利用<bold>ML-GWAS</bold>解析玉米籽粒含水量相关性状的遗传基础

胡芳林; 赵永锋; 朱彦辉; 李真; 贾晓艳; 郭晋杰; 祝丽英; HU Fanglin; ZHAO Yongfeng; ZHU Yanhui; LI Zhen; JIA Xiaoyan; GUO Jinjie; ZHU Liying

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1. 河北农业大学农学院/国家玉米改良中心河北分中心/河北省作物种质资源重点实验室，保定 071001； 2. 石家庄市农林科学研究院，石家庄 050800

最近更新：2024-07-04

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231218003

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摘要

玉米成熟期籽粒含水量（KMC，kernel moisture content）是影响玉米机械化粒收的关键因素，利用多位点全基因组关联分析（ML-GWAS，multi-locus genome-wide association study）挖掘与籽粒含水量相关性状显著关联的遗传位点，解析其遗传基础，可为适机收玉米品种的选育和遗传改良提供参考。本研究以205份玉米自交系为材料，在4个环境下测定成熟期籽粒、苞叶与穗轴的含水量，使用mrMLM、FASTmrMLM、FASTmrEMMA、pLARmEB、pKWmEB和ISIS EM-BLASSO 6种多位点关联分析方法结合分布于全基因组的76492个单核苷酸多态性位点（SNP，single nucleotide polymorphism）进行关联分析，挖掘其候选基因并进行基因注释。表型分析显示，205份材料的籽粒含水量相关性状的变异系数在10.47%~33.90%，广义遗传率在67.39%~81.24%。6种ML-GWAS方法共检测到26个、15个和23个SNP位点分别与籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量显著关联；其中3种及以上方法共同检测到14个显著关联SNP位点，表型贡献率（PVE，phenotypic variation explained）在1.13%~17.21%。6种方法中pLARmEB检测到的显著位点最多，FASTmrEMMA检测到的最少。基于3种及以上方法共同检测到且平均PVE≥5%的显著SNP位点为Chr1_9232728、Chr4_176596174、Chr8_57716249和Chr5_191021635，在这4个SNP位点上下游220 kb共挖掘到17个候选基因，主要富集到细胞解剖实体、新陈代谢过程和细胞进程与催化活性，推测这些基因通过调节细胞代谢与催化活性最终影响玉米籽粒、苞叶和穗轴的含水量。

关键词

玉米; 关联分析; 籽粒含水量; 苞叶含水量; 穗轴含水量

玉米是我国种植面积最大的作物^［

1］，随着劳动力的减少，玉米生产全程机械化成为农业发展的必然趋势，然而我国玉米生产中收获期籽粒含水量较高普遍存在，籽粒机收易造成籽粒破碎，严重制约了玉米籽粒机械化收获^{［参考文献 2

百度学术}2］。因此，选育成熟期籽粒含水量低的玉米品种已成为玉米育种工作的重点目标。玉米籽粒含水量是多基因控制的数量性状，其遗传基础复杂。研究发现玉米的苞叶性状、穗部性状均会影响成熟期玉米籽粒的含水量^{［参考文献 3-4}3-4］。姚凌翔^{［参考文献 5

百度学术}5］利用257份玉米自交系材料，基于4.7万个SNP的基因型信息，使用混合线性模型（MLM，mixed linear model），探索与玉米果穗脱水相关的性状位点，定位到2个与苞叶层数有关的显著位点SNP7441和SNP25777。李露露等^{［参考文献 6

百度学术}6］使用242份重组自交系，测定玉米成熟后籽粒含水量以及苞叶数、苞叶长等性状，共检测到15个相关QTL。吕晨曦^{［参考文献 7

百度学术}7］利用290份玉米自交系，基于13697个高质量SNP标记，使用广义线性模型（GLM，generalized linear model）和MLM模型，定位到9个与成熟期籽粒含水量相关的SNP位点，筛选到4个候选基因。党冬冬^{［参考文献 8

百度学术}8］使用522份玉米自交系，通过关联分析定位到与玉米籽粒成熟期含水量显著关联的3个SNP位点，筛选到7个有功能注释的候选基因。Li等^{［参考文献 9

百度学术}9］以低含水量的Si287和高含水量的JiA512构建的120个双单倍体（DH，doubled haploid）为群体，利用全基因组复合区间作图（GCIM，genome-wide composite interval mapping）和多位点随机SNP效应混合线性模型（mrMLM，multi-locus random-snp-effect mixed linear model）分别检测到10个QTL和27个SNP位点与籽粒含水量有关。

单位点关联分析显著性的判断大多采用较为严格的矫正方法，从而导致一些效应较小的位点被淘汰。针对这一问题开发的多位点全基因组关联分析（ML-GWAS，multi-locus genome-wide association study）方法，它的优势是先用一个比Bonferroni略宽松的标准筛选SNP，然后用多位点遗传模型分析，不需要多次校正^［

10］，已被证明对数量性状核苷酸（QTNs，quantitative trait nucleotides）的检测具有更高的功效和准确性。Cui等^{［参考文献 11

百度学术}11］使用6种ML-GWAS方法（mrMLM、FASTmrMLM、FASTmrEMMA、pLARmEB、pKWmEB、ISIS EM-BLASSO）对478份水稻种子萌发期耐盐性状进行分析，共检测到371个QTNs，其中56个至少被3种方法同时定位到。Zhang等^{［参考文献 12

百度学术}12］利用4种ML-GWAS方法（mrMLM、FASTmrEMMA、ISIS EM-BLASSO、pLARmEB）鉴定到423个与玉米抗倒性状相关的QTNs，并报道了该方法的可靠性和互补性。然而，目前利用多种ML-GWAS方法解析玉米籽粒含水量相关性状遗传基础的研究还鲜见报道。

本研究以205份玉米自交系为关联群体，使用6种ML-GWAS方法对籽粒、穗轴及苞叶含水量进行关联分析，检测与其显著关联的SNP位点，筛选低含水量的基因型，进一步挖掘其候选基因，为分子标记辅助选育适机械化粒收玉米品种提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究使用的205份玉米自交系，来自国家玉米改良中心河北分中心，分别于2017年和2018年在河北保定（115.47°E，38.87°N）和河北辛集（115.29°E，37.83°N）种植。田间试验均采用随机完全区组试验设计，2行区，行长4 m，行距0.6 m，种植密度为 67500 株/hm²，2次重复。保定播种时间为5月上旬，辛集播种时间为6月中旬。田间管理与当地大田生产管理一致。

1.2 表型测定与分析

选取行内整齐一致的单株，吐丝前和散粉前分别对雌穗和雄穗进行套袋隔离。待一个自交系有10株以上吐丝和散粉后挑选长势一致的植株自交授粉。调查每个自交系的成熟期，待其籽粒黑层形成时，每个自交系选取5个长势一致的果穗。首先剥苞叶，测定苞叶鲜重；然后脱粒，取果穗中部100粒称重记为籽粒鲜重；再测定穗轴鲜重；将称重后的苞叶、籽粒和穗轴在105 ℃下烘30 min杀青，然后80 ℃下烘干至恒重，测定籽粒、苞叶和穗轴的干重^［

13］。

使用Microsoft Excel 2021对两年两点4个环境下玉米籽粒、苞叶和穗轴的鲜重和干重数据进行整理并计算籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量。计算公式如下：含水量（%）=（鲜重-干重）/鲜重×100%^［

1］。

使用IBM SPSS Statistics 26对4个环境下的含水量数据进行描述统计和方差分析。使用R语言（https：//cran.r-project.org/）平台下的GGally软件包计算相关系数并绘图^［

14］。参照Knapp等^{［参考文献 15

百度学术}15］的方法计算广义遗传率，计算公式如下：H_B²=σ²_g/（σ²_g+σ²_ge/n+σ²_e/nr），其中σ²_g为遗传方差，σ²_ge为基因型与环境互作方差，σ²_e为随机误差方差，n为环境数，r为每个试验环境中的重复次数。使用lme4软件包中的混合线性模型进行最佳线性无偏估计（BLUE，best linear unbiased estimation）值的计算^{［参考文献 16

百度学术}16］。

1.3 基因型测序与分析

利用CTAB法提取205份玉米自交系叶片DNA，采用Illumina标准流程进行双末端 100 bp 测序，将测序所得有效数据对比到B73RefGen_v4基因组上^［

17］。使用plink v1.9软件对基因型数据质控，去除缺失率>0.2和最小等位基因频率（MAF，minor allele frequency）<0.05的位点后共获得76492个SNP标记。过滤后的基因型数据使用beagle_5.4软件进行填补，生成用于GWAS分析的基因型文件^{［参考文献 18

百度学术}18］。

1.4 全基因组关联分析

使用R语言平台下的mrMLM.GUI_V4.02软件包对76492个SNPs和各性状的BLUE值进行GWAS分析，使用软件包内置的mrMLM、FASTmrMLM、FASTmrEMMA、pLARmEB、pKWmEB和ISIS EM-BLASSO 6种方法，采用Q+K模型，其中亲缘关系K矩阵由软件计算，群体结构Q矩阵由admixture软件计算，显著性阈值使用软件默认值LOD=3，其他设置均为默认值^［

19］。

1.5 候选基因挖掘

使用plink v1.9软件对填补后的基因型文件进行连锁不平衡（LD，linkage disequilibrium）分析，以r²=0.2时的衰减距离作为候选基因的筛选范围^［

20］。在maizeGDB （https：//www.maizegdb.org/）网站的B73RefGen_v4参考基因组中查找候选基因。使用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、GO（http：//www.geneontology.org/）数据库网站查询相关基因的信息。根据玉米B73籽粒动态发育转录组数据^{［参考文献 21

百度学术}21］分析籽粒含水量相关基因的表达情况。

2 结果与分析

2.1 籽粒含水量相关性状的描述统计分析

对4个环境下籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量数据进行描述统计分析（表1），结果显示205份自交系的3个含水量性状存在广泛变异，变异系数在10.47%~33.90%。3个性状中，苞叶含水量的变异系数最大。除2017辛集环境的籽粒含水量外，其他环境下的3个含水量性状相关数据的偏度和峰度的绝对值均小于等于1，表明这些性状在多数环境下服从正态分布。

表1 籽粒、苞叶与穗轴含水量描述统计分析

Table 1 Descriptive statistical analysis of moisture content of kernel，husk and cob

性状 Traits	环境 Environment	范围 Range	均值±标准差 Mean±SD	偏度 Skewness	峰度 Kurtosis	变异系数（%） CV
籽粒含水量（%）KMC	17BD	10.83~39.69	26.86±7.04	-0.22	-0.74	26.21
	17XJ	17.63~48.57	38.01±4.80	-1.14	2.96	12.62
	18BD	13.01~41.18	25.57±6.39	0.22	-0.56	24.98
	18XJ	15.80~46.99	35.40±5.66	-0.87	0.97	15.98
	BLUE	15.29~44.15	31.28±4.85	-0.26	0.29	15.51
苞叶含水量（%）HMC	17BD	13.94~63.52	38.04±12.82	0.21	-1.00	33.70
	17XJ	20.71~72.58	45.35±12.85	-0.02	-1.11	28.34
	18BD	12.21~67.81	35.31±11.97	0.10	-0.69	33.90
	18XJ	16.32~68.18	41.27±12.70	0.23	-0.66	30.76
	BLUE	16.78~67.11	39.66±10.39	0.07	-0.64	26.20
穗轴含水量（%）CMC	17BD	16.59~85.40	58.42±14.64	-0.78	0.05	25.06
	17XJ	37.26~82.14	66.00±7.23	-0.69	1.53	10.95
	18BD	15.57~78.28	54.03±13.60	-0.67	0.11	25.18
	18XJ	41.05~81.28	65.39±6.85	-0.70	0.85	10.47
	BLUE	28.57~87.32	60.87±8.46	-0.63	1.07	13.90

17BD： 2017年保定； 17XJ： 2017年辛集； 18BD： 2018年保定； 18XJ： 2018年辛集； BLUE：最佳线性无偏估计；下同

17BD： 2017 Baoding； 17XJ： 2017 Xinji； 18BD： 2018 Baoding； 18XJ： 2018 Xinji； KMC： Kernel moisture content； HMC： Husk moisture content； CMC： Cob moisture content； BLUE： Best linear unbiased estimation；The same as below

2.2 籽粒含水量相关性状的方差分析

对4个环境下籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量的数据分别进行联合方差分析（表2），3个含水量性状基因型间差异、环境间差异及基因型与环境互作均达到极显著水平，籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量的广义遗传率分别为78.06%、81.24%和67.39%，说明这3个含水量性状同时受遗传因素和环境影响，遗传因素的影响相对更大。

表2 籽粒、苞叶和穗轴含水量的联合方差分析

Table 2 Joint analysis of variance for kernel，husk and cob moisture content

性状 Traits	F值 F-value				广义遗传率（%） Broad-sense heritability
性状 Traits	区组 Block	环境 Environment	基因型 Genotype	基因型 × 环境 Genotype×Environment	广义遗传率（%） Broad-sense heritability
籽粒含水量（%）KMC	2.09	465.46^**	6.10^**	1.52^**	78.06
苞叶含水量（%）HMC	0.70	60.99^**	8.06^**	1.71^**	81.24
穗轴含水量（%）CMC	0.02	136.62^**	5.77^**	2.00^**	67.39

*和** 分别表示在 0.05和 0.01水平上差异显著，下同

* and ** indicate significant differences at the levels of 0.05 and 0.01，respectively，the same as below

2.3 籽粒含水量相关性状的相关分析

对籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量的BLUE值进行相关性分析（图1），结果表明这3个性状两两之间均呈极显著正相关，其中籽粒含水量与穗轴含水量间的相关系数最大，为0.81。表明这3个含水量性状相互影响，而成熟期穗轴含水量与籽粒含水量的相关最为密切。

图1 籽粒、苞叶和穗轴含水量BLUE值的相关性分析

Fig.1 Correlation analysis of BLUE values of kernel，husk and cob moisture content

籽粒、苞叶和穗轴含水量箱线图、频率分布直方图与曲线图、性状间散点图：频率分布曲线图纵坐标为数据所占比例，横坐标为含水量；散点图横纵坐标为相对应性状的含水量；频率分布直方图纵坐标为数量，横坐标为含水量；箱线图纵坐标为含水量

The box plots，frequency distribution histograms，curve graphs and scatter plot for KMC，HMC，and CMC： The y-axis of the frequency distribution curve graph represents the proportion of the data，while the x-axis represents the moisture content；In the scatter plots，both the x-axis and y-axis correspond to the moisture content of the respective traits；The y-axis of the frequency distribution histogram represents the quantity，and the x-axis represents the moisture content； In the box plot，the y-axis represents the moisture content

2.4 籽粒含水量相关性状的全基因组关联分析

使用mrMLM.GUI软件包中的6种方法对籽粒含水量、苞叶含水量和穗轴含水量的BLUE值进行多位点GWAS分析，检测到与籽粒含水量、苞叶含水量、穗轴含水量显著关联的SNP位点分别为26个、15个和23个（图2），分布在1~10号染色体上。6种ML-GWAS方法FASTmrEMMA、FASTmrMLM、ISIS EM-BLASSO、mrMLM、pKWmEB和pLARmEB分别检测到8个、22个、22个、17个、23个和24个显著SNP位点。不同方法检测到的显著SNP位点数量有较大差异，其中FASTmrEMMA检测到的显著位点最少，pLARmEB检测到的显著位点最多（图3）。

图2 籽粒、苞叶和穗轴含水量曼哈顿图

Fig. 2 Manhattan plot of kernel，husk and cob moisture content

A：籽粒含水量；B：苞叶含水量；C：穗轴含水量。浅绿和浅蓝色为不显著位点，蓝色为1种方法定位到的显著位点，粉色为2种方法共同检测到的位点，深绿色为3种方法共同检测到的位点，紫色为4种方法共同检测到的位点，红色为5种方法共同检测到的位点，黑色为6种方法共同检测到的位点。两种及以上方法共同检测到的位点LOD值为不同方法相近LOD的均值。三种及以上方法检测到的位点分别用对应的颜色在图上标明了具体位点

A： Kernel moisture content； B： Husk moisture content； C： Cob moisture content. Light green and light blue are insignificant loci，blue is the significant loci localized by one method，pink is the loci detected by two methods，dark green is the loci detected by three methods，purple is the loci detected by four methods，red is the loci detected by five methods together，and black is the loci detected by six methods together. The significance of loci detected by two or more methods is the mean of the similar LOD of different methods. The loci detected by three or more methods are marked with corresponding colors on the graph

图3 不同ML-GWAS方法检测到的显著位点数量

Fig. 3 Number of significant loci detected by different ML-GWAS method

3种及以上方法共同检测到的SNP位点有14个（表3），其中6个与籽粒含水量显著关联，表型贡献率为1.65%~13.09%；2个与苞叶含水量显著关联，表型贡献率为2.21%~9.40%；6个与穗轴含水量显著关联，表型贡献率为1.13%~17.21%。14个显著SNP位点中，分布在1号和10号染色体上各3个，2号、4号和6号染色体各2个，5号和8号染色体上各1个。

表3 3种及以上方法共同检测到的显著SNP

Table 3 Significant SNPs co-detected by three and more methods

性状 Traits	关联位点 SNP	Bin	LOD	表型贡献率（%） PVE	ML-GWAS方法 ML-GWAS method
籽粒含水量 KMC	Chr10_2640900	10.01	3.87~4.70	2.35~4.09	1，2，5
	Chr1_253390359	1.08	3.30~6.50	3.55~5.88	2，4，5
	Chr4_176596174	4.07	3.33~8.80	3.37~13.09	1，2，3，6
	Chr4_192913849	4.08	3.34~5.91	2.02~6.25	1，2，4，5
	Chr1_62415898	1.04	3.33~9.18	1.65~4.79	1，2，3，4，5
	Chr6_108012658	6.04	3.92~5.50	3.01~6.92	1，2，3，4，5
苞叶含水量 HMC	Chr10_2640900	10.01	3.03~4.48	2.21~5.54	2，3，5，6
	Chr1_9232728	1.01	3.06~7.09	3.52~9.40	1，2，3，4，5，6
穗轴含水量 CMC	Chr10_84830865	10.03	3.33~4.54	1.13~4.14	2，4，5
	Chr2_110828978	2.05	3.69~6.80	2.30~6.41	3，5，6
	Chr6_152941834	6.05	3.03~5.95	1.90~4.86	1，2，5
	Chr8_57716249	8.03	6.64~9.46	3.58~17.21	1，2，5，6
	Chr5_191021635	5.05	4.11~5.27	1.22~11.42	1，4，5，6
	Chr2_213305770	2.08	3.70~8.15	2.49~5.34	1，2，3，5

1： mrMLM； 2： FASTmrMLM； 3： ISIS EM-BLASSO； 4： FASTmrEMMA； 5： pLARmEB； 6： pKWmEB；PVE：Phenotypic variation explained；The same as below

对比分析不同性状定位结果，发现籽粒含水量与苞叶含水量有2个共位点Chr1_253390359和Chr10_2640900，其中Chr10_2640900被3种方法同时检测到与籽粒含水量显著关联，被4种方法同时检测到与苞叶含水量显著关联。籽粒含水量与穗轴含水量有3个共位点Chr2_110828978、Chr2_213305770和Chr6_108012658（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20231218003，附表1）。

2.5 等位基因变异效应分析

对3种及以上方法共同检测到的14个显著SNP位点进行等位基因分析（图4）。按照位点单倍型将表型数据分为两类进行T检验，结果显示除籽粒含水量相关的位点Chr10_2640900与穗轴含水量相关的位点Chr6_152941834、Chr8_57716249外，其余11个SNP位点的两类单倍型的表型数据间差异均达显著或极显著水平。各位点含水量低的单倍型即为该位点的有利等位基因。

图4 显著SNP不同等位基因的表型差异分析

Fig.4 Analysis of phenotypic difference in different alleles of significant SNPs

n代表该单倍型样本数量；ns表示在0.05水平不显著；***表示在0.001水平上差异显著

n represents the number of that haplotype； ns indicate not significant differences at the level of 0.05； *** indicate significant differences at the levels of 0.001

2.6 籽粒含水量相关性状的候选基因挖掘

本研究筛选同时由3种及以上方法共同检测到且平均表型贡献率≥5%的显著SNP位点^［

22］，用于挖掘玉米籽粒含水量相关性状的候选基因。根据r²=0.2时的衰减距离确定基因的筛选范围为上下游220 kb。通过综合SNP信息和基因注释信息，共鉴定出17个候选基因（表4）。其中苞叶含水量相关位点筛选出7个候选基因，包含编码锌指蛋白、60S核糖体蛋白、ABC转运蛋白MRP4、相互作用蛋白RPM1、谷氨酸-tRNA连接酶、SBT1.2亚基蛋白酶和转录因子MYB2。籽粒含水量相关位点筛选出5个候选基因，包括编码丝氨酸蛋白、锌指结构域超家族蛋白、钙调神经磷酸酶、β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶II和DNA复制许可因子MCM5。穗轴含水量的2个位点共筛选出5个候选基因，包括编码呼吸氧化酶同源蛋白、未知功能蛋白（DUF640）、酪蛋白激酶家族蛋白、细胞壁相关受体激酶5和转录因子Myb4。

表4 3种及以上方法共定位SNP挖掘的候选基因

Table 4 Candidate genes identified from significant SNPs co-detected by three and more methods

性状 Traits	SNP标记 SNP marker	平均表型贡献率（%） Average PVE	候选基因 Candidate gene	基因注释 Gene annotation
苞叶含水量 HMC	Chr1_9232728	7.32	Zm00001d027622	锌指（C3HC4型RING指）家族蛋白
			Zm00001d027623	MYB2转录因子
			Zm00001d027618	60S核糖体蛋白L21
			Zm00001d027612	谷氨酸-tRNA连接酶
			Zm00001d027627	SBT1.2亚基蛋白酶
			Zm00001d027625	ABC转运蛋白C家族MRP4
			Zm00001d027616	RPM1相互作用蛋白13
籽粒含水量 KMC	Chr4_176596174	7.24	Zm00001d052021	DNA复制许可因子MCM5
			Zm00001d052020	β-1，2-N-乙酰葡糖胺基转移酶II
			Zm00001d052010	钙调神经磷酸酶B亚基
			Zm00001d052019	假定的RING锌指结构域超家族蛋白
			Zm00001d052015	丝氨酸蛋白
穗轴含水量CMC	Chr8_57716249	9.25	Zm00001d009349	假定的呼吸爆发氧化酶同源蛋白H
	Chr5_191021635	6.21	Zm00001d017263	假定的未知功能蛋白（DUF640）
			Zm00001d017261	假定的酪蛋白激酶家族蛋白
			Zm00001d017268	Myb相关蛋白质Myb4
			Zm00001d017264	细胞壁相关受体激酶5

GO分类结果显示这17个基因中有6个主要富集在细胞解剖实体，4个富集在新陈代谢过程，4个富集在细胞进程和催化活性（图５A），这些基因产物通过调节细胞代谢与催化活性最终影响玉米籽粒、苞叶和穗轴的含水量。

图5 候选基因的富集分析和动态表达分析

Fig.5 Enrichment and dynamic expression analysis of candidate genes

A：候选基因富集分类结果，BP：生物过程，MF：分子功能；CC：细胞组分；B：17个候选基因在玉米23个组织中的表达量；C：5个候选基因在籽粒发育0~38 d的表达量

A： Candidate gene enrichment classification results，BP： Biological process； MF： Molecular function； CC： Cellular component；B： The expression levels of 17 candidate genes across 23 tissues in maize，DAP：Days after pollination；C： The Expression of five candidate genes on 0-38 d of seed development

结合玉米自交系B73基因表达数据分析，发现这17个候选基因在玉米23个组织中的表达量存在较大差异（图5B）。穗轴含水量相关基因（除Zm00001d017261外）表达量普遍较低，籽粒含水量相关基因在不同部位的表达也存在差异，苞叶含水量相关的2个基因Zm00001d027618和Zm00001d027612在各个组织表达最活跃。

进一步分析5个籽粒含水量候选基因（Zm00001d052010、Zm00001d052019、Zm00001d052021、Zm00001d052020和Zm00001d052015）在籽粒发育不同阶段的表达情况（图５C），结果表明，这5个候选基因在授粉后籽粒发育的0~38 d内表达存在显著差异。特别是Zm00001d052010在籽粒发育的28~38 d表达量显著增加，而Zm00001d052019在籽粒发育的0~20 d相对较高。相比之下，Zm00001d052021、Zm00001d052020和Zm00001d052015在0~38 d期间表达量较低，且变化不大。

3 讨论

3.1 GWAS定位结果的比较

玉米籽粒含水量是多基因控制的数量性状，其遗传基础复杂。本研究定位结果显示，籽粒、苞叶和穗轴含水量分别检测到26个、15个和23个显著位点。其中，籽粒含水量位点Chr10_2640900与李文强^［

23］定位到的授粉后第52天籽粒含水量相关位点Chr10_3167875位于同一Bin区域；Chr1_253390359与授粉后第46天籽粒含水量相关位点Chr1_228555720位于同一Bin区域。苞叶含水量相关的位点Chr1_9232728与张磊^{［参考文献 24

百度学术}24］关于籽粒脱水速率研究中第五周含水量QTL位点qFwc1-1位于同一Bin区域。穗轴含水量相关的位点Chr5_191021635与刘显君等^{［参考文献 25

百度学术}25］关于玉米成熟期脱水速率的研究中挖掘的籽粒含水量QTL位点qKdr-5-1区段重叠。

另外，苞叶性状、穗轴性状及叶片性状均会对成熟时籽粒含水量产生影响。本研究中相关分析表明籽粒含水量与苞叶含水量、穗轴含水量之间存在显著相关性。通过关联分析，发现籽粒含水量与苞叶含水量有2个共位点Chr1_253390359和Chr10_2640900，籽粒含水量与穗轴含水量有3个共位点Chr2_110828978、Chr2_213305770和Chr6_108012658，进一步从遗传基础上说明籽粒含水量与苞叶含水量和穗轴含水量存在显著相关性，这与Zhang等^［

1］关于籽粒和穗轴含水量研究的结果一致。因此，为实现成熟期低籽粒含水量的育种目标，研究苞叶和穗轴性状对籽粒含水量的影响显得尤为重要。

3.2 不同ML-GWAS方法的比较

An等^［

26］在玉米穗行数研究中同时采用了单位点和多位点GWAS方法进行关联分析，发现多位点模型检测到的显著位点数量多于单位点模型。对于多基因控制的数量性状，挖掘更多位点对全基因组选择育种的效率有显著提升。Zhang等^{［参考文献 27

百度学术}27］、Wen等^{［参考文献 28

百度学术}28］、Liu等^{［参考文献 29

百度学术}29］对多种GWAS模型的研究也表明，多位点模型在检测复杂数量性状时能提供较高的检测效率并保持准确性。

本研究发现不同ML-GWAS方法对玉米籽粒含水量相关性状的检测效力存在差异。pLARmEB检测到的位点最多，而FASTmrEMMA检测到的位点数量最少。在6种GWAS方法中，mrMLM方法提高了检测小效应基因位点的能力，但可能会出现过拟合问题^［

30］。FASTmrMLM通过实施最小角回归算法解决了mrMLM的过拟合问题^{［参考文献 31

百度学术}31］。FASTmrEMMA采用近似算法来加速计算，可能遗漏一些真正的QTNs^{［参考文献 28

百度学术}28］。pLARmEB结合了多基因位点分析和经验贝叶斯方法，提高了罕见变异与性状关联的检测能力^{［参考文献 27

百度学术}27］。pKWmEB结合了多性状分析、亲缘关系权重和经验贝叶斯方法，提高了对复杂性状相关基因位点的检测能力，尤其是在处理大规模数据集时^{［参考文献 32

百度学术}32］。ISIS EM-BLASSO结合了工具变量和稀疏贝叶斯回归技术，对复杂性状相关基因位点的检测能力得到加强^{［参考文献 33

百度学术}33］。结合前人研究发现，对于不同性状，不同GWAS方法挖掘的位点数量存在较大差异。如Xu等^{［参考文献 4

百度学术}4］关于玉米淀粉糊化特性的研究中发现FASTmrEMMA检测到的位点最多，GEMMA检测到的位点最少。Zhang等^{［参考文献 12

百度学术}12］在玉米抗倒性状GWAS研究中发现ISIS EM-BLASSO方法检测到的显著位点最多。结合前人定位结果，发现与含水量相关的位点大多集中在1号^{［参考文献 25

百度学术}25］、5号^{［参考文献 7

百度学术}7］和6号染色体^{［参考文献 26

百度学术}26］，QTL定位结果和GML、MLM等单位点GWAS模型很少检测到9号、10号染色体上与成熟期含水量相关的位点。本研究使用6种ML-GWAS方法检测到含水量相关基因在10条染色体上均有分布^{［参考文献 34

百度学术}34］，其中1号染色体上显著位点数量最多，为13个，9号、10号染色体上分别有1个和6个显著位点，这表明多位点关联分析方法更适合挖掘微效多基因。对于这3个含水量性状，pLARmEB方法检测到更多位点，可以为后续开展分子标记辅助育种以及全基因组选择提供更多参考位点。

3.3 候选基因分析

为确保挖掘位点的可靠性，本研究筛选了至少被3种多位点 GWAS方法共同检测到的显著位点，并根据表型贡献率≥5%进一步筛选显著位点后，查找影响玉米籽粒、穗轴和苞叶含水量的基因。在苞叶含水量显著位点Chr_9232728附近发现编码锌指家族蛋白的Zm00001d027622基因。前人研究表明该家族成员作为RNA结合蛋白，在mRNA加工过程中具有调节功能，并参与非生物和生物应激，调节植物的生长发育^［

35］。Zm00001d027623编码的MYB2转录因子参与植物发育、次生代谢、激素信号转导、抗病性和非生物胁迫^{［参考文献 36-37}36-37］。在籽粒含水量显著位点Chr4_176596174附近，发现与E3泛素连接酶功能相关的Zm00001d052019锌指结构域家族蛋白。这些蛋白在植物生长发育以及对干旱、盐、温度、活性氧和有害金属等非生物胁迫的响应中发挥重要作用^{［参考文献 38

百度学术}38］。在穗轴含水量相关的显著位点Chr8_57716249附近，发现了编码呼吸爆发氧化酶同源基因的Zm00001d009349，基因表达后产生的活性氧是胁迫反应的重要调节剂^{［参考文献 39

百度学术}39］。在Chr5_191021635附近的位点与影响细胞壁相关受体激酶的Zm00001d017264相关，这些激酶在植物细胞伸长和对生物和非生物胁迫的反应中起重要作用^{［参考文献 40

百度学术}40］。尽管这些基因在调节植物发育中起着关键作用，但它们是否影响玉米籽粒发育及其具体机理尚不清楚。结合前人关于籽粒发育的动态转录组数据，本研究对5个籽粒含水量的候选基因表达量进行了分析。结果显示，在授粉后籽粒发育的0~38 d内，这些基因在不同时期的表达量各有差异。其中，Zm00001d052010在授粉后籽粒发育的第28天表达量开始增加，并持续至第38天，这表明Zm00001d052010可能是影响玉米籽粒后期发育过程中脱水的关键基因。

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