs：Susceptible bulk； R：Resistant F4 pedigree； S：Susceptible F4 pedigree
图4 LrHu在2BS染色体上构建的遗传连锁图谱
Fig. 4 Genetic linkage mapping of LrHu constructed on chromosome 2BS
A：2B染色体缺失图谱，C为着丝点；B：与抗叶锈基因LrHu连锁的3个SSR标记在2BS上的遗传连锁图谱；2BS：小麦2B染色体短臂；2BL：小麦2B染色体长臂
A： 2B chromosome deletion map， C is mitotic site； B： Genetic linkage map of three SSR markers linked to the leaf rust resistance gene LrHu on 2BS； 2BS： Short arm of wheat chromosome 2B； 2BL： Long arm of wheat chromosome 2B
Lr13是1个具有温敏性的成株抗叶锈病基
图5 Lr13特异性引物扩增产物酶切电泳图
Fig.5 Enzyme digestion electrophoresis of Lr13 specific primer amplification products
M：PBR322/Msp I Marker；P1：H103P；P2：郑州5389；1：Lr13载体品种；2：周麦 22
P2： Zhengzhou5389； 1： Lr13 carrier variety； 2： Zhoumai 22
含有小麦抗叶锈病基因Lr13，但LrHu与Lr13之间的关系还需进一步研究。
本研究在苗期用毒力有差异的16个小种鉴定H103P、周麦22及携带Lr13、Lr23、Lr16的单基因载体品种的抗叶锈性，结果表明周麦22及Lr13、Lr16和Lr23载体品种对所有菌种均表现感病，但H103P对除PHKT之外的所有小种表现抗病，表明H103P比周麦22及Lr13、Lr16和Lr23的载体品种抗叶锈性好。本研究结合基因型数据和表型数据对Hussar的衍生品系H103P和郑州5389的234个F4家系群体进行抗叶锈病基因定位分析，在2BS染色体上定位到1个抗叶锈病基因，暂命名为LrHu。目前在2BS上定位到的抗病基因有Lr4
通过对比H103P与Lr13载体品种，H103P的侵染型要比Lr13载体品种低，表明H103P的抗叶锈性比Lr13载体品种好。分子标记检测得知H103P含有Lr13抗叶锈病基因，推测H103P除了含有抗病基因Lr13外可能还含有其他抗叶锈病基因。
距离LrHu最近的标记是的Xgwm148，遗传距离为15.6 cM，遗传距离较大。分析原因有二，其一是SSR分子标记密度不够大，导致标记与基因间的距离较大；其二是利用F4家系不如F2及F2：3结果精确，因为随机抽取尽可能多的家系单株虽在理论上可代表F2单株的基因组成，但也可能只选到了分离单株的同一性状的后代，导致重组率高，遗传距离大。
下一步将构建尽可能大的F2单株结合F2：3家系，精准鉴定表现型，利用其他标记如KASP标记，或利用SNP芯片获得多态性位点，结合已公开的基因组序列设计引物，来构建高密度遗传图谱，以缩短遗传距离，进行精细定位，为利用此基因达到基因聚合的目的奠定基础；并通过基因克隆等下一步实验正式命名LrHu。此外还将对该群体进行其他农艺性状鉴别，如对赤霉病、纹枯病、秆锈病等的抗性，来确定是否具有对多种病害的兼抗性。
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