大豆雄蕊优势表达基因<bold>GmARFA1a</bold>通过调控花粉萌发影响结实率

姚士恩; 王一帆; 王宁; 周铭辉; 陈一飞; 张曼婷; 李嘉欣; 宫雯珺; 方小龙; 李美娜; YAO Shien; WANG Yifan; WANG Ning; ZHOU Minghui; CHEN Yifei; ZHANG Manting; LI Jiaxin; GONG Wenjun; FANG Xiaolong; LI Meina

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大豆雄蕊优势表达基因GmARFA1a通过调控花粉萌发影响结实率 PDF

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姚士恩
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王一帆
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王宁
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周铭辉
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陈一飞
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张曼婷
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李嘉欣
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宫雯珺
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方小龙
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李美娜
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广州大学生命科学学院/广东省植物适应性与分子设计重点实验室/分子遗传与进化创新研究中心，广州 510006

最近更新：2024-06-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231130003

目录contents

摘要

大豆（Glycine max （L.） Merr.）是自花授粉作物，通过人工去雄的办法生产杂交种，不仅繁琐且成本高。雄性不育基因功能的研究是大豆杂种优势利用的前提之一，大豆雄性不育位点报道较少，定位及功能研究进展缓慢。随着大豆转基因体系的成熟及生物技术的发展，利用反向遗传学研究大豆雄性不育基因的功能变得相对容易。本研究通过转录组数据分析发现大豆中编码小G蛋白的GmARFA1a受到大豆雄性育性控制基因MS1（Male Sterile 1）和MS2的调控，公共数据库数据表明GmARFA1a在大豆未开放的花中表达量最高，而qRT-PCR数据进一步明确GmARFA1a在大豆授粉前雄蕊中优势表达。花粉萌发实验及结实率统计发现Gmarfa1a突变体花粉活力下降导致结实率受到明显抑制。本研究对GmARFA1a基因功能进行了初步解析，明确其对大豆雄性育性存在一定影响。研究结果不仅丰富了对GmARFA1a乃至ARF基因家族成员功能的认识，也为后续深入研究大豆GmARFA1a功能及大豆杂种优势利用奠定了基础。

关键词

大豆; 杂种优势; 雄性不育基因; 基因编辑技术; 花粉活力

大豆含有丰富的蛋白质和油脂，是重要的粮油兼用作物。大豆不仅是人体获取优质蛋白的重要来源，还是动物饲用蛋白的主要成分^［

1-2］。随着经济的发展、居民饮食结构的改变，我国大豆消费需求显著增加。此外，我国耕作面积有限，加之近年来大豆单产增加缓慢，致使我国大豆生产总量增加幅度较低。生产量与消费需求间的差值逐年扩大，进一步加剧了大豆的供需矛盾。我国大豆以常规育种为主，制种技术及单产水平与美国、巴西和阿根廷等国家相比明显落后^{［参考文献 1

百度学术}1］。目前，我国大豆产量仅占世界总产量的5%^{［参考文献 3

百度学术}3］，占国内消费需求总量比重不足20%，其余部分严重依赖进口。因此，提高我国大豆单产水平、增加大豆自给率就显得尤为重要。

杂种优势是指两个亲缘关系相近的物种杂交后，所产生的子代在生长势、抗逆性、适应能力和产量等方面优于亲代的现象^［

4-7］。近年来，在全球农作物生产中，对杂种优势的利用取得了巨大经济效益，特别是玉米（Zea mays L.）、水稻（Oryza sativa L.）等作物，它们50%以上的产量都由杂交品种贡献^{［参考文献 6

百度学术}6］。大豆同样存在杂种优势，其增产幅度可达20%^{［参考文献 6

百度学术}6］。我国大豆杂交育种工作处于世界先进水平，国内育种家已利用“三系法”育成42个大豆杂交种。然而“三系法”育种存在雄性不育性稳定性差和恢复系资源短缺的问题，此外大豆种子繁殖系数低，这进一步限制了大豆杂交种在生产上的大规模推广。新发展的第三代智能杂交育种技术能够克服上述缺点，给推广大豆杂交种带来了希望。智能杂交育种技术的基本原理是将花粉育性恢复基因、花粉失活（败育）基因和荧光标记基因作为紧密连锁的元件导入核雄性不育突变体中，构建含有智能筛选元件SPT（Seed production technology）的保持系，该技术实现了利用转基因手段生产非转基因种子的目的，可以用于大规模的杂交种生产^{［参考文献 7

百度学术}7］。

智能杂交育种以稳定核雄性不育基因为基础。目前，在大豆中共鉴定到12个雄性不育位点（ms1、ms2、ms3、ms4、ms5、ms6、ms7、ms8、ms9、msMOS、msp和ms_NJ），它们分布在7条不同的染色体上^［

8］。除ms3、ms8和ms9属于光周期/温度敏感型雄性不育位点外，其余9个都是稳定的雄性不育位点。目前ms1、ms2、ms3、ms4和ms6已被成功克隆^{［参考文献 9-15}9-15］。其中，Thu等^{［参考文献 13

百度学术}13］成功克隆到ms4，该基因编码1个具Plant Homeodomain （PHD）-finger结构域的转录因子；ms4与拟南芥中同源基因MMD1（MALE MEIOCYTE DEATH 1）突变后产生的表型一致，表现为四分体退化，花粉败育。2021年，Fang等^{［参考文献 9

百度学术}9］通过图位克隆成功克隆大豆MS1基因，发现MS1编码一种含马达结构域的驱动蛋白，在减数分裂之后的胞质分裂阶段发挥作用，影响细胞板形成，导致突变体小孢子无法正常分裂。同年，Yu等^{［参考文献 14

百度学术}14］克隆到在大豆花药中高表达的MS6基因，MS6编码1个MYB转录因子，转基因实验结果显示大豆MS6可以恢复拟南芥attdf1突变体不育表型，表明MS6与拟南芥TDF1之间在调控雄性方面功能保守。Hou等^{［参考文献 12

百度学术}12］在2022年成功克隆MS3，该基因同样编码1个包含PHD-finger结构域的核定位蛋白，可以影响碳水化合物代谢相关基因的表达；突变体ms3在短日照条件下表现为不育，但是在长日照条件下其育性可以得到恢复。2023年，Fang等^{［参考文献 15

百度学术}15］又成功对大豆MS2进行了克隆，该基因编码在花药中特异表达的bHLH转录因子，MS2在绒毡层和小孢子中发挥作用，直接调控参与次生代谢产物的生物合成和脂质代谢，最终影响小孢子细胞壁形成。通过对同一遗传背景下的ms1和ms6突变体进行田间实验比较，发现ms2突变体的异交率最高^{［参考文献 15

百度学术}15］。

ARF（ADP-ribosylation factor）属于小G蛋白超家族的亚家族成员^［

16］，是二磷酸腺苷核糖基化因子，具有激活霍乱毒素A亚基（CTA， cholera toxin subunit A）ADP核糖基转移酶活性的能力^{［参考文献 17-18}17-18］，在调控植物的雄性育性方面发挥重要作用。2021年，Zhu等^{［参考文献 19

百度学术}19］在拟南芥基因组中鉴定了6个ARFA1s基因，这些基因均在发育的花药中表达，其中，ARFA1b在小孢子和绒毡层发育过程中表现出优势表达，通过负显性突变（DN，dominant negative）手段干扰AtARFA1s功能导致绒毡层功能障碍及花粉败育。Liang等^{［参考文献 20

百度学术}20］的研究表明，在拟南芥中存在3个SAR1蛋白，通过CRISPR/Cas9手段创制SAR1b功能缺失突变体，绒毡层细胞程序性死亡延迟，最终导致植株雄性不育。然而，SAR1c的引入能够回补该突变体表型，说明在雄配子体发育过程中SAR1b和SAR1c功能存在冗余。Kobayashi-Uehara等^{［参考文献 21

百度学术}21］发现，小麦中的ARF1主要在花和根中表达。另外，侯磊等^{［参考文献 22

百度学术}22］在棉花中分离得到的GhARF1主要在根、花冠和纤维中表达，而在胚珠、子叶和真叶中表达较弱，推测其可能参与花粉发育过程。

大豆是自花授粉作物，通过人工去雄的方法生产杂交种，不仅繁琐且成本高。以雄性不育系为母本，通过虫媒传粉，进行大规模制种可有效解决大豆杂交种生产的难题。因此，大豆雄性不育系是重要的作物育种材料，而ARF家族在控制植物雄性育性中具有重要作用。为鉴定大豆调控雄性育性的ARF基因，本研究首先利用实验室前期的转录组数据，筛选到受MS1和MS2共同影响的GmARFA1a基因；进一步结合基因表达数据和敲除突变体的表型，明确了GmARFA1a调控大豆雄性育性的功能，这为丰富大豆雄性不育分子机制和开发稳定的雄性不育系统提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料与试剂

大豆材料Williams 82（W82）由广州大学分子遗传与进化创新研究中心提供，大豆CRISPR和Cas9敲除得到的突变体Gmarfa1a、自然突变产生的大豆雄性不育突变体ms1和ms2及野生型MS1和MS2均由本实验室提供，以上材料均种植于广州市（2023年7月至9月）。本研究所用的DH5α大肠杆菌感受态细胞、EHA105农杆菌感受态细胞均由本实验室制备并保存。用于基因敲除的pYLCRISPR/Cas9、AtU3d、AtU3b、AtU6-1、AtU6-29 gRNA均由华南农业大学刘耀光教授惠赠。本研究所用DNA提取试剂盒Nuclean Plant Genomic DNA Kit、RNA提取试剂盒MLtrapure RNA Kit购买于康为世纪生物科技有限公司；胶回收试剂盒Easy Pure^® Quick Gel Extraction Kit、质粒提取试剂盒以及PCR鉴定使用的2×Taq mix购买于北京全式金生物技术有限公司；反转录试剂盒Easy Pure^® Plasmid Mini Prep Kit购买于TaKaRa公司；用于扩增高质量DNA片段的2×Phanta Max Master Mix（Dye Plus）购买于诺唯赞；用于酶切的BsaI-HFv2及T4 DNA ligase购买于NEB公司；用于荧光定量PCR的SYBR Green I Master购买于Roche公司。本研究所有引物（除带接头的靶点引物）均通过NCBI网站设计，由广州天一辉远公司合成。

1.2 材料种植

在广州市从化区田间种植突变体Gmarfa1a及野生型W82各30株，每行种植10棵材料，共6行，突变体与野生型相邻而种，行距及株距均为10 cm左右。每两周人工除草一次，每两周打一次除虫农药。

1.3 大豆、拟南芥ARFA1氨基酸序列比对

在Phytozome（https：//phytozome-next.jgi.doe.gov/）网站下载王一帆等^［

16］报道的15条大豆ARFA1蛋白序列及6条拟南芥ARFA1蛋白序列，利用DNAMAN软件进行氨基酸序列比对分析。

1.4 GmARFA1a在大豆中的表达模式

1.4.1 表达模式分析

利用Phytozome（https：//phytozome- next.jgi.doe.gov/）公共数据库中Keyword search功能，选择大豆基因组，输入GmARFA1a基因号查找，下载其在大豆各组织中的FPKM值，并进行去重求均值等数据处理，结合实验室的雄性不育突变体ms1及其野生型MS1转录组数据，使用TBtools的Heatmap功能进行热图绘制，使用WPS软件中的Excel绘制柱状图。

1.4.2 荧光定量PCR（qRT-PCR）

本实验室按照花苞发育情况将大豆花苞分为3个时期，其长度及花瓣露白（开放）程度为主要的分类标准，花苞长度小于3 mm未露白（未出现花瓣）的为早期花苞，3至5 mm露白（已出现花瓣但未开放）的为将授粉花苞，大于5 mm已开放的为已授粉花苞，取大豆3个时期（早期、将授粉阶段及授粉后阶段）花器官（花萼、花瓣、雄蕊及雌蕊）和成熟叶片，用液氮研磨至粉末状，参照RNA提取试剂盒MLtrapure RNA Kit说明书提取RNA。取质检合格的RNA，参照反转录试剂盒RrimeScript^TMRT reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）说明书进行反转录。 qRT-PCR的具体步骤参照SYBR Green I Master Mix说明书，反应体系：SYBR Green I Master Mix 5 μL，cDNA 1 μL，q-ARFA1-F/R（10 μmol/L）各0.3 μL，ddH₂0（RNA free）补足10 μL，内参基因为F-box-F/R（10 μmol/L）（表1）；反应程序：95℃ 5min； 95℃ 10 s，60℃ 10 s，72℃ 10s，35个循环。qRT-PCR结果采用2^-ΔΔCt值进行计算，每个样品进行3次生物学重复。

表1 本研究所用扩增引物

Table 1 Primers used in this study

引物名称 Primer name	引物序列（5′-3′） Primer sequence （5′-3′）
Cas9-F	CAACACCGACCGCCACTC
Cas9-R	TGCCGCTCTGCTTATCCC
SP1	CCCGACATAGATGCAATAACTTC
SP3	GTCGTGCTCCACATGTTGACCGG
BDJC-ARF-T12-F	ACTTAAGAGAGGATTGTTTGATGC
BDJC-ARF-T12-R	GGCCGTGTACTGGACTTGAT
BDJC-ARF-T34-F	CTCCCACCTTAGCTGGTGTT
BDJC-ARF-T34-R	CATCATGATCTTGCAAGAAG
q-ARFA1-F	AGGATGCTGAATGAGGACGAA
q-ARFA1-R	GCTGGCGCAGAGAGTTTAGG
F-box-F	ATGGTCGCCGTTTAGAACAC
F-box-R	GGGATAACCAGTGCAGAAGC

1.5 Gmarfa1a转基因植株创制

1.5.1 筛选靶点和设计引物

利用靶点预测网站MMEJ-KO（http：//skl.scau.edu.cn/mmejko/）对GmARFA1a基因进行预测，选取4个编辑效率高的特异性靶点，并分别命名为ARFA1-T1/T2/T3/T4。同时利用该网站的引物设计功能设计4对引物，分别带有启动子接头AtU3d（gtca）、AtU3b（gtca）、AtU6-1（attg）和AtU6-29（attg）（表2）。

表2 GmARFA1a基因编辑靶点及引物序列

Table 2 Primers and sequences of gene editing targets of GmARFA1a

名称 Name	靶点序列（5′-3′） Target sequence （5′-3′）	正向引物（5′-3′） Forward primer （5′-3′）	反向引物（5′-3′） Reverse primer （5′-3′）
ARFA1-T1	GGTACAGCCCAAATAGGTGG	gtcaCCACCTATTTGGGATGTACC	AAACGGTACAGCCCAAATAGGTGG
ARFA1-T2	CTCACACTTATTTCCGATTT	gtcACTCACACTTATTTCCGATTT	AAACAAATCGGAAATAAGTGTGAG
ARFA1-T3	GCACAAGAAACCAACCCTCC	attgGGAGGGTTGGTTTCTTGTGC	AAACGCACAAGAAACCAACCCTCC
ARFA1-T4	CAGATAATGGGGTTGTCCTT	attgCAGATAATGGGGTTGTCCTT	AAACAAGGACAACCCCATTATCTG

1.5.2 CRISPR/Cas9载体的构建

载体构建过程参考Ma等^［

23］和曾栋昌等^{［参考文献 24

百度学术}24］的方法，得到连接产物Cas9-ARFA1。

1.5.3 转化、筛选阳性菌

将1.5.2中连接产物Cas9-ARFA1转化至DH5α大肠杆菌感受态细胞，具体转化步骤参考DH5α大肠杆菌感受态细胞使用说明书。使用2×Taq mix及引物Cas9F/R（表1）进行菌落PCR及琼脂糖凝胶电泳鉴定，PCR程序的设定参照2×Taq mix使用说明书。选取阳性菌落进行测序。选取测序验证构建成功的菌落，在液态培养基进行扩繁并提取质粒，提取质粒的具体步骤参照质粒提取试剂盒说明书。然后将质粒转化至EHA105农杆菌感受态细胞，具体转化步骤参照EHA105农杆菌使用说明书。2 d后进行菌落PCR鉴定，将阳性单克隆菌落保存于-80℃冰箱内。

1.5.4 转基因植株培养及鉴定

参考杨静等^［

25］所用的大豆子叶节农杆菌转化方法进行大豆转化，将获得的转化植株置于室内25℃的冷光灯下单株培养至收种。每株转化植株取3个不同部位叶片各100 mg，用组织研磨仪充分研磨至粉末状。使用DNA提取试剂盒提取DNA，具体步骤参照DNA提取试剂盒Nuclean Plant Genomic DNA Kit说明书。利用2×Taq mix及SP1/SP3骨架鉴定引物（表2）进行骨架PCR鉴定，若出现目的条带说明转化成功，获得了阳性苗。在此基础上，利用2×Phanta Max Master Mix （Dye Plus）及靶点检测引物BDJC-ARF-T-F/R（表1）对不同靶点进行扩增及测序分析，鉴定GmARFA1a基因靶点突变情况。最后筛选纯合突变体植株并进行种子的收获。

1.6 Gmarfa1a转基因植株花粉活力鉴定

1.6.1 Gmarfa1a转基因植株花粉I₂-KI染色

参照郭凤兰等^［

26］和贾顺耕等^{［参考文献 27

百度学术}27］方法，分别从10株W82、Gmarfa1a-1及Gmarfa1a-2转基因植株中，选择盛花期的成熟花苞，用75%酒精浸泡2 h后，在体式显微镜下使用镊子将花药剥离，然后将其放置于载玻片上。在花粉粒上滴加7% I₂-KI染液100 μL，在染液中将花药夹破，确保花粉充分释放。随后，盖上盖玻片，放置于荧光显微镜（白光条件）下，使用10倍光学显微镜观察并拍照记录。

1.6.2 Gmarfa1a转基因植株花粉萌发实验

在上午10点左右，从W82、Gmarfa1a-1及Gmarfa1a-2的转基因植株各3株中取5朵当天开放的花。去除外围花瓣后，将花粉粒轻轻涂布在萌发培养基（配方：CaCl₂：0.55 g/L，KCl：0.373 g/L，H₃BO₃：10 mg/L，Sucrose：100 g/L，Agarose：15 g/L）。室温放置1 h后，使用荧光显微镜（白光条件）观察并拍照记录。

1.7 Gmarfa1a转基因植株结荚及鼓粒情况分析

对于W82、Gmarfa1a-1及Gmarfa1a-2转基因突变体植株，分别选择20个单株进行荚数及结实粒数的统计，计算结实率（结实率=实际单株种子粒数/理论单株种子粒数）。最后通过GraphPad Prism软件绘制柱状图，并对数据进行单因素方差统计性分析。

2 结果与分析

2.1 大豆ARFA1基因家族氨基酸序列特征分析

为分析大豆ARFA1的结构特征，本研究对15条大豆ARFA1蛋白序列及6条拟南芥ARFA1蛋白序列进行比对分析。结果显示，15个大豆ARFA1的结构与其在拟南芥中同源基因结构域基本一致，均具有1个位于N端的肉豆蔻酰化位点（The myristoylation site），该位点可使其在N端形成亲和螺旋结构（图1）。此外，还有4个从N端到C端依次命名为Ⅰ~Ⅳ的鸟苷酸（GTP/GDP）结合结构域（GTP-binding domains）、2个与GEF（Guanine nucleotide exchange factors）互作的转换区（Switch Ⅰ and Switch Ⅱ）以及1个与GAP（GTPase-activating proteins）互作的结构域（GAP interaction domain）（图1）。

图1 大豆及拟南芥ARFA1基因家族氨基酸序列比对

Fig.1 Amino acid sequence alignment of the ARFA1 gene family in soybean and Arabidopsis

为初步鉴定可能调控大豆雄性育性的ARFA1基因，本研究利用实验室的转录组数据，对15个大豆GmARFA1s基因的表达数据进行分析。在这15个基因中，只有Glyma.09G030900基因的表达量在大豆雄性不育突变体ms1和ms2花药中显著下调（图2），推测其可能在MS1或MS2基因的下游发挥作用，控制花药发育进而影响育性。为此，本研究将该基因作为调控大豆雄性育性的候选基因，因其与拟南芥ARFA1基因同源，于是将其命名为GmARFA1a。

图2 GmARFA1a及同源基因在MS1和ms1、MS2和ms2花药中的表达分析

Fig.2 Expression patterns of GmARFA1a and its homologs in anthers of MS1 and ms1， MS2 and ms2

A 和B分别为GmARFA1a及同源基因在大豆MS1和ms1、MS2和ms2花药（Anther， An）中的表达热图；C和D分别为GmARFA1a在大豆MS1和ms1、MS2和ms2花药中的表达差异分析； An1、An2和An3表示花药的3个生物学重复；柱形图中纵坐标为3次重复的平均值±标准差，**代表两组数据具有极显著性差异（P<0.01）

A and B： Expression heat map of GmARFA1a and homologs in anthers of soybean MS1 and ms1， MS2 and ms2； C and D： Expression analysis of GmARFA1a in anther of soybean MS1 and ms1，MS2 and ms2； An1， An2 and An3 represent three biological replicates of anthers； The ordinate in the histogram is the average of three replicates±standard deviation； ** represents a very significant difference between the two sets of data （P<0.01）

为解析GmARFA1a基因功能，本研究首先利用Phytozome公共数据库中的大豆表达图谱对GmARFA1a基因表达模式进行分析。结果显示，GmARFA1a基因在大豆未开放的花中表达量最高（图3A）。为进一步明确GmARFA1a基因发挥功能的时期，本研究将大豆W82品种早期、授粉前和授粉后的花苞从外到里分为花萼、花瓣、雄蕊、雌蕊4个部分，同时取叶片作为营养生长器官的对照，进行基因表达模式分析。结果显示，GmARFA1a在授粉前的雄蕊中表达量最高（图3B）。以上结果表明GmARFA1a基因在授粉前的雄蕊中优势表达。

图3 GmARFA1a在大豆中的表达模式

Fig. 3 Expression patterns of GmARFA1a in Soybean

A： GmARFA1a在大豆W82花、叶片等组织中的表达模式；B： qRT-PCR 分析GmARFA1a在大豆W82花萼、花瓣等花器官中的时空表达模式

A： Expression pattern of GmARFA1a in tissues of soybean W82， like flowers and leaves et al； B： qRT-PCR analysis of spatiotemporal expression patterns of GmARFA1a in floral organs of soybean W82， like sepal and petal et al

2.3 CRISPR/Cas9基因编辑技术创制Gmarfa1a突变体

为探究GmARFA1a是否调控大豆雄性育性，根据其基因序列设计4个独立靶点，并构建CRISPR/Cas9基因敲除载体Cas9-ARFA1（图4）。将该载体转入大豆栽培品种W82中，并成功获得8株T₀代转基因阳性苗。靶点检测结果显示，T3靶点编辑效率相对较高，而其他3个靶点没有发生编辑。进一步对编号为#3和#7的2株T₀代材料的T3靶点进行筛选，在T₂代获得了分别缺失1 bp和4 bp的纯合突变体，这两种突变形式导致目标基因GmARFA1a在翻译时分别终止于第40和第39位氨基酸残基处。随后，本研究在T₃代对这两种编辑形式进行确认，并将这两种突变体分别命名为Gmarfa1a-1和Gmarfa1a-2。

图4 大豆GmARFA1a基因结构及CRISPR/Cas9基因编辑突变体示意图

Fig. 4 Diagram of soybean GmARFA1a genomic sequence and the target base editing in the CRISPR/Cas9 mutants of soybean

T1、T2、T3和T4表示靶点位置，TGG代表嵌合序列邻近基序（PAM），确保CRISPR识别系统的特异性和准确性

T1， T2， T3 and T4 indicate the target locations， TGG represents the protospacer adjacent motif， ensuring the specificity and accuracy of the CRISPR recognition system

2.4 Gmarfa1a突变体表型观察

突变体Gmarfa1a-1和Gmarfa1a-2与野生型相比，在营养生长阶段没有发现明显差异。在生殖生长阶段，通过I₂-KI染色法^［

26-27］对花粉活力进行初步观察，发现突变体与野生型在花粉数量及淀粉填充方面无明显差异（图5A上）。然而，对花粉萌发的进一步分析显示，Gmarfa1a两种突变体花粉萌发率明显低于野生型W82（图5A下），两个突变体的花粉萌发率均不足50%，而野生型花粉萌发率超过80%（图5B）。初步推断可能是突变体花粉壁物质存在缺失，导致花粉萌发较差。

图5 Gmarfa1a突变体花粉萌发率下降

Fig.5 The gemination rate of pollen grains was decreased in Gmarfa1a mutants

A：大豆W82与Gmarfa1a花粉I₂-KI染色及花粉萌发分析（标尺为200 μm）；B： W82与Gmarfa1a花粉萌发率统计，a， b字母代表两组数据具有显著性差异（P<0.05），下同

A： The pollen I₂-KI staining and the pollen germination analysis of W82 and Gmarfa1a （bar=200 μm）； B： The statistical analysis of W82 and Gmarfa1a pollen germination rate； The letters a and b represent a significant difference between the two sets of data （P <0.05），the same as below

对成熟豆荚数量进行统计分析，按照豆荚内种子的理论数量将其分为一粒荚、二粒荚、三粒荚和四粒荚四种不同类型，发现突变体中未能正常发育或灌浆的种子数目比例增加（图6A），导致Gmarfa1a结实率显著降低（图6B），但单株总荚数与野生型相比无显著性差异（图6C），结合花粉萌发实验结果判断可能是由于花粉活力下降导致。

图6 大豆Gmarfa1a突变体结实率下降

Fig.6 Seed setting rate decreased in soybean Gmarfa1a mutants

A：大豆Gmarfa1a突变体中未正常发育或灌浆种荚展示，白色箭头指示发育缺陷种子位置，比例尺为50 mm

A： The picture shows the abnormally developed or grain-filled pods of soybean Gmarfa1a mutants， and the white arrows indicates the location of the abnormally developed seeds，bar=50 mm

3 讨论

对于大豆这类自花授粉作物，无法通过人工去除母本花粉进行大规模杂交制种，因此，利用雄性不育系作为母本制备杂交种的技术体系成为雌雄同花作物杂种优势利用的有效途径。目前，在大豆中利用“三系法”虽已育成42个审定杂交品种^［

6］，但是受“三系法”固有缺点以及大豆种子繁殖系数低的限制，导致至今在大豆杂交种的规模化推广种植方面仍未取得显著突破。随着第三代智能杂交育种系统的发展成熟，有望突破这一难题。智能杂交育种方法基于核雄性不育基因的功能研究，然而，目前通过正向遗传学的方法来鉴定雄性不育基因速度较慢。

近年来，随着基因编辑技术的发展，使得越来越多的基因功能得以证实。其中，CRISPR/Cas9技术由于其操作简便性、基因编辑效率高以及周期短等优点，而被广泛用于作物育种。在水稻中，利用CRISPR/Cas9技术已获得了直链淀粉含量低或籽粒大的新种质，并成功解决了穗发芽的难题^［

28-30］。在大豆中，相关技术已被用于不育基因的功能鉴定和不育突变体的创制。例如，Fang等^{［参考文献 9

百度学术}9］、Nadeem等^{［参考文献 10

百度学术}10］和Jiang等^{［参考文献 11

百度学术}11］均使用CRISPR/Cas9技术成功创制大豆MS1敲除材料，验证了MS1基因在调控雄性育性方面的功能。此外，张万年等^{［参考文献 31

百度学术}31］和Hou等^{［参考文献 12

百度学术}12］同样使用该技术分别获得了MS6和MS3基因的功能缺失突变体，并进一步验证了相关基因在调控雄配子形成过程中的作用。而本研究同样从反向遗传学角度出发，使用CRISPR/Cas9技术创制了Gmarfa1a的敲除突变体，以此来研究该基因功能是否与雄性育性相关。

进化分析是研究基因家族和同源序列的重要方法，如鉴定菜豆ANK和小麦ARF基因家族成员^［

32-33］。为了鉴定调控大豆雄性育性的ARFA1基因，前期相关研究分析了大豆ARF基因家族，共鉴定到44个成员，其中ARFA1亚家族成员有15个^{［参考文献 16

百度学术}16］。本研究氨基酸序列比对分析结果表明，这些成员都具有ARFA1亚家族保守的结构域（图1）。植物中小G蛋白依赖分泌途径介导的绒毡层与小孢子之间的蛋白质分选位于MS1和MS2基因功能作用的下游^{［参考文献 9

百度学术}9， 15， 34-35］。转录组数据分析表明，GmARFA1a（Glyma.09G030900）位于大豆雄性育性调控基因MS1和MS2的下游（图2），这表明其可能在MS1或MS2基因的下游发挥作用，控制花药发育进而影响育性。表达模式分析显示，该基因在授粉前的雄蕊中优势表达（图3）。这些结果表明GmARFA1a可能在授粉前通过调控雄蕊（花粉）发育过程调控大豆的雄性育性。I₂-KI染色结果表明Gmarfa1a突变体花粉与对照并无明显差异，同样能正常填充淀粉粒。相反，体外萌发实验结果显示，突变体的花粉萌发受到了显著抑制（图5）。这些结果表明GmARFA1a影响淀粉填充后花粉的发育过程，在雄配子发育早期阶段，绒毡层分泌营养物质和酶，对雄配子（即小孢子）的发育至关重要。在发育后期，绒毡层启动程序性细胞死亡（PCD，programmed cell death），为发育中的小孢子提供营养物质和信号^{［参考文献 36

百度学术}36］。绒毡层与小孢子之间的蛋白质分选是依赖分泌途径完成的复杂运输过程，小G蛋白在此过程中发挥重要作用^{［参考文献 34-35}34-35］。因此，推测作为小G蛋白家族成员的GmARFA1a基因可能在PCD阶段调控小孢子细胞壁关键物质的填充，从而影响花粉萌发。此外，由于突变体较低的花粉萌发率，影响了双受精过程，导致突变体结实率降低（图6）。2005年，Gebbie等^{［参考文献 37

百度学术}37］在拟南芥中鉴定到6个ARFA1基因，它们在花药发育过程中表达，且共同参与花的结构发育，并调控育性。大豆中的GmARFA1a经过本研究验证同样调控育性，这说明ARFA1基因功能可能较为保守。

大豆是由古四倍体演变而来的二倍体自交作物，其中有75%的基因以同源基因的形式存在。拟南芥中有6个ARFA1基因，而大豆中有15个ARFA1基因。在拟南芥的研究中，突变单个ARFA1基因并不会对植物的营养生长或生殖生长造成影响，但通过ARFA1b负显性抑制6个基因表达将导致植物不育^［

19］。本研究发现，单独突变GmARFA1a基因显著抑制了大豆的结实率。这些结果表明，大豆和拟南芥ARFA1基因在调控植物雄性育性方面可能发生了功能分化。然而，关于大豆中的ARFA1同源基因是发生了分化或者冗余，仍需待进一步研究。因此，在后续工作中，可以在大豆中敲除更多的ARFA1基因，以研究这些基因在功能上是否出现了分化或者冗余。GmARFA1a基因突变后没有出现完全雄性不育，导致其并不能直接应用于杂交制种。如果ARFA1同源基因间存在功能冗余，还可进一步获得多个GmARFA1基因功能缺失的完全不育突变体，并结合异交结实率指标评价其在杂种优势利用中的价值。此外，还可以构建GmARFA1a基因的大豆过表达株系，以研究其花粉活力是否提高，结实率是否变化，从而进一步验证GmARFA1a基因的功能。

本研究首先对大豆ARFA1氨基酸保守结构域进行了初步分析，同时结合qRT-PCR实验和转录组数据，揭示大豆GmARFA1a基因的表达模式。最后，通过对花粉活力的鉴定以及对大豆结实率等农艺性状的统计学分析，明确了GmARFA1a基因通过调控花粉萌发而影响大豆结实。这为深入研究大豆ARF家族成员基因功能提供了有力参考。本研究从反向遗传学角度，鉴定了候选基因功能，为在大豆中快速鉴定筛选高异交结实率雄性不育突变体，进一步用于大豆智能杂交育种系统提供了前期基础，助力大豆杂种优势加速利用。

参考文献

田志喜，刘宝辉，杨艳萍，李明，姚远，任小波，薛勇彪. 我国大豆分子设计育种成果与展望.中国科学院院刊， 2018， 33 （9）： 915-922 [百度学术]

Tian Z X， Liu B H， Yang Y P， Li M， Yao Y， Ren X B， Xue Y B. Update and perspect of soybean molecular module-based designer breeding in China. Bulletin of Chinese Academy of Sciences， 2018， 33 （9）： 915-922 [百度学术]

Hwang E Y， Song Q J， Jia G F， Specht J E， Hyten D L， Costa J， Cregan P B. A genome-wide association study of seed protein and oil content in soybean. BMC Genomics， 2014， 15 （1）： 1-12 [百度学术]

李顺萍. 世界大豆生产布局及中国大豆对外依存度分析. 世界农业， 2018， 11： 108-112 [百度学术]

Li S P. Analysis of world soybean production layout and foreign dependence of Chinese soybean. World Agriculture， 2018， 11： 108-112 [百度学术]

刘杰，黄学辉. 作物杂种优势研究现状与展望. 中国科学：生命科学， 2021， 51 （10）： 1396-1404 [百度学术]

Liu J， Huang X H. Advances and perspectives in crop heterosis. Scientia Sinica （Vitae）， 2021， 51 （10）： 1396-1404 [百度学术]

Ouyang Y D， Li X， Zhang Q F. Understanding the genetic and molecular constitutions of heterosis for developing hybrid rice. Journal of Genetics and Genomics， 2022， 5： 385-393 [百度学术]

Fang X L， Sun Y Y， Li J H， Li M N， Zhang C B. Male sterility and hybrid breeding in soybean. Molecular Breeding， 2023， 43 （6）： 47 [百度学术]

Wu Y Z， Fox T W， Trimnell M R， Wang L J， Xu R J， Cigan A M， Huffman G A， Garnaat C W， Hershey H， Albertsen M C. Development of a novel recessive genetic male sterility system for hybrid seed production in maize and other cross-pollinating crops. Plant Biotechnology Journal， 2016， 14 （3）： 1046-1054 [百度学术]

Nie Z X， Zhao T Z， Liu M F， Dai J Y， He T T， Lyu D， Zhao J M， Yang S P， Gai J Y. Molecular mapping of a novel male-sterile gene ms_NJin soybean ［Glycine max （L.） Merr.］. Plant Reproduction， 2019， 32 （4）： 371-380 [百度学术]

Fang X L， Sun X Y， Yang X D， Li Q， Lin C J， Xu J， Gong W J， Wang Y F， Liu L， Zhao L M， Liu B H， Qin J， Zhang M C， Zhang C B， Kong F J， Li M N. MS1 is essential for male fertility by regulating the microsporocyte cell plate expansion in soybean. Science China Life Sciences， 2021， 64 （9）： 1533-1545 [百度学术]

Nadeem M， Chen A D， Hong H L， Li D D， Li J J， Zhao D， Wang W， Wang X B， Qiu L J. GmMs1 encodes a kinesin-like protein essential for male fertility in soybean （Glycine max L.）. Journal of Integrative Plant Biology， 2021， 63 （6）： 1054-1064 [百度学术]

Jiang B J， Chen L， Yang C Y， Wu T T， Yuan S， Wu C X， Zhang M C， Gai J Y， Han T F， Hou W S， Sun S. The cloning and CRISPR/Cas9-mediated mutagenesis of a male sterility gene MS1 of soybean. Plant Biotechnology Journal， 2021， 19 （6）： 1098-1100 [百度学术]

Hou J J， Fan W W， Ma R W， Li B， Yuan Z H， Huang W X， Wu Y Y， Hu Q， Lin C J， Zhao X P， Peng B， Zhao L M， Zhang C B， Sun L J. MALE STERILITY 3 encodes a plant homeodomain-finger protein for male fertility in soybean. Journal of Integrative Plant Biology， 2022， 64 （5）： 1076-1086 [百度学术]

Thu S W， Rai K M， Sandhu D， Rajangam A， Balasubramanian V K， Palmer R G， Mendu V. Mutation in a PHD-finger protein MS4 causes male sterility in soybean. BMC Plant Biology， 2019， 19 （1）： 378 [百度学术]

Yu J P， Zhao G L， Li W， Zhang Y， Wang P， Fu A G， Zhao L M， Zhang C B， Xu M. A single nucleotide polymorphism in an R2R3 MYB transcription factor gene triggers the male sterility in soybean ms6 （Ames1）. Theoretical and Applied Genetics， 2021， 134 （11）： 3661-3674 [百度学术]

Fang X L， Feng X C， Sun X Y， Yang X D， Li Q， Yang X L， Xu J， Zhou M H， Lin C J， Sui Y， Zhao L M， Liu B H， Kong F J， Zhang C B， Li M N. Natural variation of MS2 confers male fertility and drives hybrid breeding in soybean. Plant Biotechnology Journal， 2023， 21 （11）： 2322-2332 [百度学术]

王一帆，王韫慧，李金红，蔺佳雨，曹振林，冯湘池，姚士恩，周铭辉，马诗卉，李美娜. 植物ARF家族小G蛋白研究进展及大豆ARF家族初步分析. 植物生理学报， 2022， 58 （12）： 2227-2237 [百度学术]

Wang Y F， Wang Y H， Li J H， Lin J Y， Cao Z L， Feng X C， Yao S E， Zhou M H， Ma S H， Li M N. Research progress of small G-proteins in plant ARF family and preliminary analysis of soybean ARF family. Plant Physiology Journal， 2022， 58 （12）： 2227-2237 [百度学术]

Moss J， Vaughan M. Molecules in the ARF orbit. Journal of Biological Chemistry， 1998， 273 （34）： 21431-21434 [百度学术]

Lee M H， Min M K， Lee Y J， Jin J B， Shin D H， Kim D H， Lee K-H， Hwang I. ADP-Ribosylation Factor 1 of Arabidopsis plays a critical role in intracellular trafficking and maintenance of endoplasmic reticulum morphology in Arabidopsis. Plant Physiology， 2002， 129 （4）： 1507-1520 [百度学术]

Zhu R M， Li M， Li S W， Liang X， Li S， Zhang Y. Arabidopsis ADP-RIBOSYLATION FACTOR-A1s mediate tapetum-controlled pollen development. The Plant Journal， 2021， 108 （1）： 268-280 [百度学术]

Liang X， Li S W， Gong L M， Li S， Zhang Y. COPII components Sar1b and Sar1c play distinct yet interchangeable roles in pollen development. Plant Physiology， 2020， 183 （3）： 974-985 [百度学术]

Kobayashi-Uehara A， Shimosaka E， Handa H. Cloning and expression analyses of cDNA encoding an ADP-ribosylation factor from wheat： Tissue-specific expression of wheat ARF. Plant Science， 2001， 160 （3）： 535-542 [百度学术]

侯磊，李家宝，罗小英，王文锋，肖月华，罗明，裴炎. 棉花ADP-ribosylation factor基因（GhARF1）的克隆与表达分析. 作物学报， 2007， 33 （8）： 1226-1231 [百度学术]

Hou L， Li J B， Luo X Y， Wang W F， Xiao Y H， Luo M， Pei Y. Cloning， expression and characterization of an ADP-ribosylation factor gene from cotton （Gossypium hirsutum L.）. Acta Agronomica Sinica， 2007， 33 （8）：1226-1231 [百度学术]

Ma X L， Zhang Q Y， Zhu Q L， Liu W， Chen Y， Qiu R， Wang B， Yang Z F， Li H E， Lin Y R， Xie Y Y， Shen R X， Chen S F， Wang Z， Chen Y L， Guo J X， Chen L T， Zhao X C， Dong Z C， Liu Y G. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot-plants. Molecular Plant， 2015， 8 （8）： 1274- 1284 [百度学术]

曾栋昌，马兴亮，谢先荣，祝钦泷，刘耀光. 植物CRISPR/ Cas9多基因编辑载构建和突变分析的操作方法. 中国科学：生命科学， 2018， 48 （7）： 783-794 [百度学术]

Zeng D C， Ma X L， Xie X R， Zhu Q L， Liu Y G. A protocol for CRISPR/Cas9-based multi-gene editing and sequence decoding of mutant sites in plants. Scientia Sinica（Vitae）， 2018， 48 （7）： 783-794 [百度学术]

杨静，邢国杰，杜茜，隋丽，郭东全，牛陆，杨向东. 不同大豆基因型对大豆遗传转化效率的影响及外源T-DNA插入分析. 大豆科学， 2016， 35 （4）： 562-567 [百度学术]

Yang J， Xing G J， Du Q， Sui L， Guo D Q， Niu L， Yang X D. Effects of different soybean genotypes on the transformation efficiency of soybean and analysis of the T-DNA insertions in the soybean genome. Soybean Science， 2016， 35 （4）： 562-567 [百度学术]

郭凤兰，林春晶，王鹏年，杨绪磊，吴铮，彭宝，赵丽梅，张春宝. 大豆细胞质雄性不育恢复基因GmRf1的精细定位. 植物遗传资源学报， 2022， 23 （2）： 518-526 [百度学术]

Guo F L， Lin C J， Wang P N， Yang X L， Wu Z， Peng B， Zhao L M， Zhang C B. Fine mapping of a restorer-of-fertility gene GmRf1 for the cytoplasmic male sterility in soybean. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23 （2）： 518-526 [百度学术]

贾顺耕，郭凤兰，林春晶，孙妍妍，张颖，雷蕾，彭宝，赵丽梅，张春宝. 大豆细胞质雄性不育恢复基因Rf3的定位. 植物遗传资源学报， 2021， 22 （5）： 1411-1417 [百度学术]

Jia S G， Guo F L， Lin C J， Sun Y Y， Zhang Y， Lei L， Peng B， Zhao L M， Zhang C B. Mapping of fertility restorer gene Rf3 of cytoplasmic male sterility in soybean. Journal of Plant Genetic Resources， 2021， 22 （5）： 1411-1417 [百度学术]

毛兴学，柳武革，郑晓钰，范芝兰，陈文丰，潘大建，李晨，王丰. CRISPR/Cas9 技术编辑MPK7和MPK14基因创制抗穗发芽水稻新种质. 植物遗传资源学报， 2022， 23 （1）： 281-289 [百度学术]

Mao X X， Liu W G， Zheng X Y， Fan Z L， Chen W F， Pan D J， Li C， Wang F. Generating pre-harvest sprouting resistant germplasms by editing MPK7 and MPK14 via CRISPR/Cas9 technology. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23 （1）： 281-289 [百度学术]

毛兴学，郑晓钰，孙炳蕊，李晨，陈文丰，潘大建，柳武革，范芝兰，王丰. 应用CRISPR/Cas9技术创制低直链淀粉含量水稻种质. 植物遗传资源学报， 2022， 23 （2）： 583-591 [百度学术]

Mao X X， Zheng X Y， Sun B R， Li C， Chen W F， Pan D J， Liu W G， Fan Z L， Wang F. Creating novel rice germplasms with low amylose content by editing upstream sequence of Wx gene coding region via CRISPR/Cas9 technology. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23 （2）： 583-591 [百度学术]

赵春芳，梁文化，赫磊，姚姝，赵凌，周丽慧，赵庆勇，陈涛，朱镇，路凯，王才林，张亚东. CRISPR/Cas9编辑GS3和qGL3基因创制大粒水稻新种质. 植物遗传资源学报， 2022， 23 （6）： 1709-1717 [百度学术]

Zhao C F， Liang W H， He L， Yao S， Zhao L， Zhou L H， Zhao Q Y， Chen T， Zhu Z， Lu K， Wang C L， Zhang Y D. Creating novel rice germplasms with enlarged grain size by editing GS3 and qGL3 genes via CRISPR/Cas9. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23 （6）： 1709-1717 [百度学术]

张万年，杨静，杨绪磊，高萌萌，林春晶，刘鹏，李志刚，杨向东，张春宝. 大豆细胞核雄性不育基因MS6的功能验证及不育新种质创制. 植物遗传资源学报， 2023， 24 （3）： 801-807 [百度学术]

Zhang W N， Yang J， Yang X L， Gao M M， Lin C J， Liu P， Li Z G， Yang X D， Zhang C B. Functional identification of a nuclear male sterility gene MS6 and creation of new sterile germplasms in soybean. Journal of Plant Genetic Resources， 2023， 24 （3）： 801-807 [百度学术]

张婷，张双喜，裴丽丽，于太飞，陈明，李连城，周永斌，马有志，徐强，徐兆师. 菜豆ANK基因家族鉴定及ANK25的表达模式分析. 植物遗传资源学报， 2014， 15 （6）： 1334-1341 [百度学术]

Zhang T， Zhang S X， Pei L L， Yu T F， Chen M， Li L C， Zhou Y B， Ma Y Z， Xu Q， Xu Z S. Genome-wide analysis of ANK gene family and expression pattern of the ANK25 gene in snap bean. Journal of Plant Genetic Resources， 2014， 15 （6）： 1334-1341 [百度学术]

孙仁玮，刘永杰，王翔，张荃，张立平，孙辉，王永波，高建刚，杨卫兵，赵昌平，高世庆，韩俊. 小麦ARF基因家族生物信息学分析及在干旱胁迫下的表达特性研究. 植物遗传资源学报， 2018， 19 （1）： 122-134 [百度学术]

Sun R W， Liu Y J， Wang X， Zhang Q， Zhang L P， Sun H， Wang Y B， Gao J G， Yang W B， Zhao C P， Gao S Q， Han J. Bioinformatics identification of auxin response factor genes and expression profiles under drought stress in wheat. Journal of Plant Genetic Resources， 2018， 19 （1）： 122-134 [百度学术]

Bassham D C， Brandizzi F， Otegui M S， Sanderfoot A A. The secretory system of Arabidopsis. The Arabidopsis Book， 2008， 2008 （6）： e0116 [百度学术]

Brandizzi F. Transport from the endoplasmic reticulum to the Golgi in plants： Where are we now？ Seminars in Cell and Developmental Biology， 2018， 80： 94-105 [百度学术]

Parish R W， Li S F. Death of a tapetum： A programme of developmental altruism. Plant Science， 2010， 178 （2）： 73-89 [百度学术]

Gebbie L K， Burn J E， Hocart C H， Williamson R E. Genes encoding ADP-ribosylation factors in Arabidopsis thaliana L. Heyn.； genome analysis and antisense suppression. Journal of Experimental Botany， 2005， 56 （414）： 1079-1091 [百度学术]

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