大豆胞囊线虫相关基因<bold>GmSBPC</bold>的克隆及表达模式分析

宋庚晨; 曲硕; 胡世豪; 刘芳; 孙浩文; 赵雪; 韩英鹏; SONG Gengchen; QU Shuo; HU Shihao; LIU Fang; SUN Haowen; ZHAO Xue; HAN Yingpeng

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大豆胞囊线虫相关基因GmSBPC的克隆及表达模式分析 PDF

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宋庚晨
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曲硕
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胡世豪
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刘芳
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孙浩文
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赵雪
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韩英鹏
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东北农业大学农学院/农业农村部东北大豆生物学与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150030

最近更新：2024-06-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231211003

摘要

以黑农37（感）和东农L10（抗）大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫RNA-seq数据，筛选出差异表达基因GmSBPC，对该基因编码蛋白的空间结构、蛋白理化性质、亲疏水性等进行生物信息学分析。利用抗病东农L10根系cDNA克隆GmSBPC。将含有pCAMBIA1302-GmSBPC重组载体转化至大肠杆菌DH5α、农杆菌GV3101（psoup-p19）进行亚细胞定位分析。重组pCAMBIA3300-GmSBPC转至根癌农杆菌K599进行大豆毛状根侵染。线虫土种植东农L10（抗）、东农50（感），大豆胞囊线虫胁迫处理0 d、3 d、6 d、9 d、12 d、15 d分别取根、茎、叶进行qRT-PCR分析基因表达模式。结果表明，GmSBPC蛋白编码146个氨基酸，为不溶性蛋白，α螺旋区占28.08%、延伸结构占15.75%、无规则卷曲占56.16%。亚细胞定位结果表明基因定位在细胞核中。过表达毛状根相比野生型大豆单位面积内线虫数目减少。大豆胞囊线虫胁迫下该基因在东农50和东农L10根系的表达模式为先升高后降低，整体表达水平东农L10根系＞东农50根系，东农L10根系中12 d表达量最高，该时期为线虫侵染大豆的二龄幼虫时期，因此判定该基因对线虫胁迫存在响应应答反应，推测该基因参与大豆胞囊线虫的胁迫反应。这些研究结果有助于进一步探讨SBPC基因在大豆抗胞囊线虫过程中的生理功能。

关键词

大豆; GmSBPC; qRT-PCR; 亚细胞

大豆（Glycine max （Linn.） Merr.）古称菽，籽粒富含蛋白质和油。大豆原产于中国，作为我国重要粮食作物，已有5000多年栽培历史^［

1-2］。大豆胞囊线虫病Heterodera glycines Ichinohe是全球范围流行的土传性病害。大豆胞囊线虫病发病地上部分植株矮化、子叶发黄、花期延迟、坐荚率低、籽粒不实^{［参考文献 3

百度学术}3］，可导致大豆减产30%~50%，甚至颗粒无收^{［参考文献 4

百度学术}4］。大豆胞囊线虫生活史可分为卵期（J₁）、4个幼虫龄期（ J₂）和成虫期（J₃），幼虫龄期是大豆侵害较为严重的时期^{［参考文献 5

百度学术}5］。大豆胞囊线虫通过自身蠕动以及农耕、水流、种子等传播媒介侵入大豆幼苗根系，寄生于根皮层，利用口器刺入细胞壁，分泌消化酶，破坏根部相邻薄壁细胞建立合胞体，以此获得稳定的养分来源^{［参考文献 6

百度学术}6］。大豆胞囊线虫经4次蜕皮发育为成虫，待雌雄虫成熟、交尾、雌虫产卵、合胞体退化、胞囊分泌虫卵、脱落进入土壤，胞囊黄色变为褐色^{［参考文献 7

百度学术}7］，即一个世代（约30 d）侵染结束。根据不同群体对大豆致病力差异，将大豆胞囊线虫病划分为16个生理小种，目前造成我国大豆经济损失较为严重的致病小种以1号、3号、4号为主，其中3号生理小种为优势种^{［参考文献 8

百度学术}8］，主要分布于东北地区；具有强侵染能力的4号生理小种大多遍布在黄淮海地区^{［参考文献 9

百度学术}9］。李沐慧等^{［参考文献 10

百度学术}10］对东北地区大豆胞囊线虫病展开调查，结果显示大豆胞囊线虫病发病率高达82.67%。黑龙江省是大豆主产区，产量居全国首位，大豆胞囊线虫病发生频繁。伴随大豆种植面积扩大、连作等因素导致生理小种变异加速，选育抗病品种^{［参考文献 11

百度学术}11］、挖掘新的位点和基因^{［参考文献 12

百度学术}12］是防治该病最经济有效的方法。目前，通过发掘与大豆重要农艺性状相关的转录因子，研究其在植物对病原体的免疫应答激活过程中的转录重编程所发挥的作用，可为大豆遗传改良提供候选基因，有利于培育出具有优良性状的大豆新品种。

转录因子（TF，transcription factor）又称反式作用因子，通过与目标基因启动子区域中的顺式作用元件发生相互作用来调节基因特异性表达^［

13-14］。SQUAMOSA启动子结合蛋白（SBP，SQUAMOSA promoter binding protein）转录因子是目前仅在绿色植物中所特有的一类重要转录因子，其编码的DNA结合结构域均含有一段保守的核苷酸序列（SBP-box），通常由79个氨基酸残基高度保守的SBP结构域组成。Yamasaki等^{［参考文献 15

百度学术}15］采用核磁共振法测定该结构域含有2个锌指结构，即由2个Zn²⁺通过8个Cys或His残基结合而成的Cys₃HisCys₂HisCys或Cys₆HisCys序列结构，其中前后4个残基分别与1个Zn²⁺配位，以维持构象的稳定，并且锌指结构C末端有一段与Cys₂HisCys序列部分重叠的双向核定位信号，可引导SBP蛋白进入核内行使功能。SBP蛋白最早由Klein等^{［参考文献 16

百度学术}16］从金鱼草（Antirrhinum majus）的花分生组织中发现，能够特异性结合基因MADS-box的SQUAMOSA启动子区域，指导该基因转录表达，从而调控花的形态发育。经鉴定SBP基因存在于拟南芥^{［参考文献 17

百度学术}17］、大豆^{［参考文献 18

百度学术}18］、玉米^{［参考文献 19

百度学术}19］、水稻^{［参考文献 20

百度学术}20］等物种中，主要参与植物的生长发育^{［参考文献 21

百度学术}21］、激素信号的介导^{［参考文献 22

百度学术}22］、逆境胁迫应答^{［参考文献 23-24}23-24］等诸多方面，如AtSPL8蛋白通过调节赤霉素介导发育过程来影响拟南芥花药的发生^{［参考文献 25

百度学术}25］，SBP转录因子中的lgl基因突变会导致玉米不能形成叶耳和舌叶^{［参考文献 26

百度学术}26］，耐盐基因OsSPL10调控水稻表皮毛的发育^{［参考文献 27

百度学术}27］，但是多数SBP基因在调控植物生长发育时也会受到植物中miRNAs的调控。miRNAs的结构是一条长度约20~24个核苷酸的RNA碱基链，其结合位点往往是相对于mRNA的3′UTR区域，通过与靶向信使RNA作用降解或抑制翻译的进行来实现对目的基因的表达调控^{［参考文献 28

百度学术}28］。研究发现，拟南芥从幼体到成熟的转变受体内上游调控因子miR156介导^{［参考文献 29

百度学术}29］，miR156与SBP基因互作能够影响水稻开花进程及顶端优势等^{［参考文献 30

百度学术}30］。从这些研究中可以看出，SBP家族基因对植物生长发育和响应逆境胁迫至关重要。

转录组测序技术（RNA-Seq）成功应用于大豆胞囊线虫抗性相关基因的挖掘筛选^［

31］。利用转录组测序可以高通量地获取物种在单核苷酸水平表达的基因信息，分析未知转录本间差异表达的基因^{［参考文献 32

百度学术}32］。前人研究集中证明SBP家族在多个物种中发挥重要功能，然而，针对该家族成员与大豆胞囊线虫抗性相关机制研究尚处于空白。本研究拟以抗大豆胞囊线虫病3号生理小种胁迫品种东农L10（抗）和黑农37（感）为实验材料，采用Illumina HiSeqTM 2500测序技术对大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫下的GmSBPC转录因子差异表达进行转录组分析，旨在为挖掘大豆胞囊线虫相关转录因子，也为后续抗大豆胞囊线虫种质资源的创制奠定重要的基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 植物材料

东农L10（抗）和东农50（感）、黑农37（感）选自东北农业大学阿城基地（北纬45.32°，东经126.58°）。选择无病斑、大小一致大豆种子用于后续试验研究。根据Riggs等^［

33］的鉴别方法均已鉴定其具备抗、感病特性，其中东农50为毛状根转化受体材料，东农L10和黑农37为转录组测序材料。

1.1.2 病土材料

大豆胞囊线虫3号生理小种采集于黑龙江省科学院大庆分院育种基地（北纬46.39°，东经125.36°）。繁殖病圃病土为大豆连作10年。

1.1.3 试验样品

利用无菌蛭石将10株东农50和东农L10催苗至第2个三小叶时期，设置生物学重复为5次，将幼苗移栽至大豆胞囊线虫病土中，线虫胁迫处理0~15 d，每隔3 d分别取东农L10和东农50大豆的根、茎、第一轮三出复叶组织样品，剪取2 g组织放于编好号的1.5 mL离心管中，并立即速冻于液氮罐中以达到保鲜作用，其余样品冻存于-80℃冰箱保存备用^［

34］。本氏烟草由东北农业大学大豆生物重点实验室提供。

1.1.4 质粒与菌种

过表达载体pCAMBIA3300、亚细胞定位载体pCAMBIA1302、大肠杆菌感受态（Escherichia coli）DH5α、异源蛋白表达农杆菌Agrobacterium GV3101 （psoup-p19）、根癌农杆菌K599均来自Coolaber。

1.2 试验方法

1.2.1 生物信息学分析

利用生物信息学在线软件对GmSBPC转录因子的功能进行预测和分析（表1）。同时对4个差异表达基因上游2000 bp基序特异性结合位点进行预测分析，筛选临界阈值P≤10^-5。

表 1 生物信息学在线工具及软件分析

Table 1 Bioinformatics online tools and software analysis

在线工具

Online software

网址/软件

Websites/Software

功能

Function

Phytozome v13

DNAMAN Version 8

Prot-Param

ProtScale

NetPhos-3.1

SignalP-5.0

PSORT II

TMHMM-2.0

SOP-MA

SWISS-MODEL

NCBI

MEGA X

Plant TFDB

Chiplot

Gephi

https：//Phytozome-next.jgi.doe.gov

软件

https：//web.expasy.org/protparam/

https：//web.expasy.org/protscale/

https：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos-3.1/

https：//www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-5.0/

https： / /psort.hgc.jp /form2.html

https：//services.healthtech.dtu.dk/services.php

https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl

https：//swissmodel.expasy.org/interactive

https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/

软件

PlantTFDB - Plant Transcription Factor Database

https：//www.chiplot.online/tvbot.html

软件

检索基因序列

比对基因序列

理化性质

亲/疏水性

磷酸化位点

预测信号肽

亚细胞定位

跨膜结构

二级结构

三级结构

结构域预测

系统发育树分析

转录因子调控靶基因

美化系统发育树

特异性结合位点预测

1.2.2 GmSBPC蛋白系统进化树分析

利用MEGA X软件，将GmSBPC基因在大豆、玉米、拟南芥等植物中同源比对蛋白整理成Fasta格式，进行同源蛋白比对。采用邻接法（N-J，neighbour joining）进行比对，Bootstrap 次数为1200次，完成进化树的构建及美化。

1.2.3 克隆CDS序列

当大豆东农L10长出第1个三小叶时，取一株根部组织样品（约1 g），RNA的提取利用Baypure磁珠法总RNA提取试剂盒（Bayzol），cDNA的合成则采用反转录试剂盒（TOYOBO）。反转录体系设置20 µL：RNA 4 µL（65℃ 5 min使mRNA二级结构打开，迅速插入冰中防止复性）、4×DNA Master Mix 4µL、Nuclease water 8 µL、5×RT Master MixII 4µL；反转录条件为：37℃ 15 min，50℃ 5 min，98℃ 5 min，4℃保存。以反转录得到的cDNA作为克隆模板，使用phyzome V₁₃设计特异引物扩增基因序列（表2），体系设置20 µL：GmSBPC-F 1 µL、GmSBPC-R 1 µL、cDNA 1 µL、KOD OneTM PCR Master Mix（TOYOBO）10 µL、ddH₂O 7 µL。PCR程序为：98℃预变性3 min；98℃ 变性10 s，55℃退火5 s，68℃延伸6 s，36次循环；68℃再延伸10 min，4℃保存。凝胶成像仪获得目标条带，利用Gel Extraction Kit（Omega）试剂盒切胶纯化回收。

表2 引物信息

Table 2 Primer information

引物名称

Primer name

序列（5′-3′）

Sequence（5′-3′）

酶切位点

Restriction sites

目的片段大小

（bp）

Target fragment size

用途

Use

T-GmSBPC-F

T-GmSBPC-R

subGmSBPC-F

subGmSBPC-R

Fq-GmSBPC-F

Fq-GmSBPC -R

GmActin 4-F

GmActin 4-R

TCGAGCTCCGTCGACAAGCTTATGGACACAAGCAGGTATGA

GCCCTTGCTCACCATAAGCTTTCATTCTCCATGGTAGTCAA

ACGGGGGACTCTTGACCATGGATGATGCCAAAGGCCACAAT

TACTAGTCAGATCTACCATGGTCTTAAACCACCAGCAATAT

GGAAAGAGATCAGGGTCCAAAG

CCTTGTGTCTTCTGTGGTACTG

GTTTCAAGCTCTTGCTCGTAATCA

GTGTCAGCCATACTGTCCCCATTT

Hind Ⅲ

Nco Ι

441

克隆引物

亚细胞定位引物

荧光定量引物

内参引物

波浪线：载体臂序列；双下划线：酶切位点；粗下划线：特异性扩增序列引物

Wavy line： Carrier arm sequence； Double underline： Enzyme cutting site； Thick underline： Specific amplification sequence primer

1.2.4 GmSBPC基因过表达载体的构建

利用Hind Ⅲ 分别单酶切表达载体pCAMBIA3300质粒和GmSBPC目的片段，反应体系50 µL：GmSBPC目的片段10 µL（150 ng/µL）、Hind Ⅲ 酶5 µL、Buffer 5 µL、ddH₂O 30 µL。酶切条件：37℃ 6 h。目的片段凝胶纯化同1.2.3。

使用同源重组试剂盒（Vazyme）将pCAMBIA3300线性化载体与目的基因片段进行连接，同源重组体系为20 µL：载体片段1.5 µL、目的片段0.5 µL、同源重组酶2 µL、5×CE Buffer 4 µL、ddH₂O 12 µL。重组条件为：37℃ 30 min。随后将构建好的pCAMBIA3300-GmSBPC质粒分别转入DH5α感受态细胞和农杆菌K599感受态细胞中，-80℃保存。

1.2.5 GmSBPC菌液PCR验证和测序

将上述大肠杆菌和农杆菌转化产物分别对应涂布在LB固体培养基（硫酸卡那霉素，硫酸卡那霉素+利福平抗生素）上并倒置在37℃和28℃恒温培养箱中过夜培养，分别挑取单一菌落于对应的LB培养液中，将大肠杆菌置于37℃恒温摇床振荡培养12 h，农杆菌于28℃震荡培养22 h，待菌体浑浊进行菌液PCR验证。利用Plasmid Mini Kit I试剂盒（Omega）提取扩大培养菌液中质粒并将质粒DNA送往睿博生物技术公司进行测序，后利用DANMAN Version 8与CDS序列比对。

1.2.6 GmSBPC基因亚细胞定位

利用NcoⅠ分别单酶切亚细胞定位载体pCAMBIA1302和GmSBPC目的片段，处理方法同1.2.4。将线性化处理后的载体pCAMBIA1302与目的片段同源重组构建pCAMBIA1302-GmSBPC，转化至大肠杆菌中，摇菌，用Plasmid Mini KitI（Omega）试剂盒提取质粒用于后续GV3101转化（psoup-p19）。

将pCAMBIA1302-GmSBPC质粒转入农杆菌GV3101（psoup-p19），其菌液与LB液体培养基（硫酸卡那霉素和利福平抗生素）混合，28℃恒温摇床过夜培养至OD₆₀₀值为1.0。离心富集，用烟草转化液（1ml 500mM MES+1ml 500mM Mgcl₂+10µL 1M As，ddH₂O定容至50ml）重悬白色菌体，经过清洗、离心、弃上清，再加入烟草转化液重悬，调节OD₆₀₀值至0.8，室温静置4 h。将带有pCAMBIA1302-GmSBPC的GV3101（psoup-p19）农杆菌侵染液注射到预先暗处理24 h的3~4周龄的烟草后，黑暗培养12 h，正常光照48 h，即可使用。利用镊子将3株烟草相同注射部位叶片下表皮撕下并放置于载玻片上，利用移液器吸取少量ddH₂O水放置载玻片中，激光共聚焦显微镜观察并拍摄存片。

1.2.7 发根农杆菌介导大豆毛状根鉴定

首先从大豆胞囊线虫病土中取接种15 d的东农50大豆幼苗，用清水将根部冲洗干净，再用3%~5%次氯酸钠水溶液浸没根部进行脱色，然后加入ddH₂O静置15 min，用预先煮沸已稀释30倍的酸性品红溶液煮45~120 s，取出根部用吸水纸擦干。对根部进行压片镜检，在20×体式显微镜下观察大豆胞囊线虫数目。

1.2.8 大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫鉴定

对照组为未转化的东农50大豆根系，试验组为含有GmSBPC的东农50根系。大豆东农50生长第一个三出复叶（V₁期），利用含有GmSBPC基因的农杆菌K599菌液（详见1.2.4）针刺大豆生长点，并将大豆移植于大豆胞囊线虫3号生理小种的病土。14 d后，用清水将大豆根部冲洗干净，获取大豆毛状根组织于电子天平中称量0.2 g，将组织放置于1.5 mL EP管中，加入100 µL无菌水， Bar试纸条插入1.5 mL EP管中进行转基因验证，将验证后的东农50幼苗移栽到大豆胞囊线虫3号生理小种的土壤中。对照组处理方式与试验组相同，针刺生长点用无菌水进行。利用Excel 2010和SPSS软件对单位面积内大豆胞囊线虫数目进行统计分析。

1.2.9 实时荧光定量PCR检测

0~15 d的东农50和东农L10，每隔3 d取根、茎、叶组织液氮冷冻，使用RNA ios plus Trizol（KOIZEE）提取不同组织部位RNA，并利用反转录试剂盒（ToYoBo）提取cDNA用于后续基因表达模式分析研究（反转录同1.2.3）。

以GmActin4为内参基因，应用在线工具PrimerQuest™ 设计荧光定量引物（表2），引物委托睿博生物技术公司合成。反应体系20 µL： SYBR Green PCR master mix （Vazyme）10 µL、ddH₂O 6 µL、Fq-GmSBPC-F 1 µL、Fq-GmSBPC-R 1 µL、cDNA 2 µL。反应程序为： 95℃预变性5 min； 95℃变性30 s，55℃退火30 s，72℃延伸30 s，40个循环。各组织部位取样点设3次生物学重复，依据2^-ΔΔCT公式^［

35］来计算基因相对表达量（CT值取3次重复的平均值）。

2 结果与分析

2.1 生物信息学分析

2.1.1 GmSBPC蛋白理化性质分析

Prot-Param在线软件预测结果可知（图1A），GmSBPC蛋白编码146个氨基酸，其中占比最大的是精氨酸（Arg），约为13% ，苏氨酸（Thr）所占比例最少，为1.4%，而异亮氨酸（Ile）、色氨酸（Trp）、吡咯赖氨酸（Pyl）和硒代半胱氨酸（Sec）4种氨基酸不参与该蛋白生物合成。GmSBPC蛋白具有29个正电荷残基数（Arg+Lys）和29个负电荷残基数（Asp+Glu），分子结构式为C₇₀₄H₁₁₁₄N₂₄₀O₂₃₅S₁₀，相对分子质量为17020.66，理论等电点为7.08，原子总数为2303，预估该蛋白半衰期约30 h，脂肪族指数为37.40，平均亲水指数为-1.453，不稳定系数达到84.69，属于不稳定蛋白。从蛋白亲疏水性（图1B）中发现GmSBPC整条多肽链上疏水性氨基酸居多，总体呈现疏水性，即为不溶性蛋白，其对应的基因在第9和243 bp（3aa，81aa）位置上均出现了明显的高峰（同为1.78），而第98和99 bp（32aa，33aa）位置处亲水性最低（同为-0.567）。

图1 GmSBPC蛋白的氨基酸组成及比例和亲疏水性分析

Fig 1 Amino acid composition and ratio and hydrophobicity analysis of GmSBPC proteins

A： GmSBPC蛋白的氨基酸组成；B：亲疏水性分析

A： Amino acid composition of GmSBPC protein； B： Hydrophilicity analysis

GmSBPC蛋白含有10个潜在磷酸化位点（图2A），其中8个为丝氨酸磷酸化位点，2个为苏氨酸磷酸化位点，无酪氨酸位点。利用SignalP5.0预测到GmSBPC蛋白不具有信号肽结构，即属于非分泌型蛋白（图2B）。没有信号肽的蛋白不易被糖基化，经SignalP5.0 软件预测该蛋白无N-糖基化位点（图2C）。

图2 GmSBPC蛋白理化性质分析

Fig. 2 Physicochemical properties analysis of GmSBPC protein

A：磷酸化位点分析；B：信号肽分析；C：糖基化位点分析；D：跨膜结构域分析

A： Phosphorylation site analysis；B： Signal peptide analysis；C： Glycosylation site analysis；D： Transmembrane structural domain analysis

使用在线工具TMHMM-2.0预测到GmSBPC蛋白的跨膜结构域，GmSBPC编码146个氨基酸，跨膜螺旋氨基酸数量的期望值高于18（29.85307），由此可预测该蛋白为跨膜类蛋白且在细胞膜内侧发生迁移。此外GmSBPC蛋白包含4个跨膜螺旋，峰值分别出现在第21（0.40067）、47（0.29619）、78（0.28903）和118（0.18236）氨基酸残基（图2D）。

GmSBPC蛋白的亚细胞定位预测结果显示该蛋白分布在细胞质居多，约占43.5%，而在过氧化物酶体和高尔基体上的分布较少，仅为4.3%，推测该蛋白主要在细胞质内发挥转录调控作用。

2.1.2 GmSBPC蛋白结构与保守结构域预测

GmSBPC蛋白的146个氨基酸由3种结构组成，其中82个氨基酸处于无规则卷曲状态，占56.16%；21个氨基酸处于α螺旋区，占28.08%；23个氨基酸处于延伸结构，占15.75%（图3A）。GmSBPC蛋白三级结构以无规则卷曲为主（图3B），同二级结构预测的结果高度一致。通过NCBI在线软件预测发现1个超家族保守结构域与GmSBPC蛋白较为相似，即在第193~417 bp处的SBP super family （图4）。

图3 GmSBPC蛋白二级、三级结构预测

Fig. 3 Prediction of GmSBPC protein secondary and tertiary structure

A：蛋白横向二级结构，B：蛋白三级结构

A： Protein transverse secondary structure， B： Protein tertiary structure

图4 GmSBPC蛋白的保守结构域

Fig. 4 Physicochemical properties analysis of GmSBPC protein

2.1.3 SBPC转录因子系统进化树分析

将大豆、玉米、拟南芥等30个SBPC同源基因进行分析，结果表明30个SBPC同源基因的亲缘关系归为4类：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ（图5），相同分枝基因亲缘关系近，不同分枝之间基因亲缘关系较远。其中大豆Glyma.07G199000基因与拟南芥AT5G18830、AT2G33810亲缘关系最为接近。证明不同作物中SBPC基因亲缘关系存在一定的相似性。

图5 SBPC基因家族系统发育树分析

Fig. 5 Phylogenetic tree analysis of the SBPC gene family

Zm：玉米；AT：拟南芥；Glyma：大豆；黑色空心圆-黑色实心圆：自展值；自展值越大颜色越深代表亲缘关系越近

Zm： Maize； AT： Arabidopsis thaliana； Glyma： Soybean； Black hollow circle-black solid circle： Self unfolding value； The larger the self display value， the darker the color， indicating closer kinship

2.1.4 大豆SBPC转录因子调控靶基因预测

为进一步确定转录因子调控靶基因数目和调控的成员，对4个SBPC转录因子家族基因进行预测，结果表明4个SBPC转录因子家族基因Glyma.12G226000、Glyma.06G168600、Glyma.04G027400、Glyma.07G199000分别调控45、154、33、46个基因（图6）。调控各成员的靶基因之间重合较少，大多数都是受到一个成员的调控。对靶基因的进一步研究和分析发现，很多靶基因参与大豆的干旱胁迫、盐胁迫、金属盐离子胁迫、生物和非生物胁迫等。

图6 SBPC转录因子与靶基因调控网络表达图

Fig. 6 Expression map of the regulatory network of SBPC transcription factors and target genes

2.2 GmSBPC基因克隆

以东农L10根系cDNA为克隆模版特异性扩增GmSBPC基因，结果显示该基因片段大小在441 bp左右（图7B）。利用凝胶纯化试剂盒对目标基因进行纯化后送至哈尔滨睿博生物公司进行测序，测序后结果利用DNAMAN Version 8比对，结果表明目标基因GmSBPC成功克隆。

图7 GmSBPC基因克隆

Fig. 7 GmSBPC gene cloning

M： DS2000 Marker

2.3 GmSBPC亚细胞定位

将含有GmSBPC质粒转化到农杆菌感受态细胞GV3101（psoup-p19），探究GmSBPC基因亚细胞定位情况。含有GmSBPC基因的农杆菌注射到三出复叶烟草叶片下表皮中，未进行基因重组的pCAMBIA1302-GFP农杆菌为空白对照。激光共聚焦显微镜下观察，从结果中可知（图9），pCAMBIA1302-GFP空载体在细胞膜、细胞核、细胞质中均存在一定的表达，而pCAMBIA1302-GmSBPC在细胞核最亮，由此表明GmSBPC编码蛋白质主要在细胞核中表达，属于核定位蛋白，与预测结果高度一致。

图9 GmSBPC基因的亚细胞定位分析

Fig. 9 Subcellular localization analysis of GmSBPC gene

2.4 大豆根部大豆胞囊线虫3号生理小种的鉴定

将转GmSBPC基因根系和野生型根系通过SCN3病土进行鉴定，通过对单位面积内大豆胞囊线虫数目统计分析，可知过表达毛状根大豆侧根线虫数目平均为2个/cm²，野生型大豆侧根线虫数目平均值为5个/cm²（图10A、B）。试纸条对农杆菌K599侵染大豆毛状根系的组织检测显示，侵染后的大豆转基因毛状根呈现为阳性，未进行农杆菌转化的野生型在检测中为阴性（图10C）。将野生型东农50幼苗和转基因毛状根幼苗移栽到大豆胞囊线虫3号生理小种病土中，GmSBPC基因过表达阳性毛状根植株相较对照组线虫数目存在一定的差异，初步证实GmSBPC对大豆胞囊线虫3号生理小种有明显抗性。使用SPSS V25软件对GmSBPC基因过表达组和对照组单位面积胞囊线虫平均数量进行t检验（表3），结果显示，两组均值分别为2.747 和5.193 ，标准差分别为0.439 和0.755，检验结果t值为10.846 ，均值P值（双尾）为0，说明过表达组与对照组的单位面积胞囊线虫平均数量存在极显著差异，GmSBPC影响大豆对胞囊线虫的抗性。

图10 GmSBPC基因遗传转化植株的大豆胞囊线虫鉴定

Fig. 10 Identification of soybean cyst nematodes in plants genetically transformed with the GmSBPC gene

A：未转化东农50；B： GmSBPC过表达载体；C：Bar试纸条检测毛状根；红色方框：双杠代表阳性植株；红色箭头：幼虫时期

A： Not converted to Dongnong 50； B： GmSBPC overexpression vector； C： Bar strip for detecting hairy roots； Red box： Parallel bars represent positive plants； Red arrow： Larval stage

表3 t检验差异分析

Table 3 t-test analysis of variance

试验组

Experimental group

均值

Average value

标准差

Standard deviation

t值

t-value

均值P值（双尾）

Mean P-value （two-tailed）

GmSBPC-OX

2.747

0.439

10.846

CK-DN50

5.193

0.755

GmSBPC-OX：过表达GmSBPC基因的转基因大豆毛状根系；CK-DN50：对照大豆东农50

GmSBPC-OX： Transgenic soybean hairy root system overexpressing GmSBPC gene； CK-DN50： Control soybean dongnong 50

2.5 GmSBPC基因表达模式分析

通过qRT-PCR 方法，分别对大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫下东农50（感）和东农L10（抗）的GmSBPC基因进行基因表达模式分析（图11），结果显示，东农50根部相对表达量0→3 d上调， 3→6 d略微下调、6→9 d发生上调、9→15 d明显下调。大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫下的东农L10根部相对表达量0→3 d略微上调，其中3→9 d明显上调、9→12 d略微上调、12→15 d下调。结果表明东农L10（抗）根部同东农50（感）根部相比基因表达抗性水平更为明显。

图11 GmSBPC基因表达模式

Fig. 11 Analysis of GmSBPC gene expression pattern

A：东农50；B：东农L10

A： Dongnong50 ； B： Dongnong L10

植物的地下部分受到大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫，同样会导致地上部分产生应答反应。农50和东农L10的GmSBPC基因在茎中的表达为先升高后下降的趋势，其中东农50茎在9 d中上调量最为明显（图10A、B）。东农50和东农L10的GmSBPC基因表达整体呈现出先上调后下调的表达趋势，东农50和东农L10在0 d未接种大豆胞囊线虫，该基因未受到线虫胁迫，所以在根、茎、叶中相对表达量均存在较低的表达水平。针对大豆根系而言大豆胞囊线虫胁迫下东农50和东农L10的根系的表达模式为先升高后降低，相对表达水平东农L10根系＞东农50根系，根系中东农L10在12 d表达量最高，相对表达量为3.87（图11B）。茎中相对表达水平东农50根系＞L10根系，在第9天东农50的相对表达量达4.56。由于线虫侵染大豆根系在12 d左右达到高峰，因此判定该基因对线虫胁迫存在响应应答反应，并且在东农L10（抗）与东农50（感）根系中，抗病相对表达水平更高，推测该基因参与大豆胞囊线虫的胁迫反应。

3 讨论

大豆是世界范围内种植最多的经济油料作物，但在其种植过程中极易受到大豆胞囊线虫胁迫影响^［

36］。大豆胞囊线虫完成一个完整生活史为30 d左右，其幼虫时期对大豆的影响最为严重^{［参考文献 37-38}37-38］.大豆胞囊线虫最早起源于北美洲，后传播到亚洲、非洲，是一种以胞囊在土壤中越冬或粘染胞囊的土粒混杂在种子间随种子贮藏越冬的植物寄生线虫。大豆胞囊线虫在大田生产过程中存在小种专化现象，即随着土壤微生物活动和环境复杂化，虽存在多个生理小种，但大多是某一致病小种处于优势地位^{［参考文献 39

百度学术}39］。

GmSBPC基因是一种广泛存在于植物中参与抵抗逆境胁迫反应的转录因子，赵奇等^［

40］在研究蓖麻SBP基因家族响应非生物胁迫中发现，RcSBP基因不仅参与生殖器官的发育与调控，还能在激素调控和逆境胁迫中发挥重要功能。潘建英等^{［参考文献 41

百度学术}41］已鉴定三七PnSBP启动子结合蛋白有许多响应激素的元件，摘其花蕾会导致主根和芦头中的6个PnSBP基因表达量升高，推测该转录因子可能参与皂苷生物合成的调控。前人主要集中于研究全基因组SBP家族在植物生长发育、生物胁迫、厌氧诱导、激素调控等方面， SBPC转录因子在大豆中的相关功能尚未明晰。

本研究以黑农37（感）和东农L10（抗）大豆胞囊线虫3号生理小种胁迫转录组数据，筛选出与大豆胞囊线虫相关的差异表达基因GmSBPC，利用生物信息技术分析该蛋白参与编码146个氨基酸，相对分子质量为17020.66，不稳定系数可达84.69，为不稳定蛋白；不具有N-糖基化位点及信号肽结构，属胞内蛋白；跨膜结构域多在细胞内侧发生；蛋白质二级结构多以无规则卷曲状态呈现，其余均以α-螺旋和延伸结构为主；等电点为7.08，含有碱性氨基酸，可能在酸性亚细胞环境发挥重要作用，与李月颖等^［

42］在蒺藜苜蓿SBP-box基因家族的蛋白性质研究高度一致。GmSBPC转录因子含1种超家族保守结构域即SBP super family；据靶基因调控结果推断其可能参与大豆干旱、盐、金属离子、生物或非生物胁迫反应。此外，根据亚细胞定位结果推测该蛋白主要在细胞核调控大豆胞囊线虫3号致病小种相关抗性作用。通过构建系统进化树，发现大豆SBPC同拟南芥AT5G18830、AT2G33810亲缘关系最为接近，可能参与盐胁迫、热胁迫的响应过程^{［参考文献 43

百度学术}43］。本试验将大豆胞囊线虫胁迫下的东农L10和东农50采用qRT-PCR鉴定，发现该转录因子在根、茎、叶中均有所表达。韦德兰等^{［参考文献 44

百度学术}44］对杜仲EuSBP-box06基因进行非生物胁迫处理，发现根、茎部组织表达量较高，这表明SBP-box基因家族参与抵御非生物胁迫的复杂过程。从整体上看，GmSBPC基因在东农L10根系中的表达量整体高于东农50，相对表达水平随着处理时间的延长呈现先上调后下调的现象。结合大豆胞囊线虫侵染过程、生活周期与GmSBPC基因高表达时段，推测该转录因子可响应线虫入侵防控，且同东农50相比，GmSBPC在东农L10根部限制线虫移动效果更为显著。以上结果初步表明GmSBPC转录因子中含有参与调控细胞分化、生物生长、抗逆胁迫等相关的激素应答软件。

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