基于高通量芯片的大麦高效<bold>KASP</bold>标记的开发和应用

徐婷婷; 孟珊; 朱小品; 邹淑琼; 狄佳春; 杨欣; 朱银; 郭春滨; 颜伟; XU Tingting; MENG Shan; ZHU Xiaopin; ZOU Shuqiong; DI Jiachun; YANG Xin; ZHU Yin; GUO Chunbin; YAN Wei

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基于高通量芯片的大麦高效KASP标记的开发和应用 PDF

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江苏省农业科学院种质资源与生物技术研究所/江苏省农业种质资源保护与利用平台/江苏省农业生物学重点实验室，南京 210014

最近更新：2024-08-30

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231214001

摘要

分子标记是遗传研究的基础工具，广泛应用于遗传多样性研究、种质鉴定、遗传图谱构建和基因定位等领域。本研究利用Barley SNP 50K芯片对遗传背景来源广泛的大麦核心资源进行SNP检测，筛选出一系列多态性高的SNP位点，并开发出124个KASP分子标记。利用43份不同地理来源的大麦种质检测其有效性，初步筛选出56个KASP标记；以最小等位基因频率≥0.40、多态信息含量≥0.45为标准挑选18个高质量的KASP标记并用于绘制98份江苏省大麦品种的系统发育树，结果显示这18个KASP标记能够将具有相同地理来源及亲缘关系近的大麦材料聚为一类，表明上述KASP标记在大麦品种鉴定、大麦资源亲缘关系分析以及群体划分方面具有一定的指导意义和应用价值。同时构建了98份江苏大麦品种的SNP指纹图谱，验证了KASP技术在我国大麦品种鉴定中的可行性。开发的KASP标记能够准确、快速鉴定大麦品种，有助于大麦种质资源的科学规范管理和遗传多样性研究。

关键词

大麦; KASP标记; 遗传多样性; 指纹图谱; 品种鉴定

大麦（Hordeum vulgare L.）是禾本科大麦属的一年生或多年生草本植物，是居于水稻、小麦和玉米之后的第四大粮食作物，主要用作粮食、饲料、啤酒原料以及医药、保健食品。在我国，大麦是藏族地区的主要粮食作物。同时大麦具有早熟、耐旱、耐盐、耐低温冷凉、耐瘠薄等特点，属于典型的模式耐盐碱作物，具有重要的生产和研究价值。随着大麦品种资源数量逐年增多，出现了同名异物或者同种异名的现象。因此提高我国大麦种质资源管理和品种保护能力对加强大麦遗传育种研究、新品种培育及保障粮食安全具有重要意义。

目前，大麦品种及纯度鉴定主要依靠田间表型^［

1-3］、同工酶^{［参考文献 2

百度学术}2］、贮藏蛋白检测^{［参考文献 4-5}4-5］和DNA分子标记检测^{［参考文献 6

百度学术}6］，由于大麦品种类别增加及有些品种亲缘关系较近，难以用形态标记和生化标记快速地鉴别品种，导致品种鉴定时间长、精确度差。而DNA分子标记具有检测周期短、可实现高通量检测等优点，为大麦品种鉴定提供了新的技术手段，在作物品种真实性鉴定中已得到广泛应用。大麦品种鉴定DNA分子标记有RFLP^{［参考文献 7-8}7-8］、RAPD^{［参考文献 9-12}9-12］、AFLP^{［参考文献 13-14}13-14］、SSR^{［参考文献 15-19}15-19］、SNP^{［参考文献 17

百度学术}17， 20-21］和InDel^{［参考文献 22

百度学术}22］。由于RFLP、RAPD、AFLP分子标记操作繁琐、稳定性差、周期长，因此难以在品种鉴定中广泛应用。而SSR分子标记具有稳定性和共显性的优点，而且标记成本低，应用技术简单并已发布国内农业行业标准《大麦品种鉴定技术规程SSR分子标记法》^{［参考文献 23

百度学术}23］。InDel标记具有稳定性高、多态性高和共显性等优点，通过简单的PCR及凝胶电泳即可进行基因分型。但SSR标记与InDel标记在对大批量样本检测时需要大量的人力和物力，在试验中易出现扩增丢失、带型杂乱、模糊带型等现象，在高通量样本检测的效率和准确率方面缺乏优势。

SNP标记具有分布广泛、遗传稳定性好且易于实现自动化等优点，目前已迅速取代传统的分子标记。高通量的SNP检测技术包括基因芯片和竞争性等位基因特异性PCR（KASP，kompetitive allele specific PCR）技术。目前，很多作物已经开发了商业化SNP芯片^［

24-27］，比如Wheat 660K、Rice SNP50、Maize 50K、Cotton 63K等，单次位点检测量达上万个，可以作为研究作物遗传多样性、群体结构和QTL定位的有效技术手段，缺点是当前使用成本偏高，开发难度较大。而KASP技术以其高度稳定性、准确性和低成本的特点，已经被广泛应用于大样本、高通量的SNP分型。国内外研究者已经利用KASP技术构建了水稻^{［参考文献 28

百度学术}28］、玉米^{［参考文献 29

百度学术}29］、棉花^{［参考文献 30

百度学术}30］、甘蓝^{［参考文献 31

百度学术}31］、黄瓜^{［参考文献 32

百度学术}32］、葡萄^{［参考文献 33

百度学术}33］等作物的核心标记体系，为相应作物的品种鉴定和品种保护等提供了便利。目前，利用SNP标记鉴定大麦品种的研究也有相关报道。Pattemore等^{［参考文献 20

百度学术}20］利用质谱分析检测澳大利亚大麦品种SNP，并利用45个SNP位点构建测试品种的SNP条形码。张利莎等^{［参考文献 19

百度学术}19］和徐东东等^{［参考文献 21

百度学术}21］利用KASP标记对麦芽纯度及品种真实性进行了鉴定。但是将KASP标记广泛地应用在大麦种质资源鉴定、纯度检测及指纹图谱构建方面的研究还没有相关报道。

随着高通量测序技术的快速发展，大麦基因组测序已完成^［

34-35］，在此基础上开发了大麦Barley 9K和Barley 50K的SNP芯片，为基因的定位和大麦分子辅助育种提供了参考^{［参考文献 36-38}36-38］。基因芯片可以广泛用于种质资源鉴定、分子设计育种和大麦生物学研究，但是基于芯片的基因分型技术相对成本较高，尤其是样本量较多的种质资源库，因此基于芯片的核心SNP开发KASP标记进行高效、准确和低成本的大麦种质鉴定则显得尤为迫切。本研究利用Barley SNP 50K芯片对来自世界各地的具有丰富遗传多样性的大麦核心资源进行基因分型，筛选出多态性较高的SNP位点，基于这些位点设计KASP分子标记，利用代表性大麦品种资源进行验证，获得了一套均匀分布于大麦染色体上且多态性高的KASP标记，可广泛用于大麦品种鉴别、纯度检测和指纹图谱构建，从而促进种质资源科学管理和有序利用。

1 材料与方法

1.1 试验材料

288份地理来源广泛的大麦核心种质资源来源于江苏省农作物种质资源中期库，用于多态性SNP检测，其中129份来自中国，156份来自澳大利亚、德国、日本等国家，3份地理来源不明^［

38］；挑选其中43份地理来源不同的大麦材料，包含中国大麦材料12份，国外材料31份（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr. 20231214001，附表1），用于验证开发的KASP标记的有效性。挑选江苏省的98份大麦材料（表1），用于品种鉴定及分子指纹图谱构建，其中盐城71份、扬州12份、如东7份、连云港4份、南通3份、淮安1份，其中来自盐城的大麦品种编号19与81名称均为98AC7，编号63与67的大麦品种名称均为盐93031（不同批次入库保存）。上述材料均可在江苏省农业种质资源保护与利用平台网站（http：//jagis.jaas.ac.cn/）查询。

表1 试验材料详细信息

Table 1 Details of experimental materials

编号 No.	保存编号 Preservation number	名称 Name	来源地 Origin	编号 No.	保存编号 Preservation number	名称 Name	来源地 Origin
1	M3A00500001	0222×0413	江苏扬州	34	M3A00500177	盐95119	江苏盐城
2	M3A00500003	6187×91-7112	江苏扬州	35	M3A00500204	盐96066	江苏盐城
3	M3A00500004	6508×啤5	江苏扬州	36	M3A00500205	96AC14-9	江苏盐城
4	M3A00500010	大中88-91	江苏盐城	37	M3A00500210	（沪麦10号×冈21）×浙皮	江苏扬州
5	M3A00500017	苏农22×苏引麦2号	江苏扬州	38	M3A00500212	96-6404	江苏盐城
6	M3A00500019	连89-211	江苏连云港	39	M3A00500218	98AC-5-2	江苏盐城
7	M3A00500021	单60	江苏盐城	40	M3A00500224	S252×苏农22	江苏扬州
8	M3A00500027	通1310	江苏南通	41	M3A00500237	盐98051	江苏盐城
9	M3A00500042	盐96219	江苏盐城	42	M3A00500249	盐91022	江苏盐城
10	M3A00500044	2000鉴64	江苏盐城	43	M3A00500256	91269	江苏盐城
11	M3A00500047	通83-43	江苏南通	44	M3A00500267	单57	江苏盐城
12	M3A00500063	盐单218	江苏盐城	45	M3A00500274	2000鉴25	江苏盐城
13	M3A00500079	单95	江苏盐城	46	M3A00500277	单55	江苏盐城
14	M3A00500085	盐89234	江苏盐城	47	M3A00500280	盐96116	江苏盐城
15	M3A00500087	单218	江苏盐城	48	M3A00500281	如东89-35-1	江苏南通
16	M3A00500097	95AC13-25	江苏盐城	49	M3A00500283	矮早三	江苏盐城
17	M3A00500110	淮安三月黄	江苏淮安	50	M3A00500285	单6	江苏盐城
18	M3A00500111	98AC5	江苏盐城	51	M3A00500287	苏啤3号	江苏盐城
19	M3A00500113	98AC7	江苏盐城	52	M3A00500303	乌金一号	江苏盐城
20	M3A00500127	三得利5号	江苏连云港	53	M3A00500306	如东104-6	江苏南通
21	M3A00500143	盐92112	江苏盐城	54	M3A00500308	如东88-38-1	江苏南通
22	M3A00500145	盐92137	江苏盐城	55	M3A00500311	如东8-5	江苏南通
23	M3A00500147	盐92161	江苏盐城	56	M3A00500318	96AC19-8	江苏盐城
24	M3A00500149	盐91128	江苏盐城	57	M3A00500322	如东5485	江苏南通
25	M3A00500151	盐91143	江苏盐城	58	M3A00500328	96AC19-28	江苏盐城
26	M3A00500155	盐91253	江苏盐城	59	M3A00500330	96AC19-14	江苏盐城
27	M3A00500158	鉴101	江苏盐城	60	M3A00500332	96AC1-17	江苏盐城
28	M3A00500159	盐92001	江苏盐城	61	M3A00500334	96AC1-19	江苏盐城
29	M3A00500160	50845	江苏扬州	62	M3A00500337	盐93039	江苏盐城
30	M3A00500161	盐95143	江苏盐城	63	M3A00500339	盐93031	江苏盐城
31	M3A00500165	连90508	江苏连云港	64	M3A00500347	盐麦二号	江苏盐城
32	M3A00500171	盐麦三号	江苏盐城	65	M3A00500349	2000品11	江苏盐城
33	M3A00500175	盐95245	江苏盐城	66	M3A00500350	盐95053	江苏盐城
67	M3A00500354	盐93031	江苏盐城	83	M3A00500432	啤5	江苏盐城
68	M3A00500356	盐98115	江苏盐城	84	M3A00500438	盐92155	江苏盐城
69	M3A00500358	盐96157	江苏盐城	85	M3A00500448	盐96139	江苏盐城
70	M3A00500361	盐98-3179	江苏盐城	86	M3A00500449	盐92075	江苏盐城
71	M3A00500364	2000鉴26	江苏盐城	87	M3A00500458	盐93025	江苏盐城
72	M3A00500366	2000鉴27	江苏盐城	88	M3A00500461	苏B0001	江苏扬州
73	M3A00500367	苏农优质1号	江苏扬州	89	M3A00500463	盐91048	江苏盐城
74	M3A00500378	盐98016	江苏盐城	90	M3A00500470	优质1号	江苏连云港
75	M3A00500392	通89-054-3	江苏南通	91	M3A00500474	泾大1号×Hiproly	江苏扬州
76	M3A00500393	如东86-703	江苏南通	92	M3A00500496	盐93032	江苏盐城
77	M3A00500397	单74	江苏盐城	93	M3A00500504	盐92076	江苏盐城
78	M3A00500398	单95168	江苏盐城	94	M3A00500506	盐96112-1	江苏盐城
79	M3A00500403	单51	江苏盐城	95	M3A00500509	扬辐97-27	江苏扬州
80	M3A00500405	如东91-305	江苏南通	96	M3A00500511	扬辐9985	江苏扬州
81	M3A00500429	98AC7	江苏盐城	97	M3A00500515	矮单2-8	江苏盐城
82	M3A00500430	盐96134	江苏盐城	98	M3A00500518	大丰66-81	江苏盐城

1.2 KASP标记开发及筛选

采用Illumina公司开发的Barley SNP 50K芯片，包含44040个SNP标记，对288份遗传多样性丰富的大麦资源进行全基因组芯片扫描，获得基因分型数据。对基因分型数据进行处理分析，以缺失率<10%、最小等位基因频率（MAF，minor allele frequency）> 0.3的标准进行过滤，获得二态性的SNP位点。截取过滤后的SNP位点的上下游各200 bp共计401 bp DNA序列，与大麦参考基因组进行比对。设计和开发KASP标记，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成。每个KASP引物组合设计两条SNP特异性引物（F1和F2）和一条通用引物（R），F1尾部添加能够与FAM荧光结合的特异性序列（5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′），F2尾部添加能够与HEX荧光结合的特异性序列（5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′）（表2）。

表2 KASP标记信息

Table 2 The information of KASP markers

标记 Marker	变异碱基 SNP	染色体 Chr.	物理位置（bp） Position	最小等位基因频率 MAF	多态信息含量 PIC	引物序列（5′- 3′） Primer sequence（5′- 3′）
KASP1-F1	T/C	1	21918164	0.49	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCCTTGGTGGCCTTTGCTTGCT
KASP1-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCCTTGGTGGCCTTTGCTTGCC
KASP1-R						TAGTGCCTGACATACCTGCTGCATTGT
KASP2-F1	A/C	1	297997004	0.41	0.48	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTATAAAGCAACCATCACCGAACA
KASP2-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTATAAAGCAACCATCACCGAACC
KASP2-R						GCTGCGCGTCTGTGTGTGTTTATATCG
KASP3-F1	T/C	1	352406056	0.48	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTACAGATCAACCATTGTCGAGCGAT
KASP3-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACAGATCAACCATTGTCGAGCGAC
KASP3-R						TAAGACACTTGAGGGTAAAATTGGGATG
KASP4-F1	T/C	1	489070699	0.50	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTTTCAGGAGAAATATCTTACCGTAAT
KASP4-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTTCAGGAGAAATATCTTACCGTAAC
KASP4-R						ATGCACCCTGGTTGGAAGAACGACAAG
KASP5-F1	C/G	2	532195861	0.42	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGAGTACATGCGAGCTGAATCGTC
KASP5-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGAGTACATGCGAGCTGAATCGTG
KASP5-R						TCTGAAGCAACCAAACACGTCAGACGTC
KASP6-F1	T/C	2	746329951	0.41	0.48	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGATTATCTGTTCCTTTACTGTCTCT
KASP6-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATTATCTGTTCCTTTACTGTCTCC
KASP6-R						CAACAAGGACTGGTCAAYAAATCAAATG
KASP7-F1	T/C	3	1135724	0.49	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAATACTCCTAAGGTCAGTGCACCT
KASP7-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAATACTCCTAAGGTCAGTGCACCC
KASP7-R						CAACCACAGAAAGTTACCAAATGGAACTC
KASP8-F1	C/G	3	27740093	0.42	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGTAATTTTCTCATGAATAGTCTTC
KASP8-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTGTAATTTTCTCATGAATAGTCTTG
KASP8-R						CACAAACCGTTCGTGTTTTCTCTAGGCTG
KASP9-F1	A/C	3	78306376	0.45	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCATCCTTGTMAGAGTAACTCTAGA
KASP9-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCATCCTTGTMAGAGTAACTCTAGC
KASP9-R						GATTTCTGGGATGGACGTTTATCGGATC
KASP10-F1	T/G	3	307955242	0.42	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACACCATCTGTTCATCCTGTTCAT
KASP10-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCACCATCTGTTCATCCTGTTCAG
KASP10-R						GCAGTTNAATTTGAACTGCCAAAACATCT
KASP11-F1	A/G	3	334518553	0.40	0.48	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACAAGACGATTGAAGATATGCATTCA
KASP11-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCAAGACGATTGAAGATATGCATTCG
KASP11-R						TTAGRGACTTGTGCCAAGATACAAGAAC
KASP12-F1	T/G	3	562269534	0.42	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACGTACCTCCTTTCTGGTTTAAAAGT
KASP12-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTACGTACCTCCTTTCTGGTTTAAAAGG
KASP12-R						GTCGAATTATCAATCTAGGTACACATGTG
KASP13-F1	T/G	4	1090248	0.45	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTCTTGTCGCCGACGGGTCCGACCTTT
KASP13-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTTGTCGCCGACGGGTCCGACCTTG
KASP13-R						CACCTGCTTCCGCGCCCATCTCTCCGAC
KASP14-F1	A/C	4	566810803	0.44	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTTGCTAAGTTTAGTTTCAATTTTAAATA
KASP14-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTAAGTTTAGTTTCAATTTTAAATC
KASP14-R						CGGAATACAGGAATCCGCATGGCGGGAC
KASP15-F1	T/C	5	156367557	0.47	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTATAGCTGGTTCTTTTCTTCATTCCAT
KASP15-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTTAGCTGGTTCTTTTCTTCATTCCAC
KASP15-R						TATGTAGTTCATAATGAGAGAAAGGCCAC
KASP16-F1	T/C	5	348789450	0.44	0.49	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTACTACACCACTATGGAATCAGGAGAAT
KASP16-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTACACCACTATGGAATCAGGAGAAC
KASP16-R						TGCTATGTTTATAACTCTATTACGCGATC
KASP17-F1	T/C	6	41293406	0.47	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTGGATAATCTTATATGTTAAGCACAGT
KASP17-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGATAATCTTATATGTTAAGCACAGC
KASP17-R						TCGCGGAGTAGATAAGATGCTTAACTAGG
KASP18-F1	A/G	6	92431471	0.50	0.50	GAAGGTGACCAAGTTCATGCTAGCTCGTAGCTACGGAAATACTCGA
KASP18-F2						GAAGGTCGGAGTCAACGGATTGCTCGTAGCTACGGAAATACTCGG
KASP18-R						GATAAGATTGTCATAAATTGACCGATCAG

F1中下划线标出的序列（5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′）能够与FAM荧光结合；F2中下划线标出的序列（5′-GAAGGTCGGAGTCA ACGGATT-3′）能够与HEX荧光结合，下同

The underlined sequence （5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′） in F1 can bind to FAM fluorescence；The underlined sequence in F2 （5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′） can bind to HEX fluorescence；MAF：Minor allele frequency；PIC：Polymorphic information content；The same as below

KASP反应体系包括DNA模板1 uL（浓度为25~30 ng/μL），2×KASP master mix 2.5 μL（南京集思慧远生物科技有限公司），KASP Assay Mix（F1浓度为5 μmol/L、F2 浓度为5 μmol/L、R为15 μmol/L）0.125 μL，加ddH₂O至反应总体系为5 uL。阴性对照（NTC，no template control）反应体系中加的模板是ddH₂O。PCR反应程序：第一步95℃ 10 min；第二步95℃ 20 s，61~55℃ 1 min，共10个循环，每个循环降0.6℃；第三步95℃ 20 s，55℃ 1 min，共35个循环；第四步25℃ 30 s。PCR产物通过KASP荧光分析仪（LGC公司，FLUOstar Omega fluorescent plate reader）扫描分析结果。

1.3 数据分析

根据大麦品种的KASP标记的基因分型结果，计算最小等位基因频率、多态信息含量（PIC，polymorphic information content）^［

29］，挑选有效的KASP标记。利用TASSEL v5.0软件的邻接算法（N-J，neighbor-joining method）计算大麦资源之间的遗传距离^{［参考文献 39

百度学术}39］，用Figtree v1.4.3构建聚类图。

在Excel中，将开发的KASP分子标记按照染色体顺序排列，相同染色体上的引物则依据物理位置顺序从小到大排列。根据基因分型数据赋值结果，与大麦参考基因组一致的基因型记为1，不一致的基因型记为2、杂合基因型记为3，缺失记为0，构建江苏省大麦品种的SNP分子指纹图谱。

2 结果与分析

2.1 SNP位点的筛选和KASP分子标记的开发

首先利用50K芯片对核心群体的288个大麦材料进行全基因组扫描，共扫描了44040个SNP位点。去除缺失率>10%，最小等位基因频率<0.3的SNP位点，共筛选出24435个SNP位点。进一步截取以上标记上下游各200 bp，共401 bp序列^［

33］，比对大麦参考基因组，去除非特异性序列。以每个SNP位点上下游200 bp内，不存在其他SNP位点及去除N碱基含量较高的序列为标准，在每条染色体上均匀选取SNP标记，共获取到124个SNP位点，并利用PolyMarker软件将124个SNP位点成功设计出对应的124个KASP标记（图1）。

图1 KASP引物在大麦基因组上的分布

Fig.1 Distribution of KASP primers in barley genome

2.2 大麦KASP分子标记的有效性检测

利用KASP技术对43份大麦材料进行基因型检测，其中有56个KASP标记能够将大麦材料成功分型，且这些标记可以将相同基因型的材料聚类（图2A~B），同时阴性对照被聚集在一起。56个KASP标记多态信息含量变化范围为0.08~0.50，平均值为0.43（图2C），最小等位基因频率变化范围为0.04~0.50（图2D），平均值为0.35，其中大部分KASP标记具有较高的多态信息含量，表明这些标记具有极高的多态性。其他标记则由于在一些基因型中的扩增效率不高被剔除。

图2 KASP标记基因分型图及多态性信息含量、最小等位基因频率分析

Fig.2 The genotyping map of KASP markers and analysis of polymorphism information content and minimum allele frequency

A和B：分别为标记KASP1和KASP3的基因分型图；其中红色和蓝色簇状是具有FAM型和HEX型等位基因的品种；NTC：不含模板的空白对照；T：T代表含有TT基因型的品种，C：C代表含有CC基因型的品种，T：C代表含有杂合基因型TC的品种

A and B： Genotyping map of KASP1 and KASP3；Red cluster is a variety with FAM allele； Blue cluster is a variety with HEX allele； NTC： Blank control without template； T：T represents varieties containing the TT genotype， C：C represents varieties containing the CC genotype， and T：C represents varieties containing the heterozygous genotype TC

为了提高工作效率，减少检测成本，对筛选出的56个KASP标记进行遴选。以能够将HEX型和FAM型的基因型精准分型及高多态信息含量值和高分辨力，即最小等位基因频率≥0.40，多态信息含量≥0.45为标准^［

29］，筛选获得18个高质量的KASP标记，其多态信息含量变化范围为0.48~0.50，平均值为0.49，最小等位基因频率变化范围为0.40~0.50，平均值为0.45（表2），表明这18个KASP标记具有高特异性和高稳定性。

2.3 KASP分子标记在大麦品种鉴定中的应用

为了验证18个高质量的KASP标记在品种鉴定中的作用，对来自江苏省的98份大麦种质材料进行基因分型，基于分型结果利用Figtree v1.4.3软件绘制98份江苏省大麦种质材料的聚类图（图3）。结果显示98份江苏大麦种质材料被划分为4个类群。类群 Ⅰ 包含40份大麦种质资源，其中大部分材料来自盐城（31份），选育品种盐麦三号（编号32）、矮早三（编号49）、苏啤3号（编号51）、盐麦二号（编号64）和单95168（编号78）聚在一起，来自南通的通1310（编号8）、通89-054-3（编号75）等5份大麦资源聚在一起。类群 Ⅱ 中包含40份大麦种质材料，其中29份大麦材料来自盐城，包括来自不同亲本杂交的选育品系，如96AC和单系列等品系。来自如东的如东104-6（编号53）、如东89-35-1（编号48）等4份大麦资源与扬州的苏农优质1号（编号73）、扬辐97-27（编号95）等5份大麦资源被划分在类群 Ⅱ，表明具有相同地理来源的或者来自亲缘关系很近的品种能聚在一起。但也有例外，如扬州的大麦品种6508×啤5（编号3）划分在类群 Ⅲ，来自盐城的71份大麦品种中其余的11份划分在类群 Ⅲ 中有3份，划分在类群 Ⅳ 中有8份。

图3 98份材料的KASP分子标记聚类分析

Fig. 3 Cluster analysis of 98 cultultivars based on KASP markers

编号同表1；下同

The numbers are the same as table 1；The same as below

根据18个高质量的KASP标记（编号为KASP1~18）组合对98份江苏大麦品种的基因分型数据，得到江苏大麦品种的特征DNA指纹图谱（图4）。指纹数据比对分析发现，KASP分子标记可以区分98%的江苏省内大麦品种资源，可在分子水平上有效鉴别种质资源的同名异种或者同种异名。如来自江苏盐城的大麦品种98AC7（编号为19和81），在18个标记中有KASP1、KASP6、KASP8等10个位点存在差异；盐93031（编号为63和67），在18个标记中3个位点（KASP1、KASP4和KASP6）不同（表3）。虽然这些大麦品种有相同的名称，但是DNA指纹数据不同，表明挑选的KASP标记可以有效地将相同名称的不同资源在分子水平上鉴别出来。

图4 98份江苏大麦品种的KASP指纹图谱数据库

Fig.4 KASP finger-printing database of 98 barley cultivars in Jiangsu

蓝色、绿色、橙色和白色方块分别代表1、2、3和0

The blue， green，orange and white square represent the value 1，2，3 and 0，respectively

表3 相同名称大麦品种的分子指纹图谱信息

Table 3 Molecular fingerprinting information of barley varieties with the same name

标记 Marker	19 （98AC7）	81 （98AC7）	63 （盐93031）	67 （盐93031）	标记 Marker	19 （98AC7）	81 （98AC7）	63 （盐93031）	67 （盐93031）
KASP1	1	2	1	2	KASP10	2	1	2	2
KASP2	1	1	1	1	KASP11	1	3	1	1
KASP3	2	2	2	2	KASP12	1	2	1	1
KASP4	1	1	1	3	KASP13	2	2	2	2
KASP5	1	1	1	1	KASP14	1	1	1	1
KASP6	2	3	2	1	KASP15	2	1	1	1
KASP7	2	2	2	2	KASP16	1	2	2	2
KASP8	2	1	2	2	KASP17	2	1	1	1
KASP9	2	1	2	2	KASP18	1	1	2	2

1代表与参考基因型一致的基因型，2代表与大麦参考基因组不一致的基因型，3代表杂合基因型；括号内为材料名称

1 represents genotype that is consistent with the reference genotype， 2 represents genotype that is inconsistent with the barley reference genome， and 3 represents heterozygous genotype； The material name is in parentheses

3 讨论

种质资源是支撑种业创新，保障国家粮食安全，促进农业可持续发展的重要战略资源。对种质资源的科学规范管理，可以促进种质资源有序开发利用。基于表型的品种鉴定时间长，易受外界环境影响（温度、湿度、虫害等），利用DNA分子标记在分子水平上揭示不同种质材料之间的遗传差异，方法易行，结果可靠，不受外界环境、植物发育阶段等影响。

已经报道的用于大麦品种鉴定的DNA分子标记有RFLP、RAPD、AFLP、SSR、InDel和SNP。由于RFLP、RAPD、AFLP分子标记操作繁琐、稳定性差、周期长，难以广泛应用在大麦品种鉴定。SNP是单核苷酸变异产生的多态性，在基因组中数量多、分布广，具有已知性、可遗传性、可检测性，通过对SNP位点的检测，可用于目的基因的定位、克隆和鉴定。目前采用芯片技术检测高通量的SNP位点，但是该技术针对大样本进行全基因组扫描时成本较高，而KASP标记由于探针的加入，极大节省了操作时间，简化了步骤。利用KASP技术可以快速高通量对作物资源进行鉴定，在一些作物中已经广泛利用，如水稻^［

28］、玉米^{［参考文献 29

百度学术}29］、甘蓝^{［参考文献 31

百度学术}31］、葡萄^{［参考文献 33

百度学术}33］等。在大麦中，前人利用SNP标记对澳洲大麦品种鉴定及利用KASP技术鉴定麦芽纯度等^{［参考文献 19-21}19-21］，表明SNP位点可以有效揭示品种间的遗传差异，但是局限于少量的、有限的品种鉴别和纯度检测，在大麦种质资源鉴定方面研究相对较少，而KASP技术可以广泛推进SNP分子标记在大麦种质资源管理上的应用。

本研究基于大麦50K芯片对288份大麦核心群体资源的基因分型数据，筛选出多态性较高的SNPs，保证了选择的位点具有足够的区分能力。基于这些位点设计KASP分子标记，利用其中代表性大麦资源进行验证，获得了56个有效的KASP标记，其中大部分标记具有较高的多态信息含量值（PIC≥0.40）。为了降低成本，进一步以最小等位基因频率≥0.40，多态信息含量值≥0.45为遴选标准^［

29］，获得了18个高质量的KASP标记，其多态信息含量值变化范围为0.48~0.50，平均值为0.49，最小等位基因频率变化范围为0.40~0.50，平均值为0.45，表明开发的KASP标记具有极高的多态性，可用于遗传多样性分析，能够有效、准确、快速及安全地鉴定大麦品种。

利用挑选出的18个高质量的KASP标记，对来自江苏的98份大麦品种进行了KASP遗传多样性分析，聚类分析结果显示18个标记组合能够将遗传来源相近的资源聚在一起，大部分地理来源相近的遗传资源划分在同一类群中，这与利用InDel和SNP分子标记进行聚类分析的结果类似^［

22，38］。如来自盐城的大麦品种主要聚类被划分在类群Ⅰ（31份）和类群 Ⅱ（29份）；亲缘关系比较近的品种由于遗传相似度高聚在一起，如96AC系列的大麦品种划分在类群 Ⅱ，说明基于材料间遗传距离揭示品种的亲疏关系更科学。表明KASP分子标记组合可以有效构建大麦分子指纹数据库，推进种质库中大麦种质资源的规范有序管理，大麦分子指纹图谱可以揭示大麦种质材料间的遗传距离，为科学利用资源提供依据。

本研究利用KASP 技术构建了98份江苏大麦品种的SNP指纹图谱来鉴定江苏大麦品种。检查基因分型数据发现，96份江苏大麦材料具有唯一的指纹图谱代码。在品种鉴定分析中，KASP分子标记组合可以区分98%的供试大麦品种资源，表明现有的位点组合能够区分绝大多数种质材料，有效揭示了种质材料的内在遗传差异。如两份名称为98AC7（编号为19和81）的大麦品种有10个标记（10/18）位点信息不同，两份名称为盐93031（编号为63和67）的大麦品种3个标记（3/18）位点信息不同，根据差异位点数≥2^［

40］，说明该材料是不同的种质；而96AC19-8（编号56）、96AC19-28（编号58）和96AC19-14（编号59）3份资源材料差异位点数为0，表明种质材料的遗传相似度极高，它们可能为相同的种质，也可能在上述18个标记之外的位点上存在差异。对于上述遗传上极为相似的姊妹系、穗行系、近等基因材料等种质材料，需要进一步增加标记位点数量或者结合表型加以区分或验证。

4 结论

本研究首次基于大麦高通量50K芯片成功开发56个特异性强、稳定性高的KASP分子标记，多态信息含量和最小等位基因频率的平均值分别为0.43、0.35，并首次利用18个标记构建了江苏大麦品种的SNP指纹图谱，能成功区分绝大多数种质材料，可根据需要增加标记数目区分姊妹系等遗传近似品种。上述KASP标记不仅可以用于种质资源分子指纹体系构建，对大麦种质资源进行科学有序管理，还可以广泛用于大麦品种鉴别、纯度检测和品种维权，推动种子市场健康有序发展。

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