野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因鉴定及其表达分析

张华; 李娜; 邢馨竹; 邵振启; 李喜焕; 张彩英; ZHANG Hua; LI Na; XING Xinzhu; SHAO Zhenqi; LI Xihuan; ZHANG Caiying

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河北农业大学农学院/华北作物改良与调控国家重点实验室/华北作物种质资源研究与利用教育部重点实验室/ 河北省作物种质资源重点实验室，保定 071001

最近更新：2024-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231125001

目录contents

摘要

几丁质酶是以几丁质等为底物的糖基水解酶（GH，glycosyl hydrolases），在植物生长发育及抵御逆境中发挥重要功能。然而，大豆几丁质酶基因的组织表达模式及对逆境的响应尚不清楚，影响了其在遗传改良中的应用。本研究分别鉴定野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因，并分析其表达模式。结果发现，野生大豆与栽培大豆分别含62个和55个几丁质酶基因，位于17条和18条染色体上；进化树分析发现，117个基因分为5类，其中类群III与类群V属于GH18亚家族，类群I、类群II与类群IV属于GH19亚家族；启动子分析发现，几丁质酶家族成员包含响应激素及逆境胁迫顺式作用元件。栽培大豆几丁质酶基因表达分析发现，其在不同组织及抗病耐逆等过程差异表达，其中Gm.01G142400和Gm.13G346700等在接种花叶病毒的抗病品种叶片中诱导表达，Gm.03G254300和Gm.20G164600等在低磷胁迫的磷高效品种根系中诱导表达，Gm.08G259200和Gm.19G245400等在低磷胁迫根瘤中诱导表达；野生大豆几丁质酶基因表达分析发现，其在不同组织及耐盐过程差异表达，其中Gs.02G002604和Gs.02G002940等在盐胁迫耐盐品种叶片中诱导表达。以上结果为挖掘利用几丁质酶基因奠定了基础。

关键词

几丁质酶; 野生大豆; 栽培大豆; 基因家族; 表达模式

几丁质酶（Chitinase）是一类以几丁质、壳聚糖、脂壳寡糖以及肽聚糖等天然高聚物为底物的糖基水解酶（GH，glycosyl hydrolases）^［

1-2］，其产物丁寡糖、壳聚糖和N-乙酰氨基葡萄糖不仅能增强植物自身的抗病菌能力，并且具有抑制人类肿瘤细胞生长的功能，在医药行业具有广阔的应用前景^{［参考文献 3-4}3-4］。通常情况下，根据几丁质酶水解反应产生的初级产物，可将其分为内切几丁质酶和外切几丁质酶，而植物体内多为内切几丁质酶，其主要作用于几丁质的β-1，4-糖苷键，形成几丁单糖、几丁二糖和低聚糖等产物^{［参考文献 5

百度学术}5］。同时，根据几丁质酶的氨基酸序列同源性又可将其分为糖苷水解酶18（GH18）与糖苷水解酶19（GH19）两个亚家族^{［参考文献 6-7}6-7］。对几丁质酶家族成员进行系统发育树分析可将其分为五类（I~V），其中III类与V类属于GH18亚家族，而I、II与IV类属于GH19亚家族^{［参考文献 8

百度学术}8］。有研究发现，GH18亚家族的III类几丁质酶通常包含保守序列DXDXE与GH18催化结构域，且其GH18催化结构域由8个α螺旋与8个平行β折叠构成，GH18亚家族的V类几丁质酶尽管也含有与III类相同的保守序列与结构域，但它们之间的同源性很低^{［参考文献 9-10}9-10］。与GH18亚家族不同，GH19亚家族的I类几丁质酶含有一个N-端几丁质结合结构域和一个C端催化结构域，且II类几丁质酶包含的结构域与I类C端的催化结构域同源，而IV类几丁质酶尽管与I类的保守结构域同源性较高，但其结合结构域较I类缺少部分氨基酸，且C端的延伸区不完整^{［参考文献 11

百度学术}11］。

很多植物含有几丁质酶，主要在根、茎、叶、花、荚等组织部位表达^［

12-13］，尤其是当植物受到含几丁质的昆虫和病菌等生物胁迫以及遇到高温、干旱等非生物胁迫时，其体内的几丁质酶含量迅速发生改变^{［参考文献 14-16}14-16］。有学者发现，超表达拟南芥几丁质酶基因CAChi2可增强其对丁香假单胞菌的抗性^{［参考文献 17

百度学术}17］；外施水杨酸、乙烯以及甲基茉莉酸也可显著提高水稻几丁质酶基因Oschib1表达^{［参考文献 18

百度学术}18］。尽管目前在模式植物拟南芥和水稻中已有几丁质酶基因家族鉴定及其生物学功能分析的报道，但其在大豆生长发育以及响应外界逆境环境方面的功能尚不清楚，尤其是随着野生大豆和栽培大豆高质量基因组的公布，鉴定几丁质酶基因家族对发挥其在大豆重要性状遗传改良中的作用具有一定理论价值。

鉴于此，本研究分别利用野生大豆（Glycine soja Sieb. and Zucc.）W05高质量基因组（W05a1）和栽培大豆（Glycine max（L.）Merr.）Williams 82高质量基因组（Wm82a4v1）鉴定几丁质酶基因家族成员，并对其理化性质、染色体分布、系统进化关系、启动子顺式作用元件以及不同组织部位和抗病耐逆过程中的表达模式进行分析，为进一步发挥该类基因在大豆生长发育及抵御生物和非生物胁迫中的作用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 大豆几丁质酶基因家族鉴定及其生物信息学分析

首先从SoyBase数据库（https：//www.soybase.org/）下载野生大豆W05（W05a1）和栽培大豆Williams 82（Wm82a4v1）最新版本基因组序列，并在NCBI网站（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）查找拟南芥与水稻基因组的所有几丁质酶家族成员蛋白序列；随后以这些蛋白序列为种子序列，在大豆基因组数据中进行BLAST分析，寻找含GH18（PF00704）或GH19（PF00182）结构域的同源基因，同时结合Pfam数据库（http：//Pfam/search.shtml）寻找GH18（PF00704）和GH19（PF00182），鉴定大豆几丁质酶家族基因；再利用NCBI数据库中的Conserved Domain Database（http：//www.ncbi.nlm.nih. gov/cdd/）工具，保留具有GH18和GH19保守结构域的基因^［

19］。分别利用在线工具ExPASy-ProtParam tool（http： //www.expasy.org/tools/ protparam.html）与Cell-PLoc 2.0（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）分析几丁质酶基因的蛋白理化性质及其亚细胞定位^{［参考文献 20-21}20-21］。

1.2 几丁质酶家族成员系统进化分析

利用MEGA7.0软件对野生大豆、栽培大豆、拟南芥与水稻几丁质酶基因编码蛋白进行多序列比对，并采用相邻连接法（NJ，neighbor-joining）构建系统进化树，参数设置为Bootstrap 1000次重复^［

22］。

1.3 几丁质酶基因染色体定位与共线性分析

在SoyBase数据库获取大豆几丁质酶基因家族成员物理位置，利用TBtools软件（https：//github.com/CJ-Chen/TBtools）将基因的染色体定位结果进行可视化；通过TBtools软件的OneStepMCScanX-Super Fast工具对基因进行共线性分析。

1.4 几丁质酶家族成员保守基序分析

利用TBtools软件的Simple MEME Wrapper工具获得几丁质酶的蛋白保守基序，其中，最大基序数设为10，通过Visvalize MEME/MAST Motif Pattern工具实现其结果的可视化。

1.5 几丁质酶基因顺式作用元件分析

利用TBtools截取大豆几丁质酶家族基因的上游2000 bp序列，通过PlantCare（http：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析其顺式作用元件。

1.6 几丁质酶基因表达模式分析

利用课题组栽培大豆抗病品种（齐黄30）接种花叶病毒（SMV，soybean mosaic virus）不同时间（3 h、24 h、5 d、10 d和14 d）叶片转录组数据（以接种PBS缓冲液为对照）^［

23］、磷高效品种（中黄15）低磷胁迫处理不同时间（7 d、28 d、49 d和70 d）根系转录组数据（以正常磷处理为对照）^{［参考文献 24

百度学术}24］以及低磷处理的成熟根瘤转录组数据（以正常磷处理为对照）^{［参考文献 25

百度学术}25］，分别分析几丁质酶家族基因的表达模式。同时，利用前人已报道的栽培大豆和野生大豆不同组织部位转录组数据^{［参考文献 26-27}26-27］，野生大豆盐胁迫处理不同时间（3 h、10 h，以0 h为对照）叶片转录组数据^{［参考文献 28

百度学术}28］，以及抗裂荚与易裂荚大豆品种豆荚发育不同时间的转录组数据^{［参考文献 29

百度学术}29］，分析几丁质酶基因的表达模式，并筛选存在表达差异的候选基因。

2 结果与分析

2.1 大豆几丁质酶基因家族鉴定及其理化性质

本研究分别在野生大豆W05与栽培大豆Williams 82基因组中鉴定到62个和55个几丁质酶基因（表1、表2），其中野生大豆几丁质酶基因编码的蛋白长度范围为114~820个氨基酸（表1），栽培大豆几丁质酶基因编码的蛋白长度范围为78~820个氨基酸（表2）；亚细胞定位预测结果显示，上述几丁质酶基因编码蛋白主要位于细胞膜、细胞壁、液泡与细胞外基质。

表1 野生大豆几丁质酶基因家族鉴定

Table 1 Identification of chitinase gene family members in wild soybean

基因ID Gene ID	编码蛋白 Coding protein	亚细胞定位 Subcellular localization	基因ID Gene ID	编码蛋白 Coding protein	亚细胞定位 Subcellular localization
Gs.01G000553	296	液泡	Gs.03G008247	416	细胞壁
Gs.01G001524	283	细胞膜	Gs.05G011572	298	细胞外基质
Gs.02G002604	281	液泡	Gs.07G017058	289	液泡
Gs.02G002940	320	液泡	Gs.07G017060	341	细胞外基质
Gs.02G003628	296	液泡	Gs.08G021659	326	液泡
Gs.03G005867	289	细胞膜	Gs.08G022105	420	液泡
Gs.03G005868	289	细胞膜	Gs.08G022109	204	细胞壁
Gs.03G005869	289	细胞膜	Gs.09G023118	317	液泡
Gs.03G005871	289	细胞膜	Gs.09G023940	309	细胞壁
Gs.03G005873	289	细胞膜	Gs.09G023990	299	液泡
Gs.03G005877	289	细胞膜	Gs.10G027023	225	细胞外基质
Gs.03G005879	289	细胞膜	Gs.10G027869	304	液泡
Gs.03G005932	280	细胞膜	Gs.11G029753	294	细胞膜
Gs.03G008223	303	细胞外基质	Gs.11G029754	178	细胞壁
Gs.11G029956	304	细胞壁	Gs.17G046619	384	细胞壁
Gs.11G030829	379	细胞壁	Gs.18G048250	295	液泡
Gs.11G032516	308	细胞壁	Gs.18G048257	310	液泡
Gs.11G032517	263	细胞膜	Gs.18G048258	211	液泡
Gs.11G032669	274	液泡	Gs.18G048259	297	液泡
Gs.12G033410	114	细胞膜	Gs.18G049856	329	液泡
Gs.12G033411	280	液泡	Gs.19G050817	316	细胞外基质
Gs.12G034517	298	液泡	Gs.19G052278	277	细胞外基质
Gs.14G038380	156	细胞壁	Gs.19G052570	148	细胞外基质
Gs.15G039684	820	细胞膜	Gs.19G052599	196	细胞壁
Gs.15G039953	289	细胞壁	Gs.20G053031	800	细胞核
Gs.15G040923	318	液泡	Gs.20G054344	252	液泡
Gs.16G043472	317	液泡	Gs.20G054345	333	细胞外基质
Gs.16G043474	196	液泡	Gs.20G054347	299	液泡
Gs.16G044028	297	液泡	Gs.U055170	762	叶绿体
Gs.17G045193	374	细胞壁	Gs.U055172	365	细胞壁
Gs.17G045457	377	细胞壁	Gs.U055208	197	细胞外基质

野生大豆基因ID Glysoja缩写为Gs.；下同

Wild soybean gene ID Glysoja was abbreviated to Gs.；The same as below

表2 栽培大豆几丁质酶基因家族鉴定

Table 2 Identification of chitinase gene family members in cultivated soybean

基因ID Gene ID	编码蛋白 Coding protein	亚细胞定位 Subcellular localization	基因ID Gene ID	编码蛋白 Coding protein	亚细胞定位 Subcellular localization
Gm.01G055200	296	液泡	Gm.05G075000	298	细胞外基质
Gm.01G142400	283	细胞膜	Gm.07G005801	78	细胞膜
Gm.01G160100	275	液泡	Gm.08G259200	326	液泡
Gm.02G007400	281	液泡	Gm.08G299700	300	液泡
Gm.02G042500	320	液泡	Gm.08G300300	245	细胞外基质
Gm.02G113600	296	液泡	Gm.09G038500	317	液泡
Gm.03G024400	289	细胞膜	Gm.09G121000	309	细胞壁
Gm.03G024500	289	细胞膜	Gm.09G126200	299	液泡
Gm.03G024566	289	细胞膜	Gm.10G227700	304	液泡
Gm.03G024900	289	细胞膜	Gm.11G146899	304	细胞壁
Gm.03G025000	289	细胞膜	Gm.12G049100	114	细胞膜
Gm.03G025200	289	细胞膜	Gm.12G049200	280	液泡
Gm.03G030500	280	细胞膜	Gm.12G156600	298	液泡
Gm.03G254300	303	细胞外基质	Gm.13G155800	379	细胞壁
Gm.03G256800	418	细胞壁	Gm.13G330800	308	细胞壁
Gm.13G330900	264	细胞膜	Gm.18G120200	295	液泡
Gm.13G346700	274	液泡	Gm.18G120700	295	液泡
Gm.14G110700	174	细胞壁	Gm.18G283400	329	液泡
Gm.15G015100	820	细胞膜	Gm.19G076200	316	细胞外基质
Gm.15G043300	298	细胞壁	Gm.19G221800	272	细胞外基质
Gm.15G143600	318	液泡	Gm.19G245400	211	细胞膜
Gm.15G206400	762	叶绿体	Gm.19G245500	194	细胞膜
Gm.15G206800	365	细胞壁	Gm.20G164600	301	液泡
Gm.16G119200	317	液泡	Gm.20G164700	333	细胞外基质
Gm.16G173000	297	液泡	Gm.20G164900	299	液泡
Gm.17G076100	374	细胞壁	Gm.U031104	289	细胞膜
Gm.17G103500	377	细胞壁	Gm.U031204	289	细胞膜
Gm.17G217000	384	细胞壁

栽培大豆基因ID Glyma缩写为Gm.；下同

Cultivated soybean gene ID Glyma was abbreviated to Gm.；The same as below

分析野生大豆62个几丁质酶基因的染色体分布发现（图1A），59个基因位于17条染色体（除4号、6号和13号染色体），另外3个基因（Gs.U055170、Gs.U055172和Gs.U055208）未定位到染色体，且59个基因的染色体分布不均衡，其中以3号染色体分布的基因数量最多（10个），其次为11号染色体（7个）和18号染色体（5个）。分析栽培大豆55个几丁质酶基因的染色体分布发现（图1B），其中53个基因定位于18条染色体（除4号和6号染色体），另外2个基因（Gm.U031104和Gm.U031204）未定位到染色体，并以3号染色体分布的基因数量最多（9个），其次为15号染色体（5个）、13号染色体（4个）和19号染色体（4个）。与野生大豆相比，栽培大豆的3号、7号、10号与16号染色体的几丁质酶基因数量分别减少1个，18号染色体减少2个，11号染色体减少6个，而1号染色体增多1个，15号染色体增多2个，13号染色体增多4个，推测野生大豆驯化为栽培大豆的过程中几丁质酶基因家族成员可能发生了基因丢失与易位现象。

（图1）

A：野生大豆几丁质酶基因：B：栽培大豆几丁质酶基因

A： Wild soybean chitinase genes； B： Cultivated soybean chitinase genes

图1 野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因的染色体分布

Fig. 1 Chromosome distributions of chitinase genes in wild and cultivated soybean

2.2 几丁质酶基因家族系统进化树与共线性分析

对上述鉴定的野生大豆和栽培大豆几丁质酶基因编码蛋白构建系统进化树（以拟南芥与水稻几丁质酶基因为参考），结果发现（图2），可将其划分为5类（分别命名为类群I~类群V），其中类群III与类群V属于糖基水解酶GH18亚家族，而类群I、类群II与类群IV属于GH19亚家族，GH18亚家族的类群III包含的几丁质酶基因数量最多（含32个野生大豆基因和25个栽培大豆基因），GH19亚家族的类群II包含的几丁质酶基因数量最少（含5个野生大豆基因和3个栽培大豆基因）。

图2 大豆几丁质酶家族成员系统进化树分析

Fig. 2 The phylogenetic tree of chitinase family members in soybean

对野生大豆与栽培大豆几丁质酶基因进行共线性分析发现（图3），共有78对基因存在共线性关系，且染色体分布多样，如野生大豆10号染色体Gs.10G027869与栽培大豆Gm.09G126200、Gm.10G227700、Gm.16G173000和Gm.20G164600具有共线性，而栽培大豆2号染色体Gm.02G007400与野生大豆Gs.02G002604、Gs.10G027023和Gs.19G052278具有共线性。进一步分析不同染色体的基因共线性发现，野生大豆11号染色体与栽培大豆的共线性基因数量最多（11个）。此外，野生大豆的2对几丁质酶基因（Gs.01G000553和Gs.02G003628、Gs.02G002604和Gs.10G027023）以及栽培大豆的19对几丁质酶基因（Gm.01G055200和Gm.02G113600、Gm.01G160100和Gm.02G042500等）的非同义突变（Ka）与同义突变（Ks）比值小于1，表明这些基因在进化过程中经历了纯化选择，消除了有害突变，并使蛋白保持不变。

图3 大豆几丁质酶基因家族成员共线性分析

Fig.3 Collinear relationships of chitinase family genes in soybean

灰色线连接共线性基因，蓝色线连接野生大豆纯化选择基因，红色线连接栽培大豆纯化选择基因；红色字体为野生大豆基因，黑色字体为栽培大豆基因

Gray lines indicate collinear genes， the blue lines indicate wild soybean purification selection genes， and the red lines indicate cultivated soybean purification selection genes； red font indicate wild soybean genes， black font indicate cultivated soybean genes

2.3 几丁质酶基因保守基序分析

分析野生大豆和栽培大豆几丁质酶基因的保守基序发现（图4），在GH18与GH19亚家族分别鉴定到10个保守基序，将其命名为motif 1~motif 10，其中39.08%的GH18亚家族基因同时含有motif 1、motif 2、motif 3、motif 7和motif 9，而46.67%的GH19亚家族基因则同时含有motif 1、motif 2、motif 4、motif 6、motif 7和motif 9。进一步分析发现，同一亚家族的野生大豆与栽培大豆基因存在相同的保守基序，如类群V的野生大豆Gs.03G005867、Gs.03G005868、Gs.03G005869、Gs.03G005871、Gs.03G005873、Gs.03G005877、Gs.03G005879与栽培大豆的Gm.03G024400、Gm.03G024500、Gm.03G024566、Gm.03G024900、Gm.03G025000、Gm.03G025200、Gm.U031104、Gm.U031204均含有motif 1、motif 2、motif 4、motif 5、motif 6和motif 8基序，说明几丁质酶基因在野生大豆向栽培大豆的进化过程中保留了较多相对保守的蛋白基序，这些基序可能对大豆生长发育具有重要作用。

图4 大豆几丁质酶家庭成员保守基序分析

Fig. 4 Motif structure analysis of chitinase family members in soybean

A：GH18亚家族成员保守基序分析；B：GH19亚家族成员保守基序分析

A： Motif structure analysis of GH18 subfamily； B： Motif structure analysis of GH19 subfamily

2.4 几丁质酶基因启动子调控元件分析

分析几丁质酶基因上游启动子顺式作用元件发现（图5），几丁质酶家族成员包含赤霉素、脱落酸、水杨酸、光照、干旱、低温与细胞分化等响应元件。进一步分析发现（图5A），95%的野生大豆几丁质酶基因启动子序列中含有响应植物激素的元件，73%的基因含有脱落酸响应元件，45%的基因含有水杨酸响应元件，68%的基因含有茉莉酸响应元件，42%的基因含有响应干旱的MYB结合位点，35%的基因含有参与低温胁迫的调控元件，15%的基因含有参与籽粒生长发育的调控元件，并且所有的基因都含有光响应元件，另有少部分基因含有参与细胞分化与细胞周期的调控元件。

图5 大豆几丁质酶基因启动子区的顺式作用元件分析

Fig.5 Cis-acting elements analyses of chitinase family genes in soybean

A：野生大豆：B：栽培大豆

A： Wild soybean； B： Cultivated soybean

栽培大豆几丁质酶基因上游启动子序列中也含有响应多种植物激素以及生物与非生物胁迫的元件（图5B），如96%的基因含有激素响应元件，其中82%的基因含有脱落酸响应元件，31%的成员具有水杨酸响应元件，71%的成员具有茉莉酸响应元件，而含有干旱、低温以及籽粒生长发育调控元件的基因数量则分别占42%、24%与13%。另外还发现，与野生大豆相比，栽培大豆几丁质酶基因启动子序列中含有一类能够响应植物类黄酮的MYB转录因子结合位点，表明其可能在野生大豆驯化为栽培大豆过程中发挥一定功能。

2.5 几丁质酶家族基因表达模式分析

2.5.1 栽培大豆不同组织器官中的表达模式分析

分析栽培大豆55个几丁质酶基因在不同组织器官的表达模式发现（图6），几乎在各个组织部位均能检测到该类基因的表达，充分说明其对大豆正常生长发育的重要性以及发挥功能的多样性，如GH18亚家族Gm.03G256800、GH19亚家族Gm.08G259200、Gm.09G038500与Gm.18G283400在根、茎、叶、花、荚、种子以及根瘤均有表达，而有些几丁质酶基因的表达具有明显的组织特异性，如GH19亚家族Gm.16G119200在叶片优势表达，而GH18亚家族Gm.13G155800和Gm.17G103500则在根系优势表达，表明这些基因可能与大豆叶片或根系的生长发育有关。另有一些基因如Gm.03G024400、Gm.03G030500和Gm.09G126200等在根瘤和根系优势表达，可能与大豆的根瘤形成有关；还有一些基因在上述所有组织部位的表达量均较低，如GH18亚家族Gm.02G113600、Gm.08G299700、Gm.09G121000、Gm.14G110700、Gm.15G206400、Gm.18G120200和GH19亚家族Gm.12G049100等，推测其可能只在某些特定环境或某类胁迫与刺激诱导条件下发挥功能。

图6 几丁质酶基因在栽培大豆不同组织部位的表达模式分析

Fig. 6 Expression analysis of chitinase genes in different cultivated soybean tissues

2.5.2 栽培大豆抗病品种接种花叶病毒不同时间的表达模式分析

分析栽培大豆抗病品种叶片接种花叶病毒不同时间几丁质酶基因表达量发现（图7），有15个基因诱导表达，其接种处理的表达量是对照处理的2.0~22.9倍。进一步分析发现，其中4个基因（Gm.01G142400、Gm.02G042500、Gm.09G126200和Gm.13G346700）在花叶病毒接种后的表达量达到对照处理的5倍以上，其中Gm.01G142400在接种花叶病毒的3个不同时间（3 h、24 h和10 d）表达量分别是对照处理的14.0倍、2.4倍和8.4倍，其余3个基因在接种处理后的表达量亦达到对照处理的5.7~22.9倍，推测这些基因在大豆抵抗花叶病毒侵染或扩展过程中发挥一定功能。

图7 几丁质酶基因在栽培大豆抗病品种接种花叶病毒后的表达分析

Fig. 7 Expression analysis of chitinase genes after SMV inoculation in resistant cultivated soybean variety

QH30：齐黄30，抗花叶病毒品种

QH30：Qihuang30， high-resistant cultivated soybean variety

2.5.3 栽培大豆磷高效品种低磷胁迫不同时间的表达模式分析

分析几丁质酶基因在磷高效品种低磷处理4个不同时间的根系表达量发现（图8），有16个基因（Gm.03G024400、Gm.03G030500、Gm.03G254300和Gm.15G043300等）受低磷胁迫诱导表达，其低磷处理下的表达量是正常磷处理的2.0~6.7倍。进一步分析发现，有5个基因（Gm.03G254300、Gm.09G038500、Gm.15G043300、Gm.15G143600和Gm.20G164600）在多个处理时间的表达量高于正常磷处理，其中Gm.03G254300在低磷处理3个时间（7 d、28 d和49 d）的表达量分别是正常磷处理的2.6倍、3.7倍和4.5倍，其余4个基因在低磷处理不同时间的表达量亦达到正常磷处理的2.0~4.5倍，推测这些基因对大豆根系抵御外界低磷逆境具有重要作用。

图8 几丁质酶基因在栽培大豆磷高效品种低磷处理不同时间后的表达分析

Fig. 8 Expression analysis of chitinase genes after low phosphorous treatment in high-efficiency cultivated soybean variety

ZH15：中黄15，磷高效品种

ZH15：Zhonghuang15， high-efficiency cultivated soybean variety

分析几丁质酶基因在低磷胁迫28 d的大豆成熟根瘤表达量发现（图9），有12个基因（Gm.08G259200、Gm.09G126200、Gm.15G043300、Gm.16G173000、Gm.17G217000、Gm.18G283400和Gm.19G245400等）被诱导表达，其低磷处理下的表达量是正常磷处理下的5.1~43.3倍，说明这些基因可能参与了低磷胁迫条件下的大豆根瘤形成和生物固氮过程。

图9 几丁质酶基因在栽培大豆低磷处理成熟根瘤后的表达分析

Fig. 9 Expression analysis of chitinase genes in cultivated soybean mature nodules after low phosphorous treatment

NP： Normal phosphorous； LP： Low phosphorous

2.5.4 野生大豆不同组织器官中的表达模式分析

分析野生大豆几丁质酶基因的不同组织器官表达模式（图10），结果发现Gs.03G008247、Gs.08G021659、Gs.09G023118、Gs.15G040923和Gs.18G049856等在野生大豆的根、茎、叶、花和种子均有表达，属于组成型表达基因；相反，Gs.03G008223、Gs.18G048257和Gs.19G052570等在野生大豆根系优势表达，Gs.07G017058在花中优势表达，Gs.19G052599在种子中优势表达，属于组织特异性表达基因。另有一些基因如Gs.02G003628、Gs.10G027023、Gs.11G029754、Gs.16G043474、Gs.18G048250、Gs.18G048259和Gs.U055208等则在上述组织部位的表达量均较低。

图10 几丁质酶基因在野生大豆不同组织部位的表达模式分析

Fig. 10 Expression analysis of chitinase genes in different wild soybean tissues

2.5.5 野生大豆与栽培大豆之间的组织表达差异分析

分析几丁质酶基因在野生大豆和栽培大豆之间的组织器官差异表达（图11），结果发现绝大多数基因在二者之间的表达模式基本相同，但也有部分基因在二者之间的表达模式存在较大差异。进一步分析上述存在表达差异的基因，结果发现Gs.02G002604在栽培大豆的盛荚期叶片中表达量最高，其次是初花期叶片，在野生大豆中的表达量以盛荚期叶片最高，而在初花期叶片中的表达量则非常低；Gs.16G044028在栽培大豆的初花期叶片和盛荚期叶片的表达量最高，而在野生大豆的初花期叶片表达量较低；Gs.20G054345在栽培大豆的种子中表达量最高，其次是豆荚，在野生大豆的表达量以种子最高，其次是花，而在豆荚中的表达量则很低。

图11 几丁质酶基因在栽培大豆与野生大豆之间的组织表达差异

Fig. 11 Different expressions of chitinase genes between wild and cultivated soybeans

基因ID-C：栽培大豆中的基因表达量；基因ID-W：野生大豆中的基因表达量

Gene ID-C： Gene expressions in cultivated soybean； Gene ID-W： Gene expressions in wild soybean； V1： First leaf； R1： Initial flowering； R4： Full pod

2.5.6 盐胁迫下野生大豆叶片中的表达分析

利用前人已报道的2个野生大豆（耐盐品种和盐敏感品种）盐胁迫处理不同时间（3 h、10 h，以0 h为对照）的叶片转录组数据^［

28］，分析野生大豆几丁质酶基因表达模式（图12），结果发现Gs.02G002604、Gs.02G002940、Gs.12G034517和Gs.17G045193的表达量在耐盐品种盐胁迫处理3 h和10 h呈现上升趋势，而在盐敏感品种中的表达量与对照相比则基本未变，Gs.09G023118表达量则在盐敏感品种盐胁迫处理3 h和10 h呈现上升，而在耐盐品种中的表达量与对照相比基本未变，推测这些基因可能与野生大豆耐盐性有关。

图12 盐胁迫下野生大豆叶片中的几丁质酶基因表达

Fig. 12 Expressions of chitinase genes under salt stress condition in wild soybean leaves

T-3h/0h和T-10h/0h：耐盐野生大豆盐胁迫3 h和10 h的相对表达量；S-3h/0h和S-10h/0h：盐敏感野生大豆盐胁迫3 h和10 h的相对表达量

T-3h/0h and T-10h/0h： Relative expressions at 3 h and 10 h after salt stress in tolerant wild soybean；S-3h/0h and S-10h/0h： Relative expressions at 3 h and 10 h after salt stress in sensitive wild soybean

2.5.7 不同裂荚大豆品种豆荚中的表达分析

利用前人已报道的不同裂荚特性大豆品种（5个抗裂荚品种，5个易裂荚品种）豆荚开裂关键时期转录组数据^［

29］，分析上述55个栽培大豆几丁质酶基因表达情况，结果发现，个别基因如GH18亚家族Gm.01G142400在5个抗裂荚品种豆荚中的表达量均较高，而在4个易裂荚品种豆荚中的表达量较低，故推测其可能与大豆抗裂荚特性有关。

3 讨论

大豆是影响世界的中国起源作物。野生大豆作为栽培大豆的原始祖先种，不仅具有丰富的遗传多样性，而且具有荚多、粒多、耐荫、耐涝、耐高温、耐干旱、耐盐碱以及抗病虫等多种优良特性^［

30-32］。另外，野生大豆与栽培大豆之间没有种间隔离，能够杂交结实。因此，研究野生大豆和栽培大豆遗传差异，对栽培大豆遗传改良具有重要意义。几丁质酶基因在植物生长发育以及抵御外界逆境胁迫中发挥重要作用，但其在大豆生长发育以及抗病耐逆等过程中的作用尚不明确。鉴于此，本研究分别利用最新公布的野生大豆W05（W05a1）高质量基因组和栽培大豆Williams 82（Wm82a4v1）高质量基因组鉴定几丁质酶基因，对其基因数量、染色体分布、共线性以及启动子调控元件进行分析，同时对其在大豆不同组织部位以及抵御花叶病毒和低磷逆境中的表达模式进行分析，为几丁质酶基因进一步育种应用奠定基础。

为验证结果可靠性，本研究查找了目前仅有的几篇有关大豆几丁质酶功能基因的报道，结果发现，与前人结果存在较好的一致性，例如Zhao等^［

33］克隆GmChi1启动子，连接GUS基因转化烟草发现，转基因烟草四叶期根系GUS染色最深，推测GmChi1在根系表达量较高。本研究通过比对GmChi1序列发现，其对应Williams 82的Gm.02G042500，且基因编码蛋白（320个氨基酸）、所属类群（类群Ⅰ）等均与前人报道一致^{［参考文献 33

百度学术}33］；并且，本研究分析Gm.02G042500不同组织部位表达发现，其在大豆根系中的表达量最高，其次是花和荚，且启动子序列中含有水杨酸、脱落酸和茉莉酸等响应元件，这些与前人报道关于该基因的组织部位表达以及受上述激素影响的结果一致^{［参考文献 33-34}33-34］。另外，有学者发现，大豆几丁质酶基因class Ⅲ启动子含有种子和花的组织特异表达元件，实时荧光定量PCR证实该基因在种子和花中的表达活性远高于其他组织部位^{［参考文献 35

百度学术}35］；本研究通过比对class Ⅲ序列发现，其对应Williams 82的Gm.20G164700，且编码蛋白（333个氨基酸）、所属类群（GH18）等与前人结果一致，分析其不同组织部位表达发现，在种子中的表达量最高，与前人报道一致，证实了本研究结果的可靠性^{［参考文献 35

百度学术}35］。

通过比较野生大豆与栽培大豆的几丁质酶基因数量及其染色体分布发现，在野生大豆驯化过程中可能发生了几丁质酶家族成员的丢失和染色体间的易位，从而导致栽培大豆的几丁质酶基因数量变少且染色体分布与野生大豆不同。有学者认为，在物种驯化过程中是否存在选择压力，可通过比较异义替换（Ka）与同义替换（Ks）的比值来判断，若比值大于1则认为存在正选择，若比值等于1则认为存在中性选择，而比值小于1则认为属于纯化选择^［

36］。本研究参照这一理论，通过分析几丁质酶基因的Ka/Ks比值发现，野生大豆的2对几丁质酶基因与栽培大豆的19对几丁质酶基因经历了纯化选择，即这些基因在进化过程中由于自然选择而清除了有害突变，但蛋白序列保持不变。

启动子顺式作用元件对基因转录表达及功能发挥具有重要意义。本研究通过分析大豆几丁质酶基因家族成员启动子序列发现，含多种顺式作用元件，如光响应元件，脱落酸、赤霉素、水杨酸和生长素等应答元件以及籽粒生长发育和干旱胁迫响应等元件，意味着该类基因可能通过参与不同的信号通路进而发挥其功能。本研究鉴定到有些几丁质酶基因启动子含有赤霉素响应元件，而赤霉素可调节植物果荚长度^［

37］，推测这些基因可能通过赤霉素途径影响豆荚生长发育。并且，本研究在栽培大豆几丁质酶基因启动子中还鉴定到能够响应类黄酮的调控元件，而该元件在野生大豆几丁质酶基因启动子中并未被鉴定到，预示其可能与野生大豆驯化有关。类黄酮是植物体内一类非常重要的次生代谢产物，对调节植物生长发育，提高其在逆境环境下的生存能力具有重要意义，并且与豆科植物的花色、种皮色以及根瘤固氮密切相关^{［参考文献 38-41}38-41］。有学者发现，类黄酮化合物可诱导豆科植物根瘤菌结瘤因子的形成，进而介导根瘤菌入侵以及根瘤发育^{［参考文献 42-43}42-43］。因而本研究推测，含有类黄酮响应元件的栽培大豆几丁质酶基因可能与上述功能有关。

目前，有关几丁质酶参与植物抗病虫、耐逆等方面的研究已有报道。左豫虎等^［

44］发现，当大豆感染疫霉根腐病时，抗病品种的几丁质酶活性显著高于感病品种。Su等^{［参考文献 45

百度学术}45］发现，几丁质酶与甘蔗的抗黑穗病能力有关，其抗病品种的几丁质酶基因受黑穗病菌侵染诱导表达。有学者还发现，几丁质酶具有降解豆科植物部分结瘤因子从而抑制根瘤过量生长的作用^{［参考文献 46

百度学术}46］。本研究通过分析接种花叶病毒的栽培大豆抗病品种叶片几丁质酶基因表达量，筛选出4个强烈诱导表达基因，且有的基因（如Gm.01G142400）在接种花叶病毒的多个时间诱导表达，说明其在抗花叶病毒侵染过程中发挥功能。同时，本研究分析低磷处理的栽培大豆磷高效品种根系与根瘤几丁质酶基因表达量，筛选出5个在根系中和12个在根瘤中诱导表达的基因，且有的基因（如Gm.03G254300）在根系低磷处理的多个时间诱导表达，说明其在大豆抵御低磷逆境环境中发挥重要功能。

另外，有研究发现，大豆果荚腹缝线开裂区的细胞纤维素、木质素含量增多可使其抗裂荚能力明显提高^［

47］。Sanchez-Rodriguez等^{［参考文献 48

百度学术}48］发现，拟南芥几丁质酶基因CTL1发生突变，导致其纤维素合酶基因CESAs表达活性下降，纤维素含量降低，且纤维素和木葡聚糖结构发生改变。Wu等^{［参考文献 15

百度学术}15］发现，水稻几丁质酶基因OsCTL1发生突变，可导致其纤维素含量和机械强度降低。本研究分析大豆抗裂荚转录组数据发现，几丁质酶基因Gm.01G142400在抗裂荚品种中的表达量较高，推测其可能与大豆抗裂荚特性有关。

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