百合<bold>bHLH</bold>家族系统进化和花香相关基因克隆及表达分析

武琼; 刘佳鑫; 赵瑛杰; 梁蕤; 韩美玲; 李超; 杜方; WU Qiong; LIU Jiaxin; ZHAO Yingjie; LIANG Rui; HAN Meiling; LI Chao; DU Fang

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1. 山西农业大学园艺学院，太谷 030801； 2. 山西农业大学城乡建设学院，太谷 030801； 3. 南京农业大学园艺学院，南京 210095； 4. 山西禾田悦农业技术服务有限公司，吕梁 033299

最近更新：2024-05-10

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231202001

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摘要

bHLH转录因子家族是植物中最大的转录因子家族之一。当前越来越多的植物bHLH转录因子家族被鉴定，然而百合bHLH转录因子家族的系统分析尚未见报道。本研究基于百合转录组数据，共鉴定出74个bHLH家族蛋白，均为亲水性蛋白，93%为不稳定蛋白，61%为酸性蛋白。结构域分析发现有25个保守残基的一致性≥50%，其中R16、R17、L27、L49和L59位点高度保守。此外，64个bHLH蛋白能与DNA结合，包含58个E-box结合物和46个G-box结合物。系统进化分析将百合bHLHs分为21个亚家族，基于进化树发现百合bHLHs可能执行信号转导、非生物胁迫、植物生长发育和物质合成等功能。对3个可能与罗勒烯和芳樟醇相关的基因Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All进行了克隆，发现它们在品种间存在97.30%～99.89%的同源性。表达模式分析结果显示，三者在花、叶和鳞中均有表达。该研究为开展百合bHLH转录因子的功能研究提供了重要的序列信息。

关键词

百合; bHLH家族; 鉴定; 基因克隆; 半定量RT-PCR

bHLH（basic helix-loop-helix）是一类广泛存在于动植物和真菌中的转录因子超家族，其在真核生物的正常生长及发育过程中必不可缺^［

1］。在植物中，bHLH转录因子主要参与生长发育和各种物质合成及信号转导的调控，同时在植物响应胁迫反应中起着关键作用。首个植物bHLH转录因子于1990年在玉米中发现，是由R基因编码的玉米Lc蛋白^{［参考文献 2

百度学术}2］。当越来越多的bHLH家族被鉴定后，1998年Atchley等^{［参考文献 3

百度学术}3］分析了动物、植物、酵母等生物中392个bHLH蛋白结构域，发现bHLH结构域包含19个保守氨基酸残基，其中5个位于基本区（Basic），5个位于第1螺旋（Helix1），1个位于环（Loop），8个位于第2螺旋（Helix2）。2003年Toledo-Ortiz等^{［参考文献 4

百度学术}4］基于拟南芥bHLH家族的分析，对Atchley等^{［参考文献 3

百度学术}3］的结果进行了调整，以“19个保守氨基酸残基中最多有9个不匹配”作为鉴定bHLH的标准。植物bHLH转录因子家族大致分为15~32个亚家族^{［参考文献 5-6}5-6］。根据序列相似性和进化关系以及结合DNA的能力，分为A ~ F 六大类群^{［参考文献 7

百度学术}7］。根据bHLH结构域的N端序列特征以及结合DNA的能力，分为能与DNA结合和不能与DNA结合的bHLH^{［参考文献 4

百度学术}4］。DNA结合蛋白又被分为两个亚类，E-box（包括G-box结合物及非G-box结合物）和非E-box结合物。其中13、16位点分别为谷氨酸（E）、精氨酸（R）的bHLH具有识别并结合E-box序列（CANNTG）的功能，无E13、R16位点特性的bHLH则不能与E-box结合；再者，9位点为赖氨酸（K）或组氨酸（H）且17位点为精氨酸（R）的能与G-box结合，否则不能与G-box结合。髓细胞组织增生蛋白（MYC，myelocytomatosis proteins）是bHLH转录因子家族成员之一，其除了含有bHLH结构域外，在N端还有一个保守的bHLH-MYC_N结构域^{［参考文献 8

百度学术}8］。

百合（Lilium spp.）是具有重要经济价值的花卉。虽然有学者对百合鳞茎花青素合成相关的bHLH进行了挖掘分析^［

9］，且有学者克隆了部分bHLH基因，但目前尚未见关于百合bHLH家族系统分析的报道。研究人员已在5种百合中克隆到11个bHLH转录因子基因，包括岷江百合（L. regale Wilson）中功能未知的bHLH062和BHLH；亚洲百合Montreux中克隆得到的参与花青素合成的LhbHLH1和LhbHLH2基因^{［参考文献 10

百度学术}10］，美丽百合（L. speciosum Thunb）中克隆到的LsbHLH2-rr1、LsbHLH2-rr2、LsbHLH2-wr1、LsbHLH2-wr2、LsbHLH2-wy1、LsbHLH2-wy2^{［参考文献 11

百度学术}11］，以及岷江百合中克隆到的LrbHLH2-1、LrbHLH2-2基因^{［参考文献 12

百度学术}12］；与黄瓜花叶病毒有关的岷江百合bHLH18和bHLH100基因^{［参考文献 13

百度学术}13］；与灰霉病抗性有关的岷江百合LrMYC2^{［参考文献 14

百度学术}14］和东方百合Sorbonne LhMYC2基因^{［参考文献 15

百度学术}15］；与花药发育有关的东方百合Siberia LoUDT1^{［参考文献 16

百度学术}16］和LoAMS^{［参考文献 17

百度学术}17］；与花香相关的Siberia LoMYC2^{［参考文献 18

百度学术}18］和LibHLH22与LibHLH63^{［参考文献 19

百度学术}19］基因。

本研究基于百合转录组数据库，挖掘百合bHLH基因家族，分析其数量和特性并进行分类，同时在东方百合Sorbonne中克隆可能与百合花香相关的bHLH基因，并分析其在不同组织器官中的表达规律以预测其潜在的功能，以期为深入探讨百合bHLH基因的功能提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 数据来源

课题组前期利用Illumina平台对东方百合Sorbonne花、叶、鳞、茎皮、根、柱头6个器官的混合样测序获得了一套转录组数据^［

20］。下载基于Illumina平台的麝香百合White Europe花粉转录组数据^{［参考文献 21

百度学术}21］，以及基于Roche454平台的4个基因型百合叶片转录组数据^{［参考文献 22

百度学术}22］，并将三套转录组数据进行杂交组装，形成一套新的转录组L.-Unigene-All^{［参考文献 20

百度学术}20］，它包含7个器官（根、鳞、叶、茎皮、花瓣、柱头和花粉）和6个品种/品系（Sorbonne、Star Gazer、White Fox、Connecticut King、Trumpet 061099、White Europe）。

1.2 百合bHLH家族的鉴定

从Pfam 36.0数据库^［

23］（http：//pfam.xfam.org/）中下载bHLH结构域的种子文件（PF00010），利用HMMER 3.0^{［参考文献 24

百度学术}24］软件构建相应的Profile HMM （数值表格型隐马可夫模型），并基于此模型检索百合转录组数据库中潜在的bHLH，获得数据集1。将百合转录组数据正反向序列提交到PlantTFDB v5.0^{［参考文献 25

百度学术}25］（http：//planttfdb.gao-lab.org/）在线网站预测数据库所包含的转录因子家族及数量，并筛选百合bHLH，获得数据集2。汇总数据集1和2的结果确定候选百合bHLH。随后，将初步筛得的百合bHLH蛋白序列提交至Tbtools v2.069^{［参考文献 26

百度学术}26］的Batch SMART插件，去除结果中‘HLH’长度不在44~55 aa范围内的序列，并将筛选结果提交至TBtools的Blast Zone进行去冗余，保留最长的序列，并根据“19个保守氨基酸残基中最多有9个不匹配”的原则去掉19个保守氨基酸残基中小于10个匹配的序列，最终获得百合bHLHs转录因子。

1.3 百合bHLH家族蛋白特性分析

基于筛选鉴定的百合bHLHs，用在线软件ExPASy ProtParam tool^［

27］（https：//web.expasy.org/protparam/）分析氨基酸数量、相对分子量、理论等电点、不稳定性及疏水性。用在线软件Cell Ploc 2.0^{［参考文献 28

百度学术}28］（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc/）预测亚细胞定位。用在线软件SOPMA^{［参考文献 29

百度学术}29］（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_ sopma.html）分析二级结构。

1.4 百合bHLH家族的保守域序列分析及分类

利用序列分析软件DNAMAN对百合bHLH家族蛋白结构域进行比对，比对结果使用在线软件 WebLogo v2.8.2^［

30］（http：//weblogo.berkeley.edu/logo.cgi）分析保守碱基。参照Toledo-Ortiz等^{［参考文献 4

百度学术}4］的方法，根据bHLH与DNA的结合模式对百合bHLH进行分类。

1.5 系统进化树的构建

利用MEGA 7.0软件内置的Clustal W程序对候选百合bHLH家族、已报道的百合bHLH及拟南芥bHLH蛋白结构域进行比对分析，将比对结果采用邻接法（NJ，neighbor joining）构建系统发育树，其中校验参数Bootstrap重复1000次，模式设置为Poisson model，缺失值处理方式为pairwise deletion，其他参数使用默认值。利用在线软件iTOL^［

31］（https：//itol.embl.de/itol.cgi）对进化树进行美化。

1.6 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因的表达模式分析

根据1.5的结果选择与已报道的百合花香相关bHLH基因（LoMYC2、LibHLH22和LibHLH63）高度同源的基因（Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All）进行进一步研究。

依据课题组东方百合Sorbonne花、叶和鳞的表达谱数据^［

32］，查询Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All 3个基因的RPKM值并进行log₂转化，将其输入到Tbtools的HeatMap插件中绘制热图。

1.7 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因的半定量RT-PCR

根据序列同源性，设计与LoMYC2同源的Unigene23213_All的引物，与LibHLH63同源的CL8286.Contig2_All的引物，与LibHLH22同源的CL1682.Contig2_All的引物来源于文献［

19］。所有引物及内参LhActin交由上海生工生物工程股份有限公司合成，引物序列如表1所示。以东方百合Sorbonne花、叶、鳞cDNA为模板，对Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All、CL8286.Contig2_All和LhActin进行半定量RT-PCR检测。PCR扩增体系为10 μL，包括2×Rapid Taq Master Mix（诺唯赞生物科技股份有限公司） 3 μL、cDNA 2 μL、正/反向引物各0.5 μL、ddH₂O 4 μL。反应程序为95℃ 3 min；95℃ 15 s，退火（温度见表1）15 s，72℃ 1 min，35个循环；72℃ 延伸5 min。将第一次PCR反应产物作为模板进行二次PCR扩增后，取5 μL PCR产物，在1%琼脂糖凝胶上检测。

表 1 引物信息

Table 1 Information of the primers

引物名称 Primer name	上游引物（5′-3′） Forward primer （5′-3′）	下游引物（5′-3′） Reverse primer （5′-3′）	目标长度（bp） Target length	退火温度（℃） Tm
Unigene23213_All	ATGAAGAGGAACTCGTCCC	TCAGGCTCCTTCAGAGATC	912	58
CL1682.Contig2_All	ATGGAGACAACGCCCAGCTC	TCAGAGCTCCGTCTTTAACTGGTTC	1089	60
CL8286.Contig2_All	ACTCTATCGGCAAGATTTCAG	CTGAGTAAATTCTTGTGTGGC	1211	55
LhActin	TGCTGGATTCTGGTGATGGT	ATAGGTGGTCTCGTGGATGC	383	58

1.8 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因的克隆

采用表1中的引物，以东方百合Sorbonne的花为模板进行基因克隆，PCR反应体系与程序同1.7。利用Simgen公司的凝胶DNA回收试剂盒回收目的片段，回收后连接至Takara公司pMD™19-T载体上，然后转化到全式金公司Trans5α大肠杆菌感受态细胞，涂入蓝白斑筛选的平板，挑取白斑进行菌液PCR验证后送上海生工生物工程股份有限公司进行测序。利用NCBI网站中的Open Reading Frame Finder工具确定测序结果的CDS序列。利用DNAMAN对获得序列和已知的同源基因进行序列比对。

2 结果与分析

2.1 百合bHLH家族成员鉴定

使用Pfam与PlantTFDB对东方百合Sorbonne的bHLH转录因子进行初步筛选，其中从Pfam中得到的数据集1包含120个候选序列，从PlantTFDB中得到的数据集2包含132个候选序列，数据集2中的132个序列包含了数据集1中所得到的120个序列。可见PlantTFDB数据库中的信息更为全面，从PlantTFDB中得到的数据集2即为候选百合bHLH。将这132个候选序列输入TBtools的Batch SMART插件，去掉结构域不完整的序列，用Blast Zone插件去除冗余序列，最后根据Toledo-Ortiz等^［

4］制定的标准保留结构域中最少有10个氨基酸残基保守的序列，最终获得74个百合bHLHs。

2.2 百合bHLH家族蛋白特性分析

百合bHLHs可编码110~597个氨基酸，预测相对分子量在12462.43~67174.13 Da之间。理论等电点范围在4.42~10.10，其中酸性蛋白（理论等电点<7）有45个（61%），碱性蛋白（理论等电点>7）有29个（39%）（图1A）。不稳定指数（Ⅱ）分析表明除CL3338.Contig1_All、Unigene38585_All、Unigene8913_All、Unigene15863_All和Unigene8105_All等5个为稳定蛋白外（不稳定指数<40），其余均为不稳定蛋白（93%）（图1A）。所有bHLH蛋白的亲水性值均为负值，范围在-0.865 ~ -0.054，表明其都具有亲水特性。亚细胞定位预测显示，除Unigene8105_All定位在叶绿体，其余bHLH蛋白均定位于细胞核。

图1 百合bHLH转录因子家族蛋白特性分析

Fig.1 Characterization of lily bHLH transcription factor family proteins

图中只显示25个百合bHLH蛋白名称

Only 25 lily bHLH protein names were shown

利用SOPMA在线网站预测百合bHLH蛋白二级结构，α-螺旋占比为17.11%~63.64%，延伸链为0.81%~17.66%，β-转角占比为0~10.00%，无规则卷曲程度为28.42%~74.95%。二级结构分析发现，百合bHLH家族蛋白中α-螺旋和无规卷曲所占比例较大，其中62.16%的蛋白二级结构中无规卷曲所占比例最大，37.84%的蛋白二级结构中α-螺旋所占比例最大（图1B）。

2.3 百合bHLH结构域保守性氨基酸残基的分布及特征

74个百合bHLH结构域比对显示，百合中氨基酸残基一致性≥50%的残基有25个（图2）。其中5个分布在基本区（H9、E13、R14、R16、R17），9个分布在第1螺旋区（E18、K19、I20、N21、R23、L27、L30、V31、P32），环区2个（K36、D44），其余9个在第2螺旋区（K45、A46、S47、L49、I53、Y55、L59、Q60、Q62）。可见，保守氨基酸残基主要分布在两个螺旋区。其中R16、R17、L27、L49与L59位点表现出极高的保守性（≥85%）。此外，100%的20、48、56和59位点，99%的24、27、30、31和49位点为疏水性氨基酸（A、F、I、L、M、P、V、W 或 Y）。

图2 百合bHLH转录因子家族保守氨基酸分析

Fig.2 Conserved amino acid analysis of lily bHLH transcription factor family

天冬氨酸（D）和谷氨酸（E）为红色，天冬酰胺（N）和谷氨酰胺（Q）为紫色，赖氨酸（K）、精氨酸（R）和组氨酸（H）为蓝色，半胱氨酸（C）、甘氨酸（G）、丝氨酸（S）、苏氨酸（T）和酪氨酸（Y）为绿色，丙氨酸（A）、缬氨酸（V）、亮氨酸（L）、异亮氨酸（I）、脯氨酸（P）、色氨酸（W）、苯丙氨酸（F）和甲硫氨酸（M）为黑色

Aspartic acid （D） and glutamic acid （E） were shown in red， asparagine （N） and glutamine （Q） were shown in purple， lysine （K）， arginine （R） and histidine （H） were shown in blue， cysteine （C）， glycine （G）， serine （S）， threonine （T） and tyrosine （Y） were shown in green， alanine （A）， valine （V）， leucine （L）， isoleucine （I）， proline （P）， tryptophan （W）， phenylalanine （F）， and methionine （M） were shown in black

2.4 基于DNA结合能力的百合bHLH分类

基于DNAMAN对百合bHLH家族蛋白结构域的比对结果发现，有58个bHLH具有保守的E13/R16位点，为E-box结合蛋白。在能与E-box结合的bHLH中，46个bHLH具有保守的K/H9和R17位点，为G-box结合蛋白。由于氨基酸E13或R16的缺失，以及在基本区中碱性氨基酸少于6个，有10个bHLH为不能与DNA结合的蛋白（表2）。

表 2 预测百合bHLH蛋白结构域的DNA结合特性

Table 2 Prediction of DNA binding properties of lily bHLH protein domains

结合模式 Binding pattern	数量 Number
能与DNA结合 DNA binding	64
能与E-box结合E-box binding	58
能与G-box结合G-box binding	46
不能与G-box结合 Non-G-box binding	12
不能与E-box结合 Non-E-box binding	6
不能与DNA结合 Non-DNA binding	10

2.5 百合bHLH转录因子家族进化分析

构建拟南芥与百合bHLH家族的系统进化树，研究其进化关系（图3）。根据拟南芥的进化分类可将所鉴定的百合bHLHs划分为21个亚族，其主要分布在XII（12个）、III（d+e）（6个）和X（6个） 3个亚家族中，其中已报道的百合bHLH分别集中在III（a+c）、IIIb、III（d+e）、IIIf、IVa、IVb、IVc、XII和XIV 9个亚族。与拟南芥相比，百合bHLH没有聚集到Ib（1）、II、VIIIb、VIIIc（1）和VIIIc（2） 5个亚家族中。在多数情况下，拟南芥和百合在同一个亚家族中具有不同数量的bHLH。

图3 百合与拟南芥bHLH结构域系统发育树

Fig.3 Phylogentic analysis of bHLH domain from Lilium and Arabidopsis thaliana

灰色实心五角星标注的是本研究所鉴定的百合bHLHs，灰色空心五角星标注的是已报道的百合bHLH

The solid gray pentagram indicates the lily bHLHs identified in this paper， and the hollow gray pentacle indicates reported lily bHLH

同一亚家族成员可能具有相类似的功能，推测与拟南芥bHLH聚在相同亚族的百合bHLH发挥着相同或相近的作用。在百合21个bHLHs亚族中，Vb和VIIIa亚族同源的AtbHLH功能未知，且这2个亚族蛋白在NCBI中未能对比到任何功能明确的bHLH，因此Vb和VIIIa亚族功能尚待研究。其余亚族可能参与信号转导、非生物胁迫、植物生长发育和物质合成等过程。其中III（d+e）家族基因可能与花香物质芳樟醇的合成相关^［

18］，XII家族基因可能参与花香物质罗勒烯和芳樟醇的合成^{［参考文献 19

百度学术}19］。

2.6 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因在花、叶和鳞中的表达

基于Sorbonne花、叶和鳞3个器官表达谱所做热图可知（图4A），Unigene23213_All在花、叶和鳞中的表达相较于CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All在3个器官中的表达量高。Unigene23213_All在鳞和叶中高表达，在花中低表达。CL1682.Contig2_All在花中表达量最高，在叶和鳞中表达量低。CL8286.Contig2_All在花和叶中的表达量近似，在鳞中低表达。

图4 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All 和CL8286.Contig2_All的空间表达

Fig.4 The spatial expression of Unigene23213_All， CL1682.Contig2_All and CL8286.Contig2_All

A：Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All、CL8286.Contig2_All在花、叶和鳞中的表达情况；B：Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All、CL8286.Contig2_All在花、叶、鳞中的半定量分析；F：花，L：叶，S：鳞

A： Expression pattern of Unigene23213_All， CL1682.Contig2_All， CL8286.Contig2_All in flower， leaf and scale；B： Semi-quantitative analysis of Unigene23213_All， CL1682.Contig2_All， CL8286.Contig2_All in flower， leaf and scale；F： Flower， L： Leaf， S： Scale

半定量RT-PCR琼脂糖凝胶电泳图显示（图4B），Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All与CL8286.Contig2_All在Sorbonne的花、叶和鳞中均有表达。Unigene23213_All在Sorbonne花和叶中的条带明亮，鳞中暗淡，推测其在Sorbonne花和叶中的表达量远高于鳞。CL1682.Contig2_All在Sorbonne花、叶和鳞中的条带清晰明亮，在3个器官中的表达水平几乎一致。CL8286.Contig2_All在Sorbonne花和鳞中明显高表达，在叶中微弱表达。

2.7 Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因的序列分析

前人研究^［

15］表明，Sorbonne中的LhMYC2与岷江百合中LrMYC2的氨基酸序列一致，两者都与灰霉病抗性有关。序列对比发现（图5），LhMYC2和LrMYC2与调控花香的Siberia LoMYC2氨基酸序列同源性高达99.89%，存在3个单氨基酸多态性（SAP，single amino acid polymorphism）位点，LhMYC2、LrMYC2和LoMYC2为同源基因，该基因可能同时参与灰霉病和花香的调控。Local Blast发现，LhMYC2与转录组数据库（GeneBank No. SRP084220）中的Unigene23213_All同源，推测Unigene23213_All即为LhMYC2，且因LhMYC2已在 Sorbonne中克隆，则本研究不再重复克隆。

图5 LhMYC2、LrMYC2与LoMYC2氨基酸序列比对图

Fig.5 Amino acid sequence comparison of LhMYC2、LrMYC2 and LoMYC2

黑色三角表示bHLH结构域的保守位点；下同

The black triangle represents conserved sites in the bHLH domain；The same as below

CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All分别与Siberia中调控花香物质罗勒烯和芳樟醇合成的LibHLH22和LibHLH63同源。以Sorbonne花cDNA为模板对CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All进行PCR扩增，凝胶电泳检测结果与预期大小一致（图6）。经克隆测序后发现，CL1682.Contig2_All CDS区为1089 bp，编码362个氨基酸，与LibHLH22同源性为99.45%，存在2个SAP位点（图7A）。CL8286.Contig2_All CDS区为1116 bp，编码371个氨基酸，与LibHLH63同源性为97.30%，在序列3′端比LibHLH63多8个氨基酸（图7B）。序列比对发现，CL1682.Contig2_All与LibHLH22和CL8286. Contig2_All与LibHLH63两两之间bHLH结构域序列完全一致。推测Sorbonne中CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All可能也与罗勒烯和芳樟醇的合成有关。

图6 CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因的凝胶电泳图

Fig.6 Agarose gel electrophoresis diagram of CL1682.Contig2_All and CL8286.Contig2_All genes

M：D2000 DNA ladder

图7 CL1682.Contig2_All与LibHLH22和CL8286.Contig2_All与LibHLH63氨基酸序列比对图

Fig.7 Amino acid sequence comparison between CL1682.Contig2_All and LibHLH22， CL8286.Contig2_All and LibHLH63

A：CL1682.Contig2_All与LibHLH22蛋白序列比对结果；B：CL8286.Contig2_All与LibHLH63蛋白序列比对结果

A：Protein sequence alignment between CL1682.Contig2_All and LibHLH22； B：Protein sequence alignment between CL8286.Contig2_All and LibHLH63

3 讨论

作为植物中最大的转录因子家族之一，bHLH在植物整个生命周期的各种生物过程中起着关键作用。本研究共鉴定百合bHLH转录因子74个，比单子叶植物水稻（167个）^［

33］和玉米（208个）^{［参考文献 34

百度学术}34］所挖掘的bHLH转录因子少，可能是因为玉米和水稻bHLH家族的挖掘都是基于基因组数据进行的，而本研究是基于转录组数据进行的。所鉴定的百合bHLH多为酸性蛋白、不稳定蛋白，且均为亲水性蛋白。多数百合bHLH蛋白在二级结构分析中无规卷曲所占比例最大。以上结果与生菜^{［参考文献 35

百度学术}35］、甜橙^{［参考文献 36

百度学术}36］、云南红梨^{［参考文献 37

百度学术}37］等多种植物的bHLH家族蛋白性质相似。亚细胞定位预测除Unigene8105_All定位在叶绿体外，其余bHLHs均定位于细胞核中，推测Unigene 8105_All可能参与叶绿体某些功能转录调控，其余百合bHLH蛋白可能通过调控细胞核基因的转录来发挥功能。

百合bHLH蛋白结构域中有25个氨基酸位点的保守性在50%及以上，其中E13和R16/R17与DNA结合能力有关^［

7］，螺旋区域的L27和L59在二聚化过程中发挥关键作用^{［参考文献 6

百度学术}6］。此结果与玉米^{［参考文献 34

百度学术}34］、谷子^{［参考文献 38

百度学术}38］、石蒜^{［参考文献 39

百度学术}39］等多数植物的bHLH蛋白结构域存在相同的保守残基，表明bHLH转录因子家族在不同植物之间具有保守性。再者有9个位点的氨基酸多为疏水性氨基酸，而疏水性氨基酸是保证bHLH蛋白二级结构稳定性的关键^{［参考文献 40

百度学术}40］。

根据bHLH与DNA的结合模式和序列同源性，可对bHLH进行不同的分类。研究表明，74个百合bHLH蛋白中有58个（78.38%）能与E-box相结合，46个（62.16%）具有G-box结合功能，该结果与芒果（83.91%/65.52%）^［

41］和拟南芥（74.15%/60.54%）^{［参考文献 4

百度学术}4］的分析结果相似。根据与拟南芥bHLHs的系统进化关系，将百合bHLH划分为21个亚族，而甜橙^{［参考文献 36

百度学术}36］、菠萝^{［参考文献 42

百度学术}42］、石蒜^{［参考文献 39

百度学术}39］分别被分为16个、18个、20个亚族，这可能是不同物种间存在的差异。根据进化树分析结果，鉴定的68个百合bHLH功能得到了预测，它们可能参与信号转导、非生物胁迫、植物生长发育和物质合成等过程。

Sorbonne和Siberia都属于东方百合品种，基于与Siberia LibHLH22和LibHLH63序列的同源性设计引物克隆获得了Sorbonne CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All基因，但其氨基酸序列与LibHLH22和LibHLH63的同源性分别为99.45%和97.30%，推测同一基因在Sorbonne和Siberia间存在序列差异。表达热图与半定量结果显示Unigene 23213_All、CL1682.Contig2_All与CL8286.Contig2_All 在Sorbonne花、叶和鳞中都表达。Cui等^［

15］发现LhMYC2在Sorbonne花、叶、茎和根中表达。本研究发现与其同源的Unigene23213_All在鳞片中也表达。前人发现LibHLH22和LibHLH63在花的各个组织如花瓣、花柱、花药、花托、柱头、花丝和子房中均有表达^{［参考文献 19

百度学术}19］。在本研究中，CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All 除在Sorbonne花中表达外，也在叶和鳞中表达。可见，Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All这3个基因具有非器官特异性，说明它们除在花中参与花香调控外，可能在其他器官中也发挥着作用。不过，Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All和CL8286.Contig2_All在Sorbonne各器官中的表达量需进一步采用实时荧光定量PCR进行验证。

综上所述，本研究系统分析了东方百合Sorbonne转录组数据，共鉴定74个百合bHLH转录因子，分为21个亚族。通过与拟南芥bHLHs的比较分析，预测百合bHLHs可能与信号转导、非生物胁迫、植物生长发育和物质合成等功能相关。明确了3个可能与罗勒烯和芳樟醇相关的基因Unigene23213_All、CL1682.Contig2_All 与 CL8286.Contig2_All，并发现三者在Sorbonne花、叶和鳞中均有表达。总体上，百合中还有大量功能未知的bHLH基因需要进一步研究，本研究为进一步系统而全面了解百合bHLH转录因子提供了基础资料。

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