低氮处理对玉米早期发育胚乳中氨基酸水平和转录组的影响

潘玉昕; 赵涵; 宁丽华; PAN Yuxin; ZHAO Han; NING Lihua

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低氮处理对玉米早期发育胚乳中氨基酸水平和转录组的影响 PDF

- ORCID：
潘玉昕 ^1,2
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赵涵 ¹
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宁丽华 ¹
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1. 江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业生物学重点实验室，南京 210014； 2. 南京农业大学农学院，南京 210014

最近更新：2024-08-09

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231101002

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摘要

氮素是影响玉米生长发育、产量和籽粒品质形成所必需的营养元素。为挖掘早期发育的玉米胚乳响应低氮胁迫的关键基因，揭示玉米胚乳抵御低氮胁迫的生理响应及分子机制，本研究在低氮和足氮处理下，对授粉后第6天的自交系B73玉米胚乳进行氨基酸含量、氨基酸衍生物含量分析和转录组测序。生理测定表明，低氮胁迫下，玉米胚乳中10种氨基酸或氨基酸衍生物含量升高，其中苏氨酸、β-氨基异丁酸、组氨酸、β-丙氨酸、赖氨酸含量升高程度最大，其升高范围介于71.1%~153.1%；而其余21种氨基酸或氨基酸衍生物含量降低，其中鸟氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸、α-氨基丁酸含量下降程度最大，其下降程度范围介于51.6%~65.8%。转录组测序结果表明，与足氮处理相比，低氮胁迫下玉米胚乳中鉴定到3185个显著上调和2612个显著下调的差异表达基因。进一步检测到参与氮代谢途径和氰基氨基酸代谢途径的差异表达基因分别为12和9个，AP2/ERF-ERF、bZIP、WRKY差异表达转录因子家族成员分别为20、10和21个。这些候选基因可能是玉米胚乳抵御低氮胁迫响应的重要基因资源，其为玉米胚乳应答低氮胁迫的分子机制及耐低氮玉米新品种培育奠定基础。

关键词

玉米; 低氮胁迫; 氨基酸及其氨基酸衍生物; 转录组测序; 氮代谢; 氰基氨基酸代谢; 转录因子

氮（N， nitrogen）是作物生长必不可少的大量元素之一^［

1-2］，其在调控作物正常生长发育、产量和品质中发挥着重要作用。作物对氮素的需求量大，而过量施用氮肥后通常会使氮肥损失高、利用率下降。据报道每年约有1.2×10⁸吨的氮肥用于全球粮食生产，而其中50%~70%的氮肥未被作物吸收利用^{［参考文献 3-4}3-4］，这导致土壤板结严重，生态环境恶化，不利于农业可持续发展^{［参考文献 5

百度学术}5］。因此，减少氮肥施用，提高作物对氮素高效利用，实现作物绿色生产越来越受到关注^{［参考文献 6

百度学术}6］。

玉米（Zea mays L.）是集粮食、饲料及工业原料为一体的多元作物，在保障国家粮食生产安全、促进畜牧业及工业发展中扮演着重要角色。据美国农业部统计，2019年全球玉米产量为1.09×10⁸吨^［

6］，氮肥施用对稳定玉米生产至关重要。前期研究表明，花期和灌浆期低氮胁迫会抑制玉米植株生长^{［参考文献 7

百度学术}7］，雌穗发育不良，穗重、穗粒数、籽粒重和产量均显著下降^{［参考文献 8-11}8-11］。此外，还有研究表明，氮供应水平会显著影响玉米籽粒的品质，低氮处理下玉米籽粒的蛋白质、可溶性糖、淀粉含量下降，支链淀粉与直链淀粉比值和粗脂肪含量升高；而随着施氮量增加，玉米籽粒蛋白质和赖氨酸含量升高，而淀粉含量降低^{［参考文献 12-13}12-13］。孟瑶等^{［参考文献 14

百度学术}14］研究还表明，随施氮量的增加玉米籽粒中调控淀粉合成的关键酶活性发生变化。由此可见，如何在低氮水平下维持玉米籽粒正常生长发育是我国农业绿色发展关键。

玉米籽粒由胚、胚乳和种皮组成。玉米胚乳在种子发育过程中持续存在^［

15］，是淀粉、氨基酸、蛋白质合成和储藏的主要场所。这些碳水化合物、氨基酸和蛋白质不仅在萌发过程中为玉米幼苗提供营养，调控玉米的生长发育和响应逆境胁迫等，同时还是人类重要的食物来源^{［参考文献 16

百度学术}16］。前人研究发现玉米胚乳发育是从玉米授粉后完成双受精便开始，授粉后第0~3天玉米胚乳进行有丝分裂并形成多个游离核，胚乳开始细胞化；授粉后第6天开始进入胚乳细胞分化增殖阶段，胚乳细胞将分化成4种类型：淀粉胚乳、糊粉层、基底传递层和胚周区^{［参考文献 17

百度学术}17］。授粉后第16天左右胚乳结构基本定型，即玉米在此阶段完成了生殖库的建立^{［参考文献 15-18}15-18］。有相关研究表明，玉米灌浆时总可溶性糖和氨基酸进入胚乳的运输速率呈线性关系^{［参考文献 19

百度学术}19］。因此，研究玉米胚乳发育的遗传调控机制对于提高玉米产量和品质具有重要意义。近年来转录组测序（RNA-Seq， RNA-sequencing ）技术的迅速发展，在转录层面上为解析玉米种子发育的遗传调控机制提供了技术支撑。Xin等^{［参考文献 20

百度学术}20］对Mo17与B73互交的籽粒（授粉后第0、3、5天）和胚乳（授粉后第7、10、15天）进行高通量转录组测序，共鉴定到290个印记基因在籽粒发育过程中发生显著变化。Li等^{［参考文献 21

百度学术}21］分别对授粉后第8、10、12天的胚乳进行转录组分析，发现许多基因表达的时空程序与玉米早期籽粒和胚乳发育过程中399个转录因子基因的表达相关；随后将耦合激光捕获显微解剖和转录组测序技术相结合，全面分析了授粉后第8天玉米胚乳的5种主要细胞类型，以及胚胎和母体组织的转录模式，发现了1个由MRP-1激活的调节模块^{［参考文献 22

百度学术}22］。赖锦盛团队对B73材料不同发育时期的胚、胚乳和籽粒进行取样，共计53份相关组织进行转录组测序分析，并建立了玉米种子发育的时空转录组图谱^{［参考文献 23

百度学术}23］；随后又对授粉后第6天的籽粒以4 h或6 h的间隔进行取样，共收集31个样本，并对其进行高时间分辨率的转录组分析^{［参考文献 24

百度学术}24］。上述研究为正常施氮环境下玉米胚乳发育的分子调控机制研究提供重要的信息。

然而，目前关于低氮水平下玉米胚乳发育遗传机制研究非常有限。由于授粉后第6天的玉米胚乳开始进入胚乳细胞分化增殖阶段，对籽粒建成发挥重要作用。因此，本研究以低氮和足氮处理下授粉后第6天的玉米自交系B73的胚乳为试验材料，测定玉米胚乳中氨基酸和氨基酸衍生物的积累变化，并利用转录组测序分析筛选和挖掘早期玉米胚乳发育中响应低氮胁迫的关键代谢通路和候选基因，从转录组水平揭示低氮胁迫对玉米胚乳基因表达的调控特征，为玉米低氮绿色生产提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究以玉米自交系B73为供试材料，来源于江苏省农业科学院玉米种质创新团队自交保存。

1.2 试验处理

田间种植试验于2022年4-8月在江苏省农业科学院六合实验基地（32°12'N， 118°37'E）氮池进行。氮池土壤为低氮土壤，土壤氮含量仅为0.76 g/kg，有效磷（P）为26.5 mg/kg，有效钾（K）为72.4 mg/kg，有机质为12.8 g/kg。根据前期研究^［

25］，在玉米整个生育期中，足氮处理（SN， sufficient nitrogen treatment）的小区（1.5 m×2.0 m）施加（NH₄）₂SO₄为240 kg/ha，氮肥施用分别在播前、8叶期和12叶期施用，施用量分别为70、100和70 kg/ha。低氮处理（DN， low nitrogen treatment）（1.5 m×2.0 m）小区施加（NH₄）₂SO₄为60 kg/ha，缺氮处理氮肥在播前施用。在两种氮肥水平处理小区中磷肥和钾肥的施用量相同，均为基肥，施用P₂O₅为80 kg/ha、K₂O为80 kg/ha，12叶期追施P₂O₅为55 kg/ha、K₂O为40 kg/ha。每种处理设置3个小区重复。待B73植株开花后，进行人工授粉，并记录授粉日期进行取样。

1.3 不同氮处理下玉米穗位叶、穗轴和胚乳部位氮积累量测定

在低氮和足氮处理下2个不同小区分别取长势一致的授粉第6天后的B73穗位叶、穗轴和胚乳，每个小区分别取3株各2 g等量混合成1个样品，每种氮处理取3次生物学重复。穗位叶、穗轴和胚乳样品105 ℃烘箱中杀青30 min，再75 ℃烘干至恒重，研磨成粉末，过60目细筛。称取50 mg样品，利用凯氏定氮法测定样品总氮含量^［

26］。

1.4 不同氮处理下玉米胚乳氨基酸及氨基酸衍生物含量测定

上述授粉后第6天玉米胚乳取样参考Chen等^［

23］的方法，将每穗中部5行籽粒用手术刀取下，然后沿籽粒中部将种皮划开，用镊子将幼嫩胚乳挑出放入液氮中收集，3个果穗幼嫩胚乳混合成1个样品，每种氮处理取3次生物学重复。每个样品取50 mg胚乳粉末，使用日本的全自动氨基酸分析仪L-8800（L-8800， Tokyo， Hitachi Instruments Engineering）测定玉米胚乳中各种氨基酸和氨基酸衍生物含量^{［参考文献 27

百度学术}27］。每种氨基酸和氨基酸衍生物的标准品由Sigma-Aldrich公司提供。对两种氮水平处理下玉米穗位叶、穗轴和胚乳中氮积累量、胚乳氨基酸和氨基酸衍生物含量数据进行整理，采用IBM SPSS 19.0软件进行单因素方差（ANOVA）分析。

1.5 Illumina转录组测序

分别对低氮和足氮水平处理下2个不同小区中长势一致授粉后第6天的B73果穗进行取样，每个小区取3穗。胚乳取样方法同1.4，共计6个样品。委托安诺优达基因科技（北京）有限公司，利用Illumina HiSeq 2000测序平台进行转录组高通量测序分析。测序原始数据进行数据过滤，去除接头序列及低质量Reads获得高质量的Clean reads。使用Cufflinks^［

28］方法，将每一样品Clean reads映射到参考玉米Zea_mays B73_V4基因组上 ^{［参考文献 29

百度学术}29］。使用DESeq计算转录本的基因表达水平FPKM（fragments per kilobase of exon model per million mapped fragments）值^{［参考文献 30

百度学术}30］。以log2∣FC∣>1及q-值<0.05为标准筛选比较组中的差异表达基因（DEGs， differentially expressed genes）。对得到的差异表达基因进行GO富集分析（http：//bioinfo.cau.edu.cn/agriGO/）和KEGG代谢通路分析。采用TBtools软件绘制关键KEGG通路中差异表达基因的FPKM热图^{［参考文献 31

百度学术}31］。

1.6 候选基因qRT-PCR分析

为验证转录组测序结果的可靠性，随机挑选参与氮代谢途径的3个差异表达基因、氰基氨基酸代谢途径的2个差异表达基因、淀粉和蔗糖代谢途径的1个差异表达基因及4个差异表达转录因子（1个AP2/ERF-ERF、1个bZIP、2个WRKY）进行qRT-PCR分析。首先用天根生化科技公司的植物总RNA提取试剂盒（DP452）提取低氮和足氮水平处理下2个不同小区中长势一致授粉后第6天的B73胚乳总RNA，再将总RNA采用cDNA第一链合成试剂盒（TaKaRa）逆转录为cDNA。采用Primer 3.0软件设计相应候选基因引物（表1）。采用SYBR qPCR Master Mix进行qRT-PCR分析。 qRT-PCR反应体系为：1.0 μL cDNA，10.0 μL 2×SYBR qPCR Master Mix，0.4 μL 引物，8.6 μL ddH₂O。qRT-PCR扩增程序为：95 ℃预变性30 s；95 ℃变性10 s，60 ℃ 退火30 s，35次循环。以玉米Zm00001d006438（ZmUPF1；正向引物序列为5'-CACCCGGTTGGCTATGCTGTAC-3'，反向引物序列为5'-TGTGCTCCACCAGAAGGC TGAC-3'）为内参基因，采用2^-△△Ct定量法^［

23］测定相应候选基因在两种氮水平处理下授粉后第6天的B73胚乳中的相对表达量，并对相应这些候选基因的转录组数据及qRT-PCR数据进行皮尔逊相关性分析。

表1 用于qRT-PCR分析的10个候选基因信息及其引物序列

Table 1 Primers sequencing used for qRT-PCR analysis of ten candidate genes

基因ID Gene ID	编码蛋白 Encoded protein	正向引物（5'- 3'） Forward primer （5'- 3'）	反向引物（5'- 3'） Reverse primer （5' - 3'）
Zm00001d002052	L-天冬酰胺酶/ β-天冬氨酸肽酶（ASRGL1）	GTGTCCGGCGTCTCCACCGTC	GATGAAGTAGCTGTTGTCCAC
Zm00001d046210	β-葡糖苷酶e （bglB）	CTGCTGTGGAAGCACGTCTC	TACTGGTCCGCAGCCACATC
Zm00001d033747	谷氨酰胺合成酶（glnA）	ATGGCTCTGCTCTCCGACCTC	GTTCCACTTCGGAAGCTTGCT
Zm00001d028260	谷氨酰胺合成酶（glnA）	ATGGCCAGCCTCACCGACCTC	GCTGGCTCGGGTCGGTGATG
Zm00001d011454	碳酸酐酶（cynT）	TCCAGCGTCGTCGGTAGCCT	TCATACACCTCGGTCTTGAAC
Zm00001d010482	葡萄糖-6-磷酸异构酶（PGI）	CACTGTCTTGCCCTCGACTC	CAAAGCAGACCCTCTGATTC
Zm00001d034457	bZIP转录因子	ATGCTCAAGCAGAAGCTGGAG	TTTGAACTAGACTTCCAGTA
Zm00001d023332	WRKY转录因子	ATGCTCAAGCAGAAGCTGGAG	CTGGGGTACATGGCACCTTC
Zm00001d041740	WRKY转录因子	TCCTCGTTCGCTGGCGCGTC	CCAGAGCCTGCTGGTGCGAC
Zm00001d020595	AP2/ERF-ERF转录因子	GAGGTTTGCCTTCGCCACCG	CTGATTCCCCTGTACTGGTTC

2 结果与分析

2.1 两种氮水平处理对玉米各组织氮积累量的影响

同一供氮处理下，玉米不同组织器官中氮积累量均表现为穗位叶>果穗>胚乳（图1）。说明玉米从土壤中吸收的氮素优先积累在穗位叶中，以维持叶片正常的生理功能。此外，与足氮处理相比，低氮处理下玉米穗位叶、果穗及胚乳中氮积累量均显著下降，其分别下降了23.6%、22.5%和32.4%。说明玉米叶片、果穗和胚乳均对低氮胁迫较为敏感，且胚乳中氮积累量下降程度最大，胚乳受低氮胁迫响应最为敏感。因此，研究低氮胁迫玉米早期胚乳的变化对玉米最终产量和品质形成具有重要意义。

图1 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米中各组织部位的氮积累量分析

Fig. 1 The nitrogen accumulation in various tissues of maize kernels at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

不同小写字母表示P < 0.05水平差异显著；下同

SN： Sufficient nitrogen treatment； DN： Low nitrogen treatment； Different lowercase letters indicated a significant difference （P< 0.05）；The same as below

2.2 两种氮水平处理对玉米胚乳氨基酸及氨基酸衍生物含量的影响

足氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳中31种氨基酸及氨基酸衍生物含量均不尽相同，其介于2（β-氨基异丁酸）~ 6055（谷氨酰胺）µg/g，均值为515 µg/g，变异系数为217.6%（图2）。类似的是，低氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳中这些氨基酸及氨基酸衍生物含量也不尽相同，其介于3（1-甲基-L-组氨酸）~3713（谷氨酰胺）µg/g，均值为367 µg/g，变异系数为194.0%（图2）。说明不同供氮处理对玉米胚乳中各种氨基酸及氨基酸衍生物含量的影

图2 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳中31种氨基酸和氨基酸衍生物含量分析

Fig. 2 The contents of 31 amino acids and amino acid derivatives in maize endosperm at 6 days after pollinationunder under two nitrogen treatments

响不同。进一步分析发现，低氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳中10种氨基酸和氨基酸衍生物含量呈上升趋势，占测试氨基酸和氨基酸衍生物种类的32.3%，例如苏氨酸、β-氨基异丁酸、组氨酸和β-丙氨酸，其分别升高了153.1%、132.8%、113.4%、83.9%（图2）；而授粉后第6天的B73胚乳中其余21种氨基酸和氨基酸衍生物含量在低氮处理下呈下降趋势，占测试氨基酸和氨基酸衍生物种类的67.7%，例如鸟氨酸、胱氨酸、天冬酰胺、苯丙氨酸和α-氨基丁酸，其分别降低了65.8%、59.7%、58.3%、55.1%和51.6% （图2）。说明低氮胁迫会抑制玉米胚乳中绝大多数种类氨基酸和氨基酸衍生物的积累，低氮胁迫会促进少数种类氨基酸和氨基酸衍生物的积累。

2.3 两种氮水平处理下玉米胚乳转录组测序分析及差异表达基因鉴定

对低氮和足氮处理下授粉后第6天的 B73玉米胚乳进行Illumina HiSeq 2000转录组测序。结果可知，低氮和足氮处理组过滤掉原始测序数据得到的平均Clean reads数分别为6663943800和6446564300，GC碱基百分比均在52%以上，Q20碱基百分比均在95%以上，Q30碱基百分比均在88%以上。说明转录组测序结果质量可靠。将Clean reads比对到玉米Zea_mays B73_V4参考基因组，其比对率介于88.29%~96.40%。

进一步对转录本进行主成分分析，结果表明授粉后第6天的B73胚乳转录本可根据不同供氮处理明显分成2组（图3A），说明不同供氮处理下玉米胚乳中相应基因差异表达，进而调控了不同供氮水平下玉米胚乳表型及营养品质的积累。利用皮尔逊相关系数评估样品各个重复间的相关系数均高于0.8（图3B），说明测序数据的重复性较好，可用于后续生物信息学分析。根据每种氮处理下授粉后第6天的B73胚乳中基因的FPKM表达量水平（图3C），并以转录本中基因FPKM表达量大于0.01为标准，检测到共有25011个基因表达（图3D）。进一步以log2∣FC∣>1及q值 <0.05为差异表达基因的阈值，与足氮处理相比，低氮处理下授粉后第6天的B73胚乳中共识别到5797个差异表达基因，其中3185个基因显著上调表达，2612个基因显著下调表达，上调基因数量明显多于下调基因数量（图3D），说明低氮胁迫会诱导多数基因显著上调表达。

图3 两种氮水平处理下授粉后第6 天玉米胚乳转录组数据分析

Fig. 3 RNA-Seq data analysis in maize endosperm at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

A：转录组数据的主成分分析；B：样品基因表达量Pearson相关性分析；C：样品基因表达FPKM分布；D：样品差异表达基因火山图；-1、-2、-3是3个不同重复；FDR：错误发现率；FC：差异倍数

A： Principal component analysis （PCA） of RNA-Sequencing data； B： Pearson correlation analysis of gene expression for all samples； C： FPKM distribution of gene expressions for all samples； D： Volcano plot of DEGs for all samples； -1， -2， and -3 are three different repetitions； FDR： False discovery rate； FC： Fold change

2.4 低氮处理下玉米胚乳差异表达基因的GO和KEGG分析

为探究玉米胚乳低氮胁迫响应基因的功能，基于注释基因库对低氮处理下鉴定到的差异表达基因进行了GO和KEGG分析。结果表明，GO富集到细胞组分、分子功能和生物进程3大类49个分支中（图4A）；其中富集到生物进程的差异表达基因有2626个参与细胞过程（Cellular process）、2429个参与代谢过程（Metabolic process）、1116个参与生物调节（Biological regulation）和1111个参与刺激反应（Response to stimulus）。将差异表达基因进行KEGG富集分析表明，排名前20 的通路可分为3类，第1类代表细胞信号通路，包括30个差异表达基因参与的同源重组（Homologus recombination）和29个差异表达基因参与的错配修复（Mismatch repair）；第2类主要涉及17个差异表达基因参与的昼夜节律（Circadian rhythm-plant）的生物周期节律调控；第3类代表生物合成与代谢途径，如12个差异表达基因参与的氮代谢过程（Nitrogen metabolism）、9个差异表达基因参与的氰基氨基酸代谢过程（Cyanoamine acid metabolism）、8个差异表达基因参与的组氨酸代谢（Histidine metabolism）过程、55个差异表达基因参与的苯丙氨酸生物合成（Phenylpropanoid biosynthesis）过程（图4B）。

图4 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳差异表达基因的GO富集和KEGG通路分析

Fig. 4 GO term enrichment and KEGG pathway analyses of DEGs in maize endosperm at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

A：差异表达基因的GO富集分析；B：差异表达基因的 KEGG通路分析

A： GO term enrichment analysis of differentially expressed genes； B： KEGG pathway analysis of differentially expressed genes

2.5 低氮处理下玉米胚乳氮代谢通路差异表达基因分析

氮代谢是植物体内最基础的代谢过程之一，主要参与氮素及氮素化合物的同化、转运和排出，对植物生长发育具有重要影响。与足氮处理相比，低氮处理下授粉后第6 天的B73胚乳中鉴定到12个差异表达基因参与氮代谢途径，其中1个甲酰胺酶编码基因（Formamidase），即Zm00001d012706下降9.93倍； 2个亚硝酸盐铁氧化还原酶编码基因（nirA），即Zm00001d018161、Zm00001d052164分别下调2.89和2.63倍；检测到4个碳酸酐酶编码基因（cynT），其中Zm00001d011454、Zm00001d044099、Zm00001d031778分别提高2.14、3.50、2.10倍，Zm00001d003781下调2.75倍，其编码蛋白具有碳酸盐脱水酶活性（GO：0004089）；1个NADP+谷氨酸脱氢酶编码基因（gdhA），即YM_newGene_8253上调9.62倍，2个谷氨酸合成酶编码基因（GLT1），即Zm00001d037175和Zm00001d038948分别下调6.95和1.26倍，2个谷氨酰胺合成酶编码基因（glnA），即Zm00001d033747上调1.55倍，而和Zm00001d028260下调3.20倍（图5）。

图5 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳氮代谢通路中差异表达基因挖掘

Fig. 5 Identification of DEGs for nitrogen metabolism pathway in maize endosperm at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

A：氮代谢通路（map00910）；圆圈表示其他分子化合物；红色方框表示相应基因上调表达；绿色方框表示相应基因下调表达；蓝色方框表示相应基因上调或下调表达；实心箭头表示化学反应；虚线箭头表示简介反应；下同；B：氮代谢通路上相关差异表达基因的表达量

A： Nitrogen metabolism pathway （map00910）； Circle indicated molecule； Red box indicated up-regulated genes； Green box indicated down-regulated genes； Blue box indicated up-regulated and down-regulated genes； Solid arrow indicated chemical reaction； Dotted arrow indicated indirect reaction；The same as below； B： Gene expression of DEGs involved in nitrogen metabolism pathway

2.6 低氮处理下玉米胚乳氰基氨基酸代谢通路差异表达基因分析

氨基酸是植物体内必需的生物活性分子，植物体内氨基酸会调控植物生长发育及抗逆响应等诸多方面。与足氮处理相比，低氮处理下授粉后第6天的B73胚乳中鉴定到9个差异表达基因参与氰基氨基酸代谢途径，包括5个β-葡糖苷酶编码基因（bglB），其中Zm00001d021119、Zm00001d024037、Zm00001d041776、Zm00001d041777分别上调1.44、1.36、3.46、4.23倍，Zm00001d046210下调3.14倍；1个甲酰胺酶编码基因，即Zm00001d012706下调9.93倍；1个甘氨酸羟甲基转移酶编码基因（glyA），即YM_newGene_7173下调8.41倍；1个L-3-氰丙氨酸合成酶/半胱氨酸合成酶编码基因（ATCYSC1），即Zm00001d004413上调1.32倍；1个L-天冬酰胺酶/β-天冬氨酸肽酶编码基因（ASRGL1），即Zm00001d002052下调2.14倍（图6）。

图6 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳氰基氨基酸代谢通路中差异表达基因挖掘

Fig. 6 Identification of DEGs for cyanoamino acid metabolism pathway in maize endosperm at 6 days after pollination under different nitrogen treatments

A：氰基氨基酸代谢通路（map00460）；B：氰基氨基酸代谢通路上相关差异表达基因的基因表达量

A： Cyanoamino acid metabolism pathway （map00460）； B： Gene expression of DEGs involved in cyanoamino acid metabolism pathway

2.7 低氮处理下玉米胚乳差异表达转录因子分析

植物体内丰富的转录因子可通过激活或抑制目的基因表达，在植物调控生长发育及响应逆境胁迫反应中扮演着重要作用。与足氮处理相比，低氮处理下B73胚乳中共检测到20个AP2/ERF差异表达转录因子，其中10个显著上调表达，上调1.08~7.83倍，10个显著下调表达，下调1.44~4.97倍；10个bZIP差异表达转录因子，其中3个显著上调表达，上调1.27~8.82倍；7个显著下调表达，下调1.11~3.47倍；21个WRKY差异表达转录因子，其中15个显著上调表达，上调1.04~7.80倍；6个显著下调表达，下调1.30~4.02倍，这些转录因子差异表达可能与玉米胚乳响应氮水平有关（图7）。

图7 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳中3类差异表达转录因子家族基因挖掘

Fig. 7 Identification of differentially expressed three transcription factors in maize endosperm at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

A：3类转录因子家族基因统计；B：差异表达bZIP转录因子基因的表达量；C：差异表达AP2/ERF-ERF转录因子基因的表达量； D：差异表达WRKY转录因子基因的表达量

A： Statistics of three transcription factors （TFs） families； B： Expression levels of differentially expressed bZIP TF genes； C： Expression levels of differentially expressed AP2/ERF TF genes； D： Expression levels of differentially expressed WRKY TF genes

2.8 候选基因qRT-PCR分析

为验证本研究转录组测序数据的可靠性，随机挑选了4个差异表达转录因子，包括Zm00001d020595（AP2/ERF-ERF）、Zm00001d034457（bZIP）、Zm00001d023332（WRKY）和Zm00001d041740（WRKY）；2个氰基氨基酸代谢途径差异表达基因，分别为Zm00001d002052（ASRGL1）和Zm00001d046210（bglB）；3个氮代谢途径差异表达基因，分别为Zm00001d033747（glnA）、Zm00001d028260（glnA）和Zm00001d011454（cynT）；1个淀粉和蔗糖代谢途径差异表达基因，为Zm00001d010482（PGI），对两种氮处理下授粉后第6天的B73胚乳进行qRT-PCR分析。结果表明，这些差异表达基因和差异表达转录因子的qRT-PCR相对表达量与其转录组分析的FPKM表达量结果高度一致（图8），说明本研究转录组测序结果可靠。

图8 两种氮水平处理下授粉后第6天玉米胚乳差异表达基因的qRT-PCR与转录组分析比对

Fig. 8 qRT-PCR and transcriiptnme analysis of DEGs and in maize endosperm at 6 days after pollination under two nitrogen treatments

实线：FPKM；虚线：qPR-PCR；G1：Zm00001d020595；G2：Zm00001d034457；G3：Zm00001d023332；G4：Zm00001d041740；G5：Zm00001d002052；G6：Zm00001d033747；G7：Zm00001d028260；G8：Zm00001d011454；G9：Zm00001d046210；G10：Zm00001d010482

Solid line：FPKM；Dotted line：qPR-PCR

3 讨论

籽粒早期发育情况直接决定了玉米产量和品质形成，而氮素又是影响玉米籽粒发育的重要元素之一。挖掘早期发育的玉米胚乳响应低氮胁迫的关键基因，揭示玉米胚乳抵御低氮胁迫的生理响应及分子机制，并培育耐低氮能力的玉米新品种对于减少氮肥施用量、提高玉米产量和品质，最终对实现我国农业绿色生产具有重要意义。低氮胁迫时玉米形成了复杂的基因表达调控网络以抵御环境压力带来的不利影响^［

32］。本研究对低氮和足氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳进行了转录组分析。与足氮处理相比，低氮处理下共鉴定到3185个显著上调差异表达基因，2612个显著下调差异表达基因。暗示这些差异表达基因在玉米胚乳响应低氮胁迫中起积极作用。进一步对这些差异表达基因的生物进程GO富集分析表明，细胞过程、代谢过程、生物调节和刺激反应起主要作用，其与这些差异表达基因的KEGG代谢通路分析结果相一致，即低氮处理下玉米胚乳中的差异表达基因显著富集于基因的细胞信号、生物周期节律调控、生物合成与代谢等途径中，这为进一步挖掘玉米响应低氮胁迫的关键调控基因奠定了基础。

氮代谢能力是判断植物氨基酸与蛋白质合成、产量与品质形成的重要因素^［

33］。植物氮代谢通路中，甲酰胺酶能催化甲酰胺转化为甲酸酯和氨，为植物提供氮源。缺磷处理下白羽扇豆（Lupinus albus L.）根中甲酰胺酶基因上调表达用于降解甲酰胺^{［参考文献 34

百度学术}34］，微生物中甲酰胺是组氨酸和氰化物的降解产物^{［参考文献 35

百度学术}35］。本研究低氮处理下，授粉后第6天的B73玉米胚乳中1个甲酰胺酶基因Zm00001d012706显著下调表达；且生理分析还发现，低氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳中组氨酸含量则升高了113.4%。推测甲酰胺酶在植物中不仅具有氰化物解毒作用^{［参考文献 36

百度学术}36］，还与组氨酸积累有关。亚硝酸盐铁氧化还原酶是植物氮代谢通路中的关键酶之一，其在光照、温度、氮水平刺激下可将亚硝酸盐催化还原为氨，产生的氨可直接利用并合成氨基酸^{［参考文献 33

百度学术}33］。本研究发现，低氮处理显著抑制了B73玉米胚乳中Zm00001d018161和Zm00001d052164亚硝酸盐铁氧化还原酶基因表达，并通过一系列级联反应诱导玉米胚乳中精氨酸含量升高了42.7%。植物中存在大量的碳酸酐酶，其催化CO₂和HCO₃^-的相互转化^{［参考文献 37

百度学术}37］。之前相关研究已证实植物中的碳酸酐酶在干旱、高盐、高温、强光下普遍上调表达^{［参考文献 37

百度学术}37］，这与本研究结果相一致，结果显示检测到的3个和1个碳酸酐酶基因，其在低氮水平下的玉米胚乳中分别显著上调和下调表达。表明植物中碳酸酐酶是一种应激反应酶，其可能参与植物对各种逆境的响应。NADP+谷氨酸脱氢酶是氮代谢的中心酶，其能将氨转化为谷氨酰胺或将谷氨酸脱胺转化为α-氧葡萄糖酸酯^{［参考文献 38

百度学术}38］。Du等^{［参考文献 39

百度学术}39］发现，低氮条件下，NADP+谷氨酸脱氢酶（TrGDH）转基因水稻（Oryza sativa L.）可通过促进氮同化来显著增大水稻的有效穗数、干重和单株粒重。本研究在低氮处理下检测到1个NADP+谷氨酸脱氢酶基因YM_newGene_8253在玉米胚乳中显著上调表达。谷氨酰胺合成酶是植物氮代谢通路中的另一关键酶，其关联氮素同化代谢与无机代谢，该酶活性强弱直接影响植物对氮的同化与循环^{［参考文献 33

百度学术}33］。小麦中铵态氮通过谷氨酰胺合成酶-谷氨酸合成酶途径被同化^{［参考文献 40

百度学术}40］，并转化成谷氨酰胺和谷氨酸，为植株有机氮化合物合成提供物质基础^{［参考文献 41

百度学术}41］。植物中谷氨酸合成酶随供氮水平增加而升高^{［参考文献 42

百度学术}42］。本研究低氮水平下玉米胚乳中2个谷氨酸合成酶基因均显著下调表达，而2个谷氨酰胺合成酶基因，1个上调表达，另1个下调表达，且低氮胁迫下玉米胚乳中谷氨酸含量降低了20.7%。

授粉后第6天的玉米籽粒处于胚乳细胞分化增殖阶段，此阶段大量氨基酸不仅被用来合成籽粒建成相关酶，同时也是一些籽粒中重要碳氮化合物积累调控因子重要合成原料^［

27］。因此，在低氮环境下胚乳中氨基酸含量发生显著变化不仅影响玉米籽粒早期正常发育，同时影响接下来的籽粒灌浆等过程。此外，氨基酸作为植物体内重要的生理活性物质，可通过改变其吸收、合成及降解代谢来减少植物受到的逆境胁迫的危害^{［参考文献 43

百度学术}43］。前人采用蛋白组学测序揭示，玉米的抗旱性主要取决于淀粉和蔗糖代谢、萜类物质生物合成、氰基氨基酸代谢途径中的一些关键蛋白的差异积累^{［参考文献 44

百度学术}44］。采用非靶向LC-MS代谢组学技术，重金属镉胁迫时芥菜（Brassica juncea （L.） Czern.）木质部汁液代谢谱分析表明，氨基酸生物合成和氰基氨基酸代谢中大部分差异代谢物均下调表达^{［参考文献 45

百度学术}45］。采用RNA-Seq测序表明，野生大豆（Glycine soja Siebold & Zucc.）抵御低氮胁迫的关键代谢途径是增强根系中的氰基氨基酸、蛋氨酸和半胱氨酸代谢，其变化增强了叶片中的蛋氨酸、半胱氨酸和谷胱甘肽代谢^{［参考文献 46

百度学术}46］。增氮处理下玉米籽粒中的各种氨基酸含量均有所升高，但不同类型玉米品种籽粒中各组分氨基酸变化不同，例如高油15主要通过亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸含量的提高来增加氨基酸的水平，而掖单22依靠蛋氨酸、异亮氨酸、亮氨酸含量来增强氨基酸积累^{［参考文献 47

百度学术}47］。本研究低氮处理下，授粉后第6天的B73玉米胚乳中检测到9个差异表达基因参与氰基氨基酸代谢途径，即5个β-葡糖苷酶差异表达基因、 1个甲酰胺酶差异表达基因、1个甘氨酸羟甲基转移酶差异表达基因、1个L-3-氰丙氨酸合成酶/半胱氨酸合成酶差异表达基因和1个L-天冬酰胺酶/β-天冬氨酸肽酶差异表达基因，这些基因差异表达使低氮处理下玉米胚乳中甘氨酸含量升高了42.7%，磷酸丝氨酸含量升高了11.5%，苏氨酸含量升高了153.1%，天冬酰胺含量下调了58.3%，天冬氨酸含量下调了27.2%。说明氰基氨基酸代谢途径是不同植物抵御各种逆境胁迫，特别是低氮胁迫的关键代谢通路。前人研究发现，γ-氨基丁酸能提高甜瓜（Cucumis melo L. ）根系中硝酸还原酶活性，促进硝酸盐、Ca²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、K⁺的吸收，抑制Mn²⁺、Cu²⁺、Fe³⁺的吸收^{［参考文献 48

百度学术}48］。本研究低氮胁迫下玉米胚乳中γ-氨基丁酸含量下降了24.6%。推测玉米胚乳中γ-氨基丁酸含量与胚乳中氮积累正相关。低氮胁迫下玉米幼苗的氮积累量显著下降，而其根系氮分配比例、氮素生理效率及脯氨酸含量显著升高^{［参考文献 49

百度学术}49］。不同的是，本研究表明，低氮处理下玉米胚乳中脯氨酸含量下降了39.5%。这可能与低氮水平或玉米组织特异性有关。此外，低氮胁迫下玉米胚乳中其他种类氨基酸含量也会发生不同程度的变化，其可能也在玉米防御低氮胁迫应答中发挥重要功能，今后的研究中应深入探索这些氨基酸的作用机制。

以往研究已表明，不同类型的转录因子家族在植物响应低氮胁迫中发挥着重要作用^［

46，50-53］。采用转录组测序表明，低氮水平下野生大豆叶片中AP2/ERF-ERF和WRKY转录因子均显著上调表达，其在野大豆抵御低氮胁迫过程中起调控作用^{［参考文献 46

百度学术}46］；小麦（Triticum aestivum L.）幼苗TabZIP21在缼氮胁迫时上调表达，推测其在小麦缼氮胁迫下被诱导表达，酵母单杂交点对点试验还筛选出该基因下游靶基因为TaCLC-a-6AS-1^{［参考文献 51

百度学术}51］；AP2-EREBP转录因子在玉米突变体和野生型材料根系抵御低氮胁迫中发挥重要作用^{［参考文献 52

百度学术}52］。4个烟草（Nicotiana tabacum L.）NtWRKY65转基因株系幼苗在低氮处理下，其干物质含量、根长、侧根数和总氮量均显著高于野生型材料，表现出明显的耐低氮能力^{［参考文献 53

百度学术}53］。类似的是，本研究低氮处理下，授粉后第6天的B73玉米胚乳中检测到20个AP2/ERF-ERF、10个bZIP和21个WRKY差异表达转录因子，这些家族转录因子既有上调表达，也有下调表达，且这与前人的研究结果高度一致^{［参考文献 21-22}21-22］。表明这些转录因子在玉米响应低氮胁迫中其调控方式存在多样性。

总之，本研究对低氮处理下授粉后第6天的B73玉米胚乳进行了高通量转录组测序、31种氨基酸和氨基酸衍生物含量变化分析。低氮胁迫下玉米胚乳中10种氨基酸和氨基酸衍生物呈上升趋势，其余21种氨基酸和氨基酸衍生物呈下降趋势；初步揭示了响应低氮胁迫的基因调控特征，筛选得到其中差异表达的AP2/ERF-ERF、bZIP和WRKY转录因子及氮代谢、氰基氨基酸代谢通路中的差异表达基因。这些研究结果为玉米响应低氮胁迫的氨基酸生理功能奠定了基础，增加了对玉米胚乳早期发育响应低氮胁迫的认识。

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