摘要
萜烯合成酶（TPS，terpene synthase）基因是萜类化合物生物合成途径中的关键基因，其在植物萜烯代谢中起到重要的作用。本研究以紫丁香（Syringa oblata Lindl. ex Carr.）花瓣为材料，在优化固相微萃取花香化合物条件的基础上，对4个不同花发育时期（花蕾期、初开期、盛开期和衰败期）的花香化合物进行鉴定分析；结合基因组和转录组数据筛选到了SoTPS2和SoTPS3关键候选基因，并对其进行克隆和功能研究。结果表明：（1）最适的萃取条件为30 ℃萃取40 min；4个花发育时期的花香总释放量呈先升高后下降的趋势，盛花期达到最高；4个时期中萜烯类化合物的释放量占花香总释放量的比例均最高，其中以单萜罗勒烯的释放量最高。（2）SoTPS2和SoTPS3基因编码区长度分别为1731 bp和1779 bp，编码氨基酸分别为576个和592个，编码的蛋白具有Terpene_cyclase_plant_C1保守结构域，属于Isoprenoid_Biosyn_C1超家族；实时荧光定量表明2个基因均在花瓣中表达量最高，在不同花发育时期表达量均呈先升高后下降趋势，在盛开期表达量最高，与单萜罗勒烯的释放量呈正相关。（3）在金鱼草（Antirrhinum majus L.）花瓣中异源瞬时过表达SoTPS2和SoTPS3基因，发现罗勒烯释放量与对照组相比分别显著增加10.91倍和23.67倍。综上表明，紫丁香花香主要成分为单萜类化合物，SoTPS2和SoTPS3可以影响紫丁香单萜化合物，尤其是罗勒烯的合成。
释放花香是开花植物的一个重要特征，在植物繁衍、防御以及植物间的相互作用等方面具有重要的生物学意义。此外，花香作为衡量花卉品质的重要指标，对提升花卉的观赏价值和经济价值具有重要意义。近年来，从花香植物中提取精油、香料作为香水和化妆品的原料也成为发展趋势。植物花香化合物主要分为萜烯类化合物、苯丙酸类/苯环型化合物和脂肪酸衍生物3大
萜烯合成酶（TPS， terpene synthase）位于萜烯生物合成途径的终端，直接参与萜烯产物合成，其在植物萜烯代谢中起到至关重要的作
紫丁香（Syringa oblata Lindl. ex Carr.）隶属于木犀科（Oleaceae）丁香属（Syringa），花香浓郁、花色雅致、姿态优美，抗逆性强，是我国北方常见的庭园观赏植物，也是研究植物花香的优良材料。近些年，对紫丁香花香的研究发现，萜烯类化合物是其主要的花香成
供试材料紫丁香采集于北京农学院丁香种质资源圃。在紫丁香开花期间，选择晴朗无风的上午9∶00-10∶00分别采集4个不同花期（花蕾期、初开期、盛开期和衰败期）的植株前后左右不同方位的花瓣用于花香成分测定，花期分类及采样标准参考Ma
采用顶空固相微萃取（HS-SPME）技术采集花香，主要步骤为：用20 mL样品瓶装好0.5 g花瓣鲜样，加入5 μL内标（10 mL无水乙醇+1 μL 3-辛醇），水浴平衡5 min后将萃取头插入萃取瓶，推出萃取纤维至花朵上方1 cm处，进行萃取。设置25 ℃、30 ℃、35 ℃的萃取温度和35 min、40 min、45 min的萃取时间。采集同一个花序轴上大小相近的花瓣分成3组作为生物学重复，每个样本按照上述程序重复测定花香3次作为技术重复。设置空白顶空进样瓶作对照。
利用气相色谱-质谱联用仪（GC-MS）鉴定花香化合物种类及其释放量。使用NIST08数据库，对各化合物成分进行定性分析，根据内标法进行定量分析，通过气相色谱-质谱联用（GC-MS）软件计算相对峰面积。
采用液氮研磨法将采集到的不同花发育时期的花瓣磨成粉末，参照RNA提取试剂盒（艾德莱生物科技有限公司，北京）说明书提取RNA，并通过2 %琼脂糖凝胶电泳检测质量；使用艾科瑞Evo M-MLV反转录试剂盒（艾科瑞生物工程有限公司， 湖南）获得cDNA，于-20 ℃冰箱备用，方法参照试剂盒说明。
以反转录的cDNA为模板，设计特异性定量引物（
引物名称 Primer name | 引物序列（5'-3'） Primer sequence （5'-3'） | 用途 Utilization |
|---|---|---|
| SoTPS2-F | ATGGCAGTCTACAAGATCTTCTC | 基因克隆 |
| SoTPS2-R | CTATGACCTACGAATTGTGGCA | |
| SoTPS3-F | ATGGCACATATCATCCAACTCC | |
| SoTPS3-R | CTATGGCTGCGTCAATTGAATAGG | |
| qSoTPS2-F | GGTTTGCTTCAGGGCACTTG | 荧光定量表达 |
| qSoTPS2-R | CATCCACCTGAACGGTTCCA | |
| qSoTPS3-F | AAAGAAGTTGGAGGAGGCGG | |
| qSoTPS3-R | CTAAACCGGTATCCCAGGCC | |
| qSoActin-F | TGGAATGTGCTGAGAGATGC | 内参引物 |
| qSoActin-R | TGCTGACCGTATGAGCAAAG |
根据课题组已有基因组和转录组数
使用在线网站NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov）BLAST工具比对基因核苷酸序列相似性；用DNAMAN软件比对氨基酸序列；用在线网站ExPASy（http：//web.expasy.org/protparam/）分析蛋白质理化性质；用在线网站NPSA（http：//npsapbil.ibcp.fr/cgibin/secpred_sopma.pl）预测蛋白质二级结构；用在线网站SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/）预测蛋白质三级结构；用NCBI网站CD-Search工具分析蛋白质保守结构域；用MEGA7软件构建系统进化树。
将拟过表达基因（SoTPS2、SoTPS3）的CDS序列构建到pNC-Cam3304-35S载体（中国热带农业科学院热带生物技术研究所言普博士提供）中，得到pNC-Cam3304-35S-SoTPS2（简称：35S-SoTPS2）和pNC-Cam3304-35S-SoTPS3（简称：35S-SoTPS3）重组载体，以pNC-Cam3304-35S（简称：35S）的空载体作为对照，将重组载体和空载体转入农杆菌感受态GV3101中培养扩繁，收集菌体后用侵染液重悬，OD600值调为0.8~1.2，将含有pNC-Cam3304-35S-SoTPS2、pNC-Cam3304-35S-SoTPS3和pNC-Cam3304-35S载体的侵染液避光孵育3 h。用1 mL针孔注射器侵染金鱼草花瓣背面，在黑暗条件下培养1 d后正常光照4~6 d左右，待花朵盛开状态时进行花香成分测定，同时测定相关基因的表达水平。
当萃取温度为25 ℃时，随萃取时间的增加，花香释放量和挥发物种类均呈上升趋势（
图1 不同萃取温度和时间花香释放量和种类的变化
Fig. 1 Comparison of volatile species and release amount at different extraction temperatures and times
A：25 ℃；B：30 ℃；C：35 ℃
萃取温度为30 ℃时花香释放量大于25 ℃和35 ℃，表明一定温度的升高可以加大挥发物的扩散从而加快吸附速度，当萃取达到平衡时，温度再升高可能导致挥发物在涂层和样品中的分配系数减小，灵敏度降低，导致吸附减少。因此，紫丁香最适的花香固相微萃取条件为30 ℃萃取40 min。
4个花发育时期的花香总释放量呈先升高后下降的趋势，盛开期达到最高，其释放量约为初开期和花蕾期的40倍。在4个花发育时期，萜烯类化合物的释放量占总释放量比例均最高，分别为78.99 %、67.42 %、85.61 %和83.49 %，在盛开期萜烯类化合物释放量达到最大值（
图2 4个花发育时期不同类成分的相对含量
Fig. 2 The releative content of different categories in petals of four development stages
图3 紫丁香4个花发育时期萜烯类化合物释放量
Fig. 3 Terpenoids released in four development periods of S. oblata
以紫丁香的cDNA为模板PCR扩增获得SoTPS2和SoTPS3基因的开放阅读框（ORF）全长，分别为1731 bp和1779 bp；全长序列分别编码576个和592个氨基酸（
图4 紫丁香SoTPS2和SoTPS3基因序列全长及编码氨基酸序列
Fig. 4 Full-length sequences and coding amino acids of SoTPS2 and SoTPS3 of S. oblata
A：SoTPS2；B：SoTPS3
SoTPS2和SoTPS3与其他物种的氨基酸进行同源性比对及系统进化树分析，表明SoTPS2与金鱼草的罗勒烯合酶（AmTPS2）和月桂烯合酶（AmTPS1）相似性最高；SoTPS3与桂花（Osmanthus fragrans L.）的反式罗勒烯合酶（OfTPS1/2）以及油橄榄（Olea europaea L.）的萜类合酶（OeTPS3）相似性最高（图
图5 紫丁香SoTPS2和SoTPS3与其他植物TPS蛋白同源性比对
Fig. 5 Comparison of amino acid sequences encoded by SoTPS2 and SoTPS3 of S. oblata with other plant homologs
黑色、红色、蓝色部分分别表示同源性=100 %、≥75 %、≥50 %；红框为基序DDXXD和DXXXXE
A：SoTPS2；B：SoTPS3；The black， red， and blue parts represent homology =100 %， ≥75 %， ≥50 %， respectively； Red boxes are the DDXXD and DXXXXE motifs
图6 紫丁香SoTPS2、SoTPS3与其他物种的系统进化树
Fig. 6 Phylogenetic trees of SoTPS2 and SoTPS3 of S. oblata
SoTPS2和SoTPS3基因具有表达差异性（P＜0.05）。qRT-PCR结果显示，2个基因在4个不同花发育时期表达量呈先上升后下降的趋势，均在盛开期达到最高，盛开期SoTPS2表达量是初开期的5.39倍，衰败期下降回初开期表达水平，盛开期SoTPS3表达量是初开期的37倍，衰败期下降至初开期的21.4倍；盛开期的不同组织里，SoTPS2和SoTPS3基因在花瓣的表达量显著高于其他组织，在茎和叶中几乎无表达（
图7 紫丁香SoTPS2和SoTPS3在不同花发育时期和不同组织中的相对表达量
Fig. 7 SoTPS2 and SoTPS3 genes releative expression level in different development stages and in different tissues of S. oblata
不同的小写字母表示组间在0.05水平上差异显著
A： SoTPS2； B： SoTPS3； Different normal letters mean significant differences at 0.05 level
利用金鱼草花瓣瞬时过表达SoTPS2和SoTPS3基因，分析基因的表达量和单萜化合物释放量的变化（
图8 金鱼草中瞬时过表达SoTPS2和SoTPS3后基因表达量及单萜化合物释放量
Fig. 8 Gene releative expression and monoterpene compound release after transient overexpression of SoTPS2 and SoTPS3 in A.majus ‘Maryland’
A：SoTPS2；B：SoTPS3；左：基因相对表达量；右：单萜化合物相对释放量
A： SoTPS2； B： SoTPS3； Left： Gene releative expression； Right： Releative release of monoterpene compound；
因花香比花形、花色等表观植物性状更复杂，所以快速准确地对植物花香进行采集在研究进程中尤为重
萜烯合酶作为萜烯合成最后一步的关键酶，虽然其基因序列具有一定的保守性，但TPS蛋白在进化过程中及在不同的植物中具有多样性，其家族成员中包含了100多个基因，对萜烯化合物的合成种类具有直接的决定作
目前紫丁香尚未建立成熟的遗传转化体系，异源植物中转基因功能验证是常用方法。冯
综合所述，SoTPS2和SoTPS3基因均参与单萜类化合物合成，初步明确了其对紫丁香萜烯类化合物合成的促进作用，为紫丁香在萜烯化合物合成机制的研究奠定了基础。
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