大豆<bold>GmALMT33</bold>基因在镉胁迫应答中的功能分析

翟佳悦; 宁伊; 刘丽媛; 王全伟; ZHAI Jiayue; NING Yi; LIU Liyuan; WANG Quanwei

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大豆GmALMT33基因在镉胁迫应答中的功能分析 PDF

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翟佳悦
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宁伊
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刘丽媛
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王全伟
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哈尔滨师范大学生命科学与技术学院/黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150025

最近更新：2024-06-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231218001

摘要

由于工业发展以及生活废弃物污染的不断加剧，作物中的重金属浓度超标，严重威胁人体的健康。铝激活苹果酸转运体编码一类阴离子通道蛋白，在植物有机酸的跨膜转运中发挥重要的作用。为研究GmALMT33基因在大豆应对镉胁迫中的功能，本研究以大豆黑农48的叶片cDNA为模板，利用RT-PCR克隆得到GmALMT33基因。该基因CDS区全长1622 bp，编码553个氨基酸，含有1个ALMT结构域。qRT-PCR结果表明，GmALMT33在大豆根部的表达水平最高；镉胁迫后，该基因表达量呈现先升高后降低的趋势。构建植物表达载体pCPB-GmALMT33并对烟草、大豆毛状根进行遗传转化，转基因植株抗逆表型与生理指标分析表明，镉（66 μmol/L CdCl₂）胁迫下，转基因烟草叶片黄化、褪绿，边缘褐化程度明显低于野生型烟草。转基因大豆毛状根复合体植株茎秆和叶脉呈现的红褐色毒害症状程度明显弱于转空载体植株。在镉胁迫处理7 d后，转基因烟草叶片的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性及可溶性糖含量均高于野生型对照，丙二醛含量均低于对照。在镉胁迫处理0 d、1 d、3 d后，转基因大豆毛状根复合体根和叶的超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶活性、可溶性糖含量均高于转空载体对照，丙二醛含量均低于对照，表明GmALMT33基因提高了植株的耐镉能力。本研究为进一步探讨GmALMT33基因的作用机制提供了依据，并为大豆抗逆育种提供了新的基因。

关键词

苹果酸转运蛋白; 镉胁迫; 生物信息学分析; 功能分析

大豆（Glycine max）是世界上优质蛋白质和油脂的重要来源，在食品、饲料和工业上有多种用途。然而在大豆生长过程中，会面临环境中各种生物和非生物胁迫的挑战。近年来，为进一步提高我国粮食作物的产量，在田间生产过程中化肥和农药的使用越来越多，导致我国自然环境中重金属污染愈加严重^［

1］。重金属污染是影响植物生长发育的主要自然因素。有研究结果表明，在众多重金属污染中，镉（Cd）污染占首位^{［参考文献 2-3}2-3］。镉容易被植物吸收和积累，对作物生长、产量和质量影响巨大。镉是环境中毒性较强的重金属元素之一，是植物生长和人体的非必要元素，具有高毒性、易积累、难降解等特点^{［参考文献 4-5}4-5］，超过一定限度就会导致植物细胞损伤，正常生理代谢受阻，影响植物生长及作物的产量和品质^{［参考文献 6-7}6-7］。因此缓解镉对植物的毒害作用，已经成为当前研究的热点问题，深入研究大豆耐镉机制，对创制大豆耐镉新种质及粮食安全都有着重要的现实意义。

苹果酸转运蛋白（ALMT，Aluminum-activated malate transporter）是植物所特有且广泛存在的一类膜蛋白家族^［

8］，属于阴离子通道蛋白，最初由Sasaki等^{［参考文献 9

百度学术}9］在小麦中发现。其主要功能是运输苹果酸，也可以运输阴离子和其他有机酸^{［参考文献 10-11}10-11］。苹果酸可与Al³⁺螯合，进而减少铝对细胞壁、细胞膜和其他细胞成分的损害，从而增强植株对铝的抗性。ALMT蛋白还参与低磷胁迫、盐胁迫等多种非生物胁迫^{［参考文献 12-13}12-13］，在植物气孔开放、矿质营养等基本生理过程中也发挥重要作用^{［参考文献 14

百度学术}14］。近年来，ALMT基因家族在多个物种中被鉴定，如大豆、铁皮石斛、苹果基因组中分别有15个^{［参考文献 15

百度学术}15］、12个^{［参考文献 16

百度学术}16］、25个^{［参考文献 17

百度学术}17］ALMT基因。虽然ALMT家族广泛存在于植物中，但只有少数被详细研究过。拟南芥中的3个ALMT成员（AtALMT6、AtALMT9和AtALMT12）和大麦中的1个ALMT成员通过跨质膜或液泡膜运输有机和无机阴离子，以保护细胞功能^{［参考文献 18-19}18-19］。葡萄VvALMT9除可以运输苹果酸外，还可以转运酒石酸^{［参考文献 20

百度学术}20］。Liang等^{［参考文献 21

百度学术}21］证明大豆GmALMT1是一种质膜苹果酸外流转运体，在大豆耐铝性中起关键作用。蔡冰杰^{［参考文献 22

百度学术}22］研究指出，苜蓿并非特异响应铝胁迫，镉也会诱导MsALMT1表达上调，但其表达量的高低与胁迫中镉浓度的高低并不呈明显的正相关。另有研究发现，大豆GmALMT基因家族成员对磷（Pi）饥饿反应不同，GmALMT的表达模式也有很大差异，GmALMT5可通过提高低磷土壤中少量可溶性磷源的利用来提高大豆磷效率^{［参考文献 23

百度学术}23］。对转基因大豆毛状根中GmALMT5的亚细胞定位和苹果酸分泌的分析表明，GmALMT5是介导苹果酸从根中流出的质膜蛋白。当以少量可溶性钙磷用作外部磷源时，过表达GmALMT5的转基因拟南芥的生长和磷含量都显著增加^{［参考文献 24

百度学术}24］。土壤盐分是最重要的非生物胁迫之一，可导致作物生产力下降。研究发现，在拟南芥中苹果酸可以作为信号物质在Cl^-通道中起作用，激活促进Cl^-向液泡内转运^{［参考文献 10

百度学术}10］。水稻OsALMT1参与盐胁迫和渗透胁迫的调节^{［参考文献 25

百度学术}25］。苹果MdALMT14通过促进苹果酸的积累提高植物耐盐能力^{［参考文献 13

百度学术}13］。AtALMT9主要在保卫细胞中表达，该基因编码的离子通道定位于液泡膜，控制气孔张开，研究发现，almt9突变体表现出明显的抗旱性^{［参考文献 8

百度学术}8］；在干旱胁迫下整株植物可以合成脱落酸来帮助气孔闭合，防止枯萎。almt4突变体对脱落酸的响应可以导致气孔运动，从而使almt4突变体叶片失水率升高，表现出对干旱敏感的表型^{［参考文献 26

百度学术}26］。

本研究成功克隆了前期在镉胁迫大豆甲基化差异片段中筛选得到的GmALMT33基因，并利用qRT-PCR技术分析其在大豆不同组织及镉胁迫处理后的表达水平，通过镉胁迫下转基因植株的表型分析和相关生理指标检测分析其在镉胁迫应答中的功能，以期为全面解析GmALMT33基因的作用机制和大豆耐镉品种的培育奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验所使用的大豆黑农48和烟草龙江981，均由黑龙江省农业科学院惠赠。大豆种植方法参考姜静涵等^［

27］。

1.2 试验方法

1.2.1 镉耐受性鉴定

选取大小均匀、颗粒饱满的黑农48种子，在0.1%次氯酸钠溶液中消毒5 min后用去离子水反复冲洗，将CdCl₂配制成质量分数分别为0 mg/L、6 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L的镉溶液，选取50粒黑农48种子，用不同浓度的镉溶液浸种24 h，取出浸泡过的种子，放入MS培养基中。每个处理重复3次，第3天统计发芽势，第7天统计种子发芽率，计算平均值。

1.2.2 基因表达模式分析

选取长势一致的大豆幼苗移至1/2 Hoagland 培养液中培养一周，之后在1/2 Hoagland 培养液中加入66 µmol/L CdCl₂进行溶液培养处理，分别在0 h、2 h、6 h、12 h和24 h取材大豆叶片。未经CdCl₂处理的大豆根、茎、叶进行组织表达分析。每个样品取3株，用液氮速冻后于-80℃冰箱保存备用。利用RNA提取试剂盒（OMEGA）提取镉处理的大豆叶片总RNA并反转录成cDNA。利用大豆GmALMT33基因定量引物（见表1）进行qRT-PCR扩增，内参基因为GmActin11。反应体系：2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μl；10 μmol/L GmALMT33-F1（GmActin11-F） 0.5 μl；10 μmol/L GmALMT33-R1（GmActin11-R） 0.5 μl；cDNA 1 μl；ddH₂O 8 μl。反应条件：95˚C 10 min；95˚C 30 s，59.9˚C 10 s，72˚C 4 min，40个循环后结束反应。设置3次生物学重复，运用2^-△△Ct公式对数据进行分析，确定基因的相对表达量。

表1 本研究所用引物序列

Table 1 Primers used in the study

名称 Primer name	引物序列（5'-3'） Primer sequence（5'-3'）	用途 Application
GmALMT33-F1	CGCTCTCTGATCGTGTCGTT	qRT-PCR
GmALMT33-R1	AGGGTAGCACCTATGCTGAA
GmActin11-F	CGGTGGTTCTATCTTGGCATC	内参基因
GmActin11-R	GTCTTTCGCTTCAATAACCCTA
GmALMT33-F2	GATCTAGAAATGGCCGCGAGAGTGGGGT	基因克隆
GmALMT33-R2	CTCCCGGGCCTAGCTACTTGAGCAAAGGTTG
bar-F	AGTCGACCGTGTACGTCTCC	分子鉴定
bar-R	GAAGTCCAGCTGCCAGAAAC

单下划线为Xba I内切酶识别位点，双下划线为Sma I内切酶识别位点

The single underlined portion is the Xba I endonuclease recognition site，the double underlined portion is the Sma I endonuclease recognition site

1.2.3 大豆GmALMT33基因克隆与生物信息学分析

根据前期在镉胁迫大豆甲基化差异片段中筛选出的GmALMT33基因片段，在NCBI数据库（http//www.ncbi.nlm.nih.hov/）中同源检索其基因全序列，用Premier 5.0设计引物（表1），以大豆叶片cDNA为模板进行PCR扩增。反应体系：10×Buffer 2.5 μL；10 mmol/L dNTP 2 μL；10 μmol/L GmALMT33-F2 1 μL；10 μmol/L GmALMT33-R2 1 μL；cDNA 1 μL；rTaq 2.5 μL；ddH₂O 17.25 μL。扩增程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，59.9℃ 30 s，72℃ 1.5 min，32个循环；72℃ 10 min。PCR产物纯化回收转化大肠杆菌参考彭亚男^［

28］方法，筛选的阳性克隆由上海生工生物工程有限公司完成测序。

使用NCBI的ORF finder查找开放阅读框并进行序列翻译。在NCBI上用CDD（http：//www.ncbi.nlmnih.gov/cdd/）分析GmALMT33蛋白的保守结构域。利用PSORT工具对GmALMT33蛋白进行亚细胞定位分析。将GmALMT33蛋白序列在NCBI上进行BLAST比对，选取同源性较高的部分氨基酸序列，利用MEGA7.0软件构建进化树。

1.2.4 GmALMT33基因表达载体的构建

提取测序正确的pMD-GmALMT33质粒，利用限制性内切酶Xba I和Sma I对植物表达载体pCPB进行双酶切，酶切反应体系：10×K Buffer 5 μL；0.1%BSA 5 μL；pCPB载体 25 μL；Xba I 1 μL；Sma I 1 μL；ddH₂O 13 μL。酶切条件：37℃酶切12 h。GmALMT33基因片段与pCPB载体连接，连接体系：GmALMT33 3 μL；pCPB载体片段 5 μL；T4 DNA连接酶 1 μL；10×T4 Buffer 1 μL。连接条件：16℃过夜连接。采用菌液PCR（反应体系同1.2.3）和双酶切对重组载体进行验证。

1.2.5 转GmALMT33基因烟草及大豆毛状根复合体植株的获得及鉴定

通过冻融法将pCPB-GmALMT33转入农杆菌EHA105感受态中，叶盘法^［

29］转化烟草叶片。共培养后在MS培养基上进行愈伤组织的诱导、芽的分化和生根，最终移入土壤中培养。

通过冻融法将重组植物表达载体pCPB-GmALMT33和pCPB空载体分别转化到发根农杆菌9402中。将发根农杆菌9402菌液震荡培养至OD₆₀₀= 0.7。取6~7日龄大豆幼苗在子叶节近胚轴1 cm处斜切，在子叶节近胚轴3 mm处制造伤口。将处理好的大豆外植体在重悬菌液中浸泡30 min后放置于被1/2 Hoagland营养液浸湿的滤纸上，遮光培养48 h后移栽到蛭石中，7~8天即可长出毛状根。待长出毛状根后，14 h（光照）/10 h（黑暗），光照28℃/黑暗20℃，温室培养3周。

采用CTAB法^［

30］提取转基因烟草叶片和大豆毛状根基因组DNA，用载体上的bar基因引物对转基因植株基因组DNA进行PCR扩增，反应体系同1.2.3。扩增程序为：94℃ 3 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 15 s，30个循环； 72℃ 5 min。产物经琼脂糖凝胶电泳检测。利用RNA提取试剂盒（OMEGA）提取大豆毛状根RNA，反转录获得cDNA，进行qRT-PCR鉴定，反应体系、反应条件同1.2.2。

1.2.6 转GmALMT33基因植株的功能分析

转GmALMT33基因植株抗逆表型分析　各取3株生长状态较一致的野生型和转基因烟草叶片，用直径7 mm的打孔器打孔，分别置于含有66 μmol/L CdCl₂的MS固体培养基上，于25℃，16 h（光照）/8 h（黑暗）的条件下，胁迫处理7 d，观察叶片的变化，并拍照记录，设置3次生物学重复和技术重复。选取3周龄，同一生长状态的转基因及转空载体大豆毛状根复合体植株各3株，转移至1/2 Hoagland营养液中培养一周，然后用含66 μmol/L CdCl₂的1/2 Hoagland营养液进行镉胁迫。胁迫处理7 d，拍照记录植株表型，设置3次生物学及技术重复。

转GmALMT33基因植株生理指标测定　取经含66 μmol/L CdCl₂的1/2 Hoagland溶液胁迫处理0 d、1 d、3 d的转基因及转空载体大豆毛状根复合体植株的根和叶片，进行生理指标检测。将生长一致的转基因和野生型烟草幼苗移植到土壤∶蛭石=1∶1中，待缓苗后，进行镉胁迫处理。处理组浇灌100 μmol/L CdCl₂，对照组浇灌等量的水，处理7 d。对处理7 d 的野生型和转基因烟草各3株植物叶片进行超氧化物歧化酶（SOD，superoxide dismutase）活性、抗坏血酸过氧化物酶（APX，aseorbateperoxidase）活性、丙二醛（MDA，malondialdehyde）含量等测定，生理指标测定试验每组重复3次，用SPSS对数据进行分析。

2 结果与分析

2.1 大豆黑农48镉耐受性鉴定分析

种子的发芽率是反映植物重金属胁迫的一个基本指标。不同浓度CdCl₂对黑农48种子发芽率会产生一定的抑制作用，随着CdCl₂浓度升高，抑制作用明显增强。当Cd²⁺浓度为6 mg/L时，对黑农48种子的萌发表现为刺激作用，Cd²⁺浓度达到10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、50 mg/L时，对种子萌发表现为显著的抑制作用（表2）。当种子发芽3 d时，测定发芽势，从测得的结果可以看出，黑农48种子的发芽势均随着Cd²⁺处理浓度的升高而降低（表2）。通过测定黑农48种子在镉胁迫下的发芽率和发芽势，参考其他作物镉耐受等级表明黑农48表现出对镉耐受性较弱。

表2 黑农48发芽率与发芽势

Table 2 The germination rate and germination potential of Heinong 48

指标

Target

对照

Control

处理浓度（mg/L）

Treatment concentration

发芽率（%） Germination rate

92.70

\pm

0.01^ab

94.67

\pm

0.01^ab

78.00

\pm

0.02^b

64.67

\pm

0.01^b

46.00

\pm

0.02^b

26.67

\pm

0.02^b

发芽势（%） Germination force

96.67

\pm

0.01^b

75.33

\pm

0.03^b

54.67

\pm

0.02^b

46.67

\pm

0.02^b

35.33

\pm

0.03^b

21.33

\pm

0.03^b

数据后小写字母a代表无显著差异，b代表差异显著（P<0.05）

The lowercase letter a after the data represents no significant difference， while b represents significant difference （P<0.05）

2.2 大豆不同组织和镉胁迫下GmALMT33基因的表达模式分析

qRT-PCR结果显示，GmALMT33基因在大豆根、茎、叶中均有表达，但表达模式有显著差异。GmALMT33基因的表达量在根中最高，在茎和叶中显著降低。大豆植株经66 μmol/L CdCl₂处理后，GmALMT33的表达量显著升高，其中胁迫6 h时表达量最高，是对照（0 h）的8.2倍（图2），表明GmALMT33基因在大豆响应重金属镉胁迫中可能发挥重要作用。

图1 GmALMT33基因在不同组织中的表达模式

Fig. 1 The expression patterns of GmALMT33 gene in tissue

**表示达到极显著水平（P<0.01）；*表示达到显著水平（P<0.05）；下同

** denotes highly significant level （P<0.01）； * denotes significant level （P<0.05）；The same as below

图2 GmALMT33基因在镉胁迫下的表达模式

Fig. 2 The expression patterns of GmALMT33 gene under different time of CdCl₂ stress

2.3 GmALMT33的克隆及生物信息学分析

利用GmALMT33特异引物从大豆叶片cDNA中扩增获得1770 bp的DNA片段（图3A），编码553个氨基酸，预测蛋白分子量为137 kDa，等电点（PI）4.99，为酸性蛋白。亚细胞定位预测结果表明（图3B），GmALMT33蛋白主要定位于内质网中，说明该蛋白可能参与细胞质中消耗能量较多的细胞活动。GmALMT33蛋白在67~538位氨基酸之间含有1个 ALMT结构域（图3C）。系统进化分析发现，GmALMT33蛋白与豆科植物菜豆、木豆、黧豆、相思子、豇豆、鹰嘴豆中同源蛋白在进化上处于同一分支，蛋白相似性达80%以上。其中GmALMT33与菜豆中同源蛋白亲缘关系最近（图3D），蛋白相似性为87.25%。GmALMT33蛋白同车轴草、紫花苜蓿、白羽扇豆、核桃中同源蛋白不处于同一进化分支，表明亲缘关系较远。

图3 大豆GmALMT33基因的克隆与序列分析

Fig. 3 Cloning and sequence analysis of soybean GmALMT33 gene

A：GmALMT33基因PCR扩增结果；M：DL 2000 DNA 标记；0：空白对照；1~2：GmALMT33基因；B：GmALMT33蛋白亚细胞定位预测；C：GmALMT33蛋白结构域预测；D：GmALMT33蛋白系统进化树

A： PCR amplification results of GmALMT33 gene； 0： Water control； 1-2： GmALMT33 gene； B： Prediction of GmALMT33 protein subcellular localization； C： Prediction of GmALMT33 protein structural domains； D： Phylogenetic tree of GmALMT33 protein

2.4 pCPB-GmALMT33植物表达载体构建及转基因植株的获得

借助Xba I和Sma I内切酶将GmALMT33与植物表达载体pCPB连接，重组质粒双酶切后得到1770 bp的目的基因条带（图4A），表明重组载体pCPB-GmALMT33构建成功。

图4 植物表达载体的构建及转GmALMT33基因植株的获得及鉴定

Fig.4 Construction of plant expression vectors and acquisition and characterization of transgenic GmALMT33 plants

A：pCPB-GmALMT33 的双酶切鉴定；M：DL15000 分子量标准，1：pCPB-GmALMT33 双酶切产物；B：烟草的遗传转化，Ⅰ~Ⅱ：愈伤组织的诱导和分化，Ⅲ：再生植株生根，Ⅳ：再生植株移栽；C：获得转基因毛状根大豆复合体植株；D：转GmALMT33烟草的PCR鉴定；M：DL2000 分子量标准；0：空白对照，1：阳性对照（重组质粒为模板），2：阴性对照（野生型烟草），3~9：转基因烟草；E：PCR鉴定转基因毛状根，M：DL2000 分子量标准，0：空白对照，1：阳性对照（重组质粒为模板），2：转空载体大豆毛状根，3~8：转基因毛状根；F：转基因大豆毛状根中GmALMT33基因的相对表达量

A： Dual enzyme cleavage identification of pCPB-GmALMT33； 1： pCPB-GmALMT33 dual enzyme cleavage product， B： Genetic transformation of tobacco， Ⅰ-Ⅱ： Healing tissue induction and differentiation， Ⅲ： Rooting of regenerated plants， Ⅳ： Transplantation of regenerated plants； C： Cultivation process of soybean composite plants transgenic for hairy roots； D： PCR identification of trans-GmALMT33 tobacco； 0： Blank control； 1： Positive control （recombinant plasmid as a template）， 2： Negative control（wild type tobacco）， 3-9： Transgenic tobacco； E： PCR identification of transgenic hairy root， 0： Blank control， 1： Positive control （recombinant plasmid as template）， 2：Soybean hairy roots transformed into empty carriers， 3-8：Transgenic hairy root； F：Relative expression of GmALMT33 gene in hairy roots of soybean

农杆菌侵染烟草叶片后，经共培养、愈伤组织的诱导、芽的分化、生根培养，最终移栽入土壤中，获得草胺磷抗性再生植株（图4B）。大豆种子经蛭石培养发芽，发根农杆菌侵染子叶节后，继续用蛭石培养诱导产生毛状根复合体植株，最后用营养液水培得到毛状根复合体植株（图4C）。获得的转基因烟草及大豆毛状根复合体植株，利用bar基因引物进行鉴定（图4D、4E），结果表明获得了阳性植株。

对阳性转基因大豆毛状根与转空载体毛状根进行qRT-PCR鉴定（图4F），转基因毛状根的GmALMT33基因相对表达量高于转空载体毛状根的表达量，约为2.5倍。

2.5 转GmALMT33基因植株的功能分析

2.5.1 镉胁迫下转基因植株表型分析

镉胁迫下转基因烟草植株表型分析　CdCl₂胁迫处理结果显示（图 5A），与胁迫前（0 d）相比，胁迫3 d的野生型烟草叶片即已出现轻微褪绿、黄化现象；随着胁迫时间的延长，叶片黄化、褪绿逐渐加重，至胁迫7 d，所有烟草叶片的整个叶面均明显黄化，且少数叶片出现边缘褐化现象。而转基因烟草在胁迫3 d时叶色与胁迫前（0 d）相比无变化，胁迫5 d时才出现轻度褪绿、黄化，至胁迫7 d时黄化加剧，但约一半的叶片叶面上仍保有一定的绿色。可见转基因烟草叶片黄化的时间晚于野生型，黄化的程度也低于野生型，表明GmALMT33基因能够提高转基因植株对镉胁迫的耐受性。

图5 转GmALMT33基因植株表型

Fig. 5 Phenotypic of transgenic GmALMT33 plants

A：66 μmol/L CdCl₂胁迫处理烟草叶片表型；B：66 μmol/L CdCl₂胁迫处理转基因大豆毛状根复合体表型，1~2：转空载体大豆毛状根复合体植株分别胁迫 0 d、7 d，3：转空载体大豆毛状根复合体植株胁迫 7 d 的叶片，4~5：转基因大豆毛状根复合体植株分别胁迫 0 d、7 d，6：转基因大豆毛状根复合体植株胁迫7 d 的叶片

A：66 μmol/L CdCl₂ stress-treated tobacco leaf phenotype；B：66 μmol/L CdCl₂ stress-treated transgenic soybean hairy root complex phenotype，1-2：Trans-empty vector soybean hairy root complex plants stressed for 0 d and 7 d，respectively，3：Trans-empty vector soybean hairy root complex plants stressed for 7 d，4-5：Transgenic soybean hairy root complex plants stressed for 0 d and 7 d respectively，6：Transgenic soybean hairy root complex plants stressed for 7 d in leaves

镉胁迫下转基因大豆毛状根复合体植株表型分析　CdCl₂胁迫结果显示（图5B），胁迫7 d 时，转空载体和转基因大豆毛状根复合体植株与胁迫前（0 d）相比均出现镉毒害现象，茎秆出现红褐色，并且从植株的形态学下端向上蔓延，但转空载体植株叶柄出现红褐色并蔓延至叶脉，而转基因植株叶柄处只出现少许红褐色。说明GmALMT33基因能够在一定程度上增强植株对镉胁迫的耐受性。

2.5.2 镉胁迫下转基因植株生理指标分析

镉胁迫下转基因烟草生理指标分析　由图6A可知，在正常生长条件下，野生型烟草与转基因烟草叶片SOD、APX活性、MDA、可溶性糖含量均无显著性差异。镉胁迫处理7 d后，野生型烟草与转基因烟草植株的4种生理指标均升高，其中转基因植株的APX、SOD活性、可溶性糖含量均极显著高于野生型，较野生型植株分别升高1.20%、1.05%和1.38%；MDA含量极显著低于野生型，较野生型低1.22%。

图6 转GmALMT33基因植株生理指标

Fig. 6 Physiological indexes of transgenic GmALMT33 plants

A：镉胁迫处理下转基因烟草中的APX、SOD活性和MDA、可溶性糖含量；B：镉胁迫处理下转基因大豆毛状根复合体植株根（左）和叶片（右）中的 SOD、APX活性及MDA、可溶性糖含量

A：APX，SOD activity，MDA and soluble sugar content in transgenic tobacco under cadmium stress treatment；B：SOD，APX activity，MDA and soluble sugar content in roots （left） and leaves （right） of transgenic soybean hairy root complex plants under cadmium stress treatment

镉胁迫下转基因大豆毛状根复合体植株生理指标分析　由图 6B可知，在正常生长条件下，转空载体与转基因毛状根复合体植株根和叶中SOD、APX活性、MDA、可溶性糖含量均无显著差异。镉胁迫处理后，二者的根和叶中SOD、APX活性均持续升高，但转基因植株应答更强烈，两种酶活性均高于对照，且SOD活性差异显著。MDA含量在胁迫后均持续升高，但转基因植株根和叶中MDA含量极显著低于转空载体植株。转基因植株和对照植株根和叶中可溶性糖含量在胁迫后均升高，且转基因植株可溶性糖含量始终高于对照，在根中达到了极显著水平。胁迫1 d时和 3 d时，转基因植株毛状根SOD活性分别比对照升高50.65 %、7.50%；APX活性分别比对照升高14.18%、14.12%；MDA含量分别比对照降低32.53%、25.31%；可溶性糖含量分别比对照升高60.89%、30.00%。胁迫1 d时和 3 d时，转基因植株叶片SOD活性分别比对照升高54.96 %、50.46 %；APX活性分别比对照升高17.25%、16.44 %；MDA含量分别比对照降低71.77%、49.25%；可溶性糖含量分别比对照升高13.28%、8.20%。

3 讨论

铝激活苹果酸转运体基因家族广泛存在于陆生植物体内，在植物有机酸的跨膜转运中起着重要作用。目前对ALMT基因家族成员的功能研究涉及其增强植物对重金属镉胁迫的耐受性^［

31-32］、有机酸的运输和气孔开闭^{［参考文献 33

百度学术}33］等。在众多植物中，ALMT基因家族在拟南芥、紫花苜蓿和小麦等作物中有较为广泛深入的研究，但在大豆中研究相对较少。大豆是全球重要的农作物，是植物油和优质蛋白的重要来源。为探究豆科植物中ALMT基因家族的功能及其在重金属镉胁迫下的表达模式，本研究以GmALMT33基因为研究对象，对其在镉胁迫中的功能进行了探讨。

蛋白的结构及其在细胞中的定位与其功能紧密相关。有研究表明ALMT作为一类相对保守的蛋白，其大多数家族成员都含有一个或多个 PF11744结构域，二级结构预测结果也表明大多数ALMT蛋白在N端含有5~7个疏水跨膜结构域，在C端含有亲水区^［

34］。本研究成功克隆了GmALMT33基因，生物信息学分析表明，该基因编码的蛋白属于酸性、亲水性蛋白，无信号肽，亚细胞定位预测结果显示ALMT33主要定位于内质网和线粒体中，含有ALMT结构域，符合ALMT家族的结构特征。在其他作物中，也有相似的研究结果。拟南芥AtALMT9定位于液泡膜，参与细胞内苹果酸平衡的调节^{［参考文献 35

百度学术}35］；小麦TaALMT1含有6个跨膜结构域，定位于细胞膜，参与苹果酸的外排以增加植物铝耐受性^{［参考文献 18

百度学术}18］；苹果MdALMT13含有5个跨膜结构域，也定位于细胞膜^{［参考文献 36

百度学术}36］；番茄SlALMT5定位于内质网中^{［参考文献 37

百度学术}37］，而番茄SlALMT9定位于液泡膜中，SlALMT5与种子中苹果酸含量有关，SlALMT9具有果实苹果酸调控和根系耐铝毒的双重功能^{［参考文献 38

百度学术}38］。GmALMT33基因编码蛋白预测其定位于内质网中，推测其通过参与细胞内苹果酸的外排来参与大豆镉响应以及一定程度上减轻镉离子对根系的毒害。

基因的时空表达特异性也与基因的功能直接相关。有研究证明ALMT基因多在根系或叶片中特异性表达^［

39］。本研究获得的GmALMT33基因在大豆根、茎、叶中均有表达，且在根中表达量显著高于茎和叶。镉胁迫后GmALMT33基因的表达水平显著上调，这与苜蓿MsALMT1基因受镉胁迫后的表现相似^{［参考文献 40

百度学术}40］，MsALMT1在受到镉胁迫时基因表达量显著上调。推测GmALMT33基因在大豆抵御镉胁迫中发挥重要作用。

Taoufik等^［

41］研究表明，镉会破坏光收集复合体II和光系统I、II，阻碍光合作用的光化学反应和羧化反应，破坏叶绿体代谢。GmALMT33基因转化烟草和大豆毛状根表型分析显示，当处于镉胁迫环境中，野生型和转基因烟草叶片受镉毒害出现褪绿、黄化等现象，说明镉胁迫能造成叶绿素合成的受阻，但转基因烟草叶片生长未受到抑制，而野生型烟草生长则相反；同样的，镉胁迫处理后，转空载体和转基因大豆复合体植株的茎秆和叶脉均呈现红褐色的镉毒害症状，但转基因植株叶柄的褐化症状没有和野生型一样向叶脉蔓延，受镉毒害程度弱于转空载体对照。遗传转化的结果均证明GmALMT33基因能够在一定程度上稳定植株体内的稳态，降低镉对植株的损伤，提高植株对镉胁迫的耐受性。

在重金属胁迫下，植物已经发展出各种防御机制来减轻氧化应激的影响，包括活性氧解毒酶，如超氧化物歧化酶、抗坏血酸过氧化物酶、过氧化氢酶和谷胱甘肽还原酶，以及低分子量抗氧化剂，如抗坏血酸、谷胱甘肽、类胡萝卜素和金属硫蛋白^［

42］。为评价GmALMT33 基因在植物镉胁迫应答中的生理机制，本研究对大豆毛状根复合体植株的根和叶片进行了SOD、APX活性及可溶性糖、MDA含量的检测，重金属胁迫会导致植物生成大量的活性氧，使膜脂过氧化而产生MDA，因此MDA含量的高低在一定程度上能反映脂膜过氧化程度^{［参考文献 43

百度学术}43］。而植物体内的抗氧化酶则会清除活性氧，减轻重金属对植物的毒害作用^{［参考文献 44

百度学术}44］。SOD、APX是清除植物体内活性氧的重要防御酶，是植物活性氧清除机制的重要组成部分。有研究证明转MdALMT13的苹果植株经盐或碱处理后根中SOD、POD活性均显著高于野生型，可以通过提高抗氧化酶活性提高植物的耐盐和耐碱性。本研究中，当处于镉胁迫时，转基因烟草叶片及大豆毛状根复合体植株叶片和根的SOD、APX活性均高于对照，表明GmALMT33基因的表达可调节抗氧化酶活性，降低镉对植株的氧化毒害。渗透调节物质的积累也是植物抵御一些非生物胁迫的重要方式。可溶性糖广泛参与渗透调节，其含量越高，植物在逆境下细胞失水的可能性越小，对逆境的抵御能力越强。本研究发现GmALMT33基因的转入可以提高植株可溶性糖的积累，因而降低了镉毒造成的渗透损伤，这也是增强植株对镉耐受性的重要原因。

GmALMT33基因在大豆应对镉胁迫中发挥了重要的调控作用，能够在一定程度上提高植株的耐镉能力，但其具体的作用机制还有待后续进一步研究。

4 结论

克隆获得GmALMT33基因，该基因在大豆根、茎、叶中均有表达，但在根中表达水平最高，同时该基因被镉胁迫诱导显著上调表达。镉胁迫下转基因烟草及转基因大豆毛状根复合体植株表型及生理分析结果进一步说明GmALMT33基因可以提高植株对镉的耐受性。

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