2025年5月6日 3:57 星期二
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糜子种质资源淀粉含量与Waxy基因等位变异分析  PDF

  • 王红梅 1 ✉
  • 董孔军 2 ✉
  • 何继红 2
  • 白斌 3
  • 刘天鹏 2
  • 任瑞玉 2
  • 刘新星 1
1. 甘肃省农业科学院生物技术研究所，兰州730070； 2. 甘肃省农业科学院作物研究所，兰州 730070； 3. 甘肃省农业科学院小麦研究所，兰州 730070

最近更新：2024-07-04

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231226004

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摘要

本研究测定了100份糜子种质资源的直链淀粉和支链淀粉含量，采用分子标记对胚乳直链淀粉合成调控基因Waxy进行基因分型，并选取不同直链淀粉含量代表种质资源进行基因测序和差异位点分析。结果表明，100份糜子种质资源直链淀粉含量变化幅度为0~22.78%，平均6.07%，直链淀粉含量低于3.7%的糯性材料占36%，完全糯性材料占24%；支链淀粉含量变化幅度为4.55%~56.73%，平均15.30%。分子标记M5/R11扩增产物能有效区分S0、S-15和S0S-15基因型；标记int5Lf/R3和M12/R12的PCR产物利用内切酶 ACC I和EcoN I剪切，可鉴别出LC、LY、LF基因型。100份糜子种质共发现9种基因型，其中S0/Lc数量最多，占33%，S-15/LF占25%，杂合型S0S-15/LF、S0S-15/LC、S0S-15 /LYLF各占2%。通过Waxy基因序列比对，在地方品种甘谷黑蝉背、黑糜子、庆阳饿死牛，育成品种晋黍9号、赤糜2号等种质资源中发现了大量新的SNPs位点，可用于基因功能和糜子育种材料创制研究。本研究结果为糜子分子育种工作及品质改良提供了理论依据。

糜子（Panicum miliaceum L.）是禾本科黍属草本植物，具有抗旱、耐贫瘠、耐盐碱、抗逆性强、适应性广、生育期短、C4光合属性等特点，是轮作倒茬、山荒瘠薄地修复改良的先锋作物［

1-2］，在旱作农业生产中占有重要地位。糜子营养丰富，富含淀粉、蛋白质、酚类活性物质、膳食纤维以及人体必需的氨基酸和钙、铁、镁、锌等多种微量元素，有食用、药用、饲用价值，在现代功能性食品研究开发中具有很大潜力［3-5］。糜子脱壳后为黄米，常被用来制作米粥、炒米及各种风味小吃如年糕、汤圆等［6-7］，同时也是黄酒制作原料［8］。随着人们膳食结构多元化及特色产品开发，糜子相关制品倍受消费者关注和青睐［7，9］。

淀粉是糜子籽粒的重要组成成分，占胚乳的70%左右，淀粉含量和结构与谷物蒸煮食味品质密切相关。研究糜子淀粉含量与组成对于评价其品质特性、加快遗传改良和引导粮食种植结构优化调整具有重要的科学意义［

10］。根据分子结构的不同，淀粉分为直链淀粉和支链淀粉，分子结构和分子聚集状态的差异决定了两种淀粉不同的理化性质和应用领域［11］。日本学者Nakayama等［12］根据直链淀粉含量高低将谷子分为非糯（17.0%~31.9%）、低直链淀粉含量（7.8%~16.0%）和糯质（0~3.5%）3种类型，直链淀粉含量>3.5%的为粳性。柴岩［3］研究认为，糜子胚乳直链淀粉含量<3.7%的为糯性。关于谷类淀粉理化特性与加工品质的研究较多，罗志祥等［13］的研究表明，稻米中直链淀粉含量与米饭硬度、咀嚼性和膨胀性呈显著正相关，而与黏度呈显著负相关。杨清华等［14］对40份糜子育成品种研究发现粳糯糜子之间蒸煮食味品质与加工工艺有显著差异，粳性糜子饭吸水率、糊化时间、体积膨胀率、米汤固形物含量、米汤碘蓝值均高于糯性糜子。邵欢欢等［15］测定40份糜子淀粉含量，发现总淀粉含量为58.43%~75.45%，直链淀粉含量为0~20.34%，不同来源地的糜子直链淀粉含量差异较显著。田翔等［16］采用单波长法测定80份山西糜子，发现直链淀粉含量变化幅度为 0~27.96%，提出了不同直链淀粉含量范围的材料类型，为糜子品质育种亲本的选配提供依据。

禾谷类作物胚乳淀粉合成受Waxy基因控制，Waxy基因编码颗粒结合型淀粉合成酶（GBSSI，granule-bound starch synthase Ⅰ），颗粒结合型淀粉合成酶是合成直链淀粉的关键酶［

17］。若Waxy基因发生突变，颗粒结合型淀粉合成酶不能正常表达或酶活性降低，导致直链淀粉和支链淀粉含量及比例发生变化，淀粉性状则由粳性转变为糯性［18］。由Waxy基因突变引起的粳糯性改变现象在水稻［19］、玉米［20］、谷子［21］、糜子［22］等作物中广泛存在。王倩等［23］在GenBank数据库中搜索了22种植物颗粒结合型淀粉合成酶蛋白基因序列，发现大多数植物Waxy基因存在于不同染色体，一般含有14个外显子和13个内含子，编码氨基酸约514~660 aa。糜子是异源四倍体物种（2n=4x=36），Hunt等［24］对糜子Waxy基因测序发现，Waxy基因包含2 种位点（GBSSI-S 和GBSS I-L），其中，GBSSI-S基因在外显子10区域存在15 bp碱基的缺失（突变型为 S-15，野生型为S0），该缺失导致葡糖基转移酶结构域GTD1缺失5个氨基酸，使GBSSI-S基因酶的活性丧失，胚乳淀粉由粳性转变为糯性；GBSS I-L位点有3个等位基因（LF、LY、LC），LF由位于第9外显子区域的移码突变（腺嘌呤残基A的插入）得到，LY是第7外显子序列发生了单碱基替换（A替换G），由半胱氨酸变成酪氨酸得到，LC为GBSS I-L基因上不存在移码突变和单碱基突变的基因型。刘晓欢［25］对来自中国17个省的241份糜子地方品种的颗粒结合型淀粉合成酶序列进行基因分型研究，发现了５种基因型，最多的是S-15/LF，但没有发现基因型S-15/Lc，分析可能与中国糜子的起源与进化有关。丁敏等［26］根据糜子Waxy位点颗粒结合型淀粉合成酶基因开发了3个功能标记，其中InDel标记（RYW214）能有效区分粳、糯和杂合3 种变异类型，分子检测与表型鉴定结果吻合度达 93.3%，为糜子粳糯性鉴定提供了有效的检测工具。

直链淀粉含量是稻米国家质量标准中的一项重要技术参数，其含量的高低对于评价粮食品质和农业选种具有重要参考价值［

27-28］。直链淀粉定量测定是对禾谷类成熟籽粒磨粉后进行测定，具有时限性。DNA分子标记技术在作物生长发育的任何时期、任何组织都可对目标性状进行快速、准确鉴定，尤其在杂交育种遗传群体早代选择中可发挥重要作用。Hunt等［24］研究发现糜子糯质类型与S位点15 bp缺失呈100%对应关系。Wang等［29］对132份中国糜子Waxy基因的多态性位点进行分子检测，基于测序结果对研究材料进行基因分型，进一步证实了突变体S-15基因型与糜子糯质性相关。目前，我国糜子育种仍处于以杂交育种为主要方法的常规育种阶段，早熟、高产、抗逆是糜子主要的育种目标，品质育种刚刚起步，应用分子标记辅助选择育种仅为个例［30-31］。本研究收集不同生态类型的糜子种质资源，测定籽粒胚乳直链淀粉与支链淀粉含量，采用分子标记与酶切技术对糜子种质进行基因分型，从直链淀粉含量与分布比例方面分析糜子粳糯性与杂交育种选择的关联性，以期为糜子遗传改良提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料由不同来源地有代表性的糜子种质资源组成，共计100份，包括地方品种58份，育成品种24份，国外引进材料18份。试验材料（植株叶片及成熟籽粒）由甘肃省农业科学院作物研究所杂粮课题组提供，2021年种植在甘肃省农业科学院会宁试验站。

1.2 直链淀粉与支链淀粉含量测定

试验材料使用砻谷机将籽粒脱壳，取脱壳糜子籽粒置于球磨仪（Retsch MM400）中研磨，粉末过100目筛，筛下粉末为测定直链/支链淀粉样品。直链/支链淀粉含量测定采用双波长微量分析法（BioTek Synergy HTX），方法步骤按照北京盒子生工科技有限公司试剂盒（Boxbio-AKSU016C /AKSU017C）说明书进行，直链淀粉含量测定主波长为 550 nm，参比波长为 485 nm；支链淀粉含量测定主波长为 530 nm，参比波长为 755 nm。每个样品重复测定3次，取平均值计算直/支比（直链淀粉含量与支链淀粉含量比值）。

1.3 分子标记检测

1.3.1 样品DNA提取

糜子样品叶片在液氮中研磨成粉末，DNA提取使用BIOMIGA CP Plant gDNA Isolation Kit（型号：BW-GD2621，杭州倍沃医学科技有限公司），方法参考试剂盒说明书；采用NanoDrop One超微量紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，以1.0 %琼脂糖凝胶电泳检测 DNA 的完整性。

1.3.2 PCR反应体系与扩增程序

PCR引物序列来源于Hunt等［

24-32］（表1）， 其中int5Lf/R3、M12/R12分别扩增GBSS I-L基因的intron5-exon7区段和intron8-intron9区段，M5/R11扩增GBSS I-S基因exon9-intron 10区段，引物由北京赛百盛生物技术有限公司合成。PCR反应体系为15 μL：模板 DNA 1 μL（25 ng），2×Taq PCR MasterMix 7.5 μL，上下游引物各 1 μL（10 μmoL/L），ddH2O 4.5 μL。PCR反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，54~58 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，34个循环；72 ℃延伸8 min，4 ℃保存。PCR反应在BIO-RAD T100 TM扩增仪中进行，扩增产物经2.5 %的琼脂糖凝胶和8 %非变性聚丙烯凝胶电泳检测，BIO-RAD ChemiDoc XRS+凝胶成像系统观察拍照。

表1  PCR扩增引物及扩增区段
Table 1  PCR amplification primers and amplification segments

标记

Markers

测序引物

Sequencing primer

引物序列（5′－3′）

Primer sequence（5′－3′）

退火温度（℃）Annealing temperature

扩增区段

Amplification segments

参考文献

Reference

int5Lf

R3

int5Lf

ATGTTTGAATGAATGCTCC

TGGTAGTTGCTCTTGAGGTA

54 L gene， intron5-exon 7

［

24］

［

32］

M12

R12

M12

CGTGACCATCTCTTCCTGTA

CGACGACGAACTCTCAACAC

58 L gene，intron8-intron 9

［

24］

［

24］

M5

R11

M5

GGACGTCAGCGAGTGGGACC

CAGGCACACTGCTCCCAATG

58 S gene， exon9-intron 10

［

32］

［

24］

1.4 基因测序与酶切体系建立

1.4.1 PCR产物测序与序列比对

选取糜子不同直链淀粉含量代表性材料16份（包括糯质材料5份，中、低直链淀粉含量材料各4份、高直链淀粉含量材料3份），采用高保真DNA酶Prime STAR GXL DNA Taq polymerase（Takara）和标记引物int5Lf/R3、M12/R12、M5/R11对基因组DNA进行PCR扩增（反应体系和扩增程序同1.3.2），扩增产物经琼脂糖凝胶电泳检测，选取目标片段条带单一、亮度强的PCR原液委托上海派森诺生物科技公司纯化测序，方法为Sanger测序。采用生物信息学软件进行序列比对，引物int5Lf/R3和M12/R12扩增序列的参考基因组ID为GU199253，引物M5/R11扩增序列的参考基因组ID为GU199261。

1.4.2 酶切体系与反应条件

限制性内切酶的选择参考丁敏等［

26］研究，内切酶ACC I和EcoN I购自NEB（New England Biolabs （Beijing） LTD.）。酶切总反应体系为40 μL，其中无酶水19.5 μL、PCR产物15 μL、10×rCutSmart Buffer 4 μL、ACC I或EcoN I 1.5 μL （10 units/μL），37 ℃恒温孵育3 h，80 ℃/65 ℃热失活20 min。酶切产物用2.0%~3.0%的琼脂糖凝胶检测，恒压100 V电泳50 min。GBSSI-L基因若exon7中发生了碱基A替换G（LY），则可被内切酶ACC Ⅰ（识别位点5′···GT▼MKAC···3′）消化，产生171 bp和 52 bp 的DNA片段；若exon9中存在碱基A插入导致移码突变（LF），可被EcoN Ⅰ（识别位点5′···CCTNN▼NNNAGG···3′）消化，产生359 bp和286 bp的DNA片段。

1.4.3 基因分型

采用标记引物M5/R11对GBSSI-S基因exon9- intron10区段扩增，根据扩增产物片段大小（存在15 bp碱基缺失与否）和电泳谱带确定基因型S0、S-15和S0S-15（双带）；采用内切酶ACC I和EcoN I对GBSSI-L基因的靶标位点进行消化，根据酶切产物片段大小识别LY、LF、LC基因型。

1.5 数据统计与分析

使用DPS V18.10数据处理系统分析淀粉含量相关数据，测序数据使用 Geneious v 8.0.2生物信息学软件进行多序列比对分析。

2 结果与分析

2.1 糜子种质资源淀粉含量与直/支比

对100份糜子种质资源直链淀粉含量、支链淀粉含量、直/支比数据进行统计，由表2可见直链淀粉含量变化幅度为0~22.78%，平均6.07%。按照Nakayama等［

17］对谷类的划分标准，供试材料糯质、低直链淀粉含量和非糯类型分别占36%、59%和5%，低直链淀粉含量类型最多，其次是糯质类型，糯性糜子中完全糯性材料占比24%。按照材料来源，58份地方品种、24份育成品种和18份国外引进材料的直链淀粉含量平均值分别为4.45%、4.99%、10.92%，地方品种和育成品种直链淀粉含量平均值偏低，可能与地方品种和育成品种中完全糯性材料占比很高有关，分别为16%和8%，国外引进材料均为非糯类型。

表2  100份糜子来源、淀粉含量及其Waxy基因分型
Table 2  The source， starch content and Waxy genotyping of 100 broomcorn millet
序号Number

名称

Variety

来源

Origin

直链淀粉含量（%）

Amylose content

支链淀粉

含量（%）

Amylopectin content

直/支比

Ratio of amylose to amylopectin

S gene

exon9-intron10

L gene

intron5-exon7，intron8-intron9

LYLFLc
1 黄黍子 中国北京 0 34.33±0.15 0 S-15 √
2 甘谷黑蝉背 中国甘肃 18.70±0.48 14.04±0.22 1.33 S0 √
3 会宁保安红 中国甘肃 17.22±0.21 17.15±0.34 1.00 S0 √
4 庆阳饿死牛 中国甘肃 9.21±0.82 44.74±2.64 0.21 S0 √
5 古浪半个红 中国甘肃 10.51±1.17 21.86±0.28 0.48 S0 √
6 S02036 中国海南 4.63±0.44 42.85±1.14 0.11 S0 √
7 小黍子 中国河北 12.78±0.98 12.18±0.40 1.05 S0 √
8 粘黍子 中国河北 0 18.69±0.12 0 S-15 √
9 河间白黍子 中国河北 0 20.32±0.86 0 S-15 √
10 红鹌鹑尾 中国黑龙江 0 27.12±1.16 0 S-15 √
11 小麦糜子 中国黑龙江 13.71±0.41 14.68±0.37 0.93 S0 √
12 葡萄青 中国黑龙江 5.65±1.55 15.16±0.03 0.37 S0 √
13 嫩黍23 中国黑龙江 0 34.36±0.81 0 S-15 √
14 单尾巴糯 中国湖北 1.06±0.57 19.84±0.25 0.05 S-15 √
15 黑糜子 中国吉林 4.72±0.21 26.41±1.30 0.18 S-15 √
16 千沟黄糜子 中国吉林 2.09±0.42 25.03±0.75 0.08 S-15 √
17 散尾儿 中国江苏 3.24±0.17 28.72±0.18 0.11 S-15 √
18 康平散穗 中国辽宁 0 33.82±0.22 0 S-15 √
19 呼盟黑粘糜 中国内蒙古 0 32.69±0.48 0 S-15 √
20 临河双粒黍 中国内蒙古 0 26.57±1.00 0 S-15 √
21 准旗酱黄黍 中国内蒙古 1.39±0.29 19.81±0.42 0.07 S-15 √
22 红糜子 中国内蒙古 13.70±1.12 26.19±0.48 0.52 S0 √
23 内黍一点红 中国内蒙古 14.17±0.98 16.99±0.31 0.83 S0 √
24 惠农黄粘黍 中国宁夏 3.84±0.79 32.88±0.33 0.12 S-15 √
25 池白糜子 中国宁夏 3.84±0.66 33.20±0.92 0.12 S0 √
26 丰双-4 中国宁夏 1.11±1.21 17.18±2.30 0.06 S-15 √
27 大黄糜 中国青海 9.44±0.08 17.79±0.67 0.53 S0 √
28 六十糜 中国青海 10.05±0.80 22.18±0.32 0.45 S0 √
29 灰糜子 中国青海 3.75±0.97 12.98±0.53 0.29 S0 √
30 黄粒糜 中国青海 5.18±0.26 7.63±0.28 0.68 S0 √
31 黄黍子 中国山东 0 7.60±1.05 0 S-15 √
32 A85-45 中国山东 0 5.93±0.40 0 S-15 √
33 小白黍 中国山西 6.57±0.26 15.13±0.42 0.43 S0 √
34 灰脸蛋黍 中国山西 0 6.79±0.06 0 S-15 √
35 大红糜子 中国山西 0 6.25±0.36 0 S-15 √
36 软糜子 中国山西 7.59±0.65 9.74±0.58 0.78 S0 √
37 软黍谷 中国山西 0.37±0.21 11.44±1.33 0.03 S-15 √
38 紫秆白黍 中国山西 0 4.55±0.19 0 S-15 √
39 老树皮黍子 中国未知 0 5.77±0.33 0 S-15 √
40 灰软糜 中国未知 7.78±0.14 6.92±0.05 1.12 S0 √
41 圪堵穗红软糜 中国未知 9.91±0.05 8.11±0.39 1.22 S0 √
42 焦顶软糜 中国未知 0 8.65±0.72 0 S-15 √
43 洼黑红软糜 中国陕西 0 7.37±0.23 0 S-15 √
44 灰麻糜 中国陕西 12.17±0.80 17.85±0.64 0.68 S0 √
45 红软糜（黍） 中国陕西 4.91±0.20 13.97±0.78 0.35 S0 √
46 灰糜子 中国陕西 7.92±0.32 9.42±0.44 0.84 S0 √
47 黑糜子 中国陕西 4.95±0.25 13.59±0.06 0.36 S0 √
48 晋黍9号 中国山西 6.85±0.27 56.73±0.09 0.14 S0S-15 √ √
49 札达糜 中国西藏 1.16±0.17 10.00±0.42 0.12 S0S-15 √
50 额敏红糜 中国新疆 5.23±0.54 12.63±0.42 0.41 S0 √
51 糜子 中国新疆 6.25±0.72 8.91±0.50 0.70 S0 √
52 红糜 中国新疆 4.77±0.72 8.94±0.28 0.53 S0 √
53 黑糜子 中国云南 2.83±0.12 10.45±2.03 0.27 S0S-15 √
54 陇糜10号 中国甘肃 7.36±0.52 6.76±0.48 1.09 S0 √
55 陇糜14 中国甘肃 13.29±0.44 9.65±0.14 1.38 S0 √
56 陇糜7号 中国甘肃 8.47±0.24 6.18±0.14 1.37 S0 √
57 陇糜11号 中国甘肃 22.78±0.34 19.62±0.11 1.16 S0 √
58 陇糜4号 中国甘肃 8.38±0.65 9.17±0.12 0.91 S0 √
59 龙黍23号 中国黑龙江 0 5.87±0.44 0 S-15 √
60 齐黍1号 中国黑龙江 0 5.16±0.70 0 S-15 √
61 粘丰7号 中国黑龙江 0 12.34±0.53 0 S-15 √
62 九黍1号 中国吉林 0 10.86±1.25 0 S-15 √
63 辽糜56 中国辽宁 1.06±0.12 11.63±1.05 0.09 S-15 √
64 赤糜2号 中国内蒙古 1.76±0.17 12.57±0.86 0.14 S0S-15 √ √
65 伊选黄糜 中国内蒙古 0.23±0.06 12.79±0.86 0.01 S-15 √
66 固糜21号 中国宁夏 4.77±1.61 11.38±0.78 0.42 S0 √
67 宁糜13号 中国宁夏 6.94±0.96 13.33±0.32 0.52 S0 √
68 宁糜15号 中国宁夏 0 8.69±0.62 0 S-15 √
69 晋黍4号 中国山西 0 7.08±0.12 0 S-15 √
70 晋黍8号 中国山西 0 10.23±0.94 0 S-15 √
71 榆糜2号 中国陕西 22.50±0.26 22.89±0.39 0.99 S0 √
72 榆糜3号 中国陕西 4.12±0.09 14.36±0.56 0.29 S0 √
73 冀黍3号 中国河北 0.23±0.10 7.69±0.17 0.03 S-15 √
74 会宁野糜子 中国甘肃 5.46±0.97 14.42±0.64 0.38 S0 √
75 泥河湾野黍子 中国河北 0.79±0.20 16.57±0.17 0.05 S0S-15 √
76 承德-7 中国河北 3.84±0.41 11.92±0.39 0.32 S0 √
77 吉林3 中国吉林 5.09±0.26 14.74±0.08 0.35 S0 √
78 榆糜3号 中国陕西 5.74±0.73 23.62±0.97 0.24 S0 √
79 赤黍1号 中国内蒙古 0 30.05±0.21 0 S-15 √
80 野生黄黍子 中国山西 6.94±0 11.70±0.16 0.59 S0 √
81 野糜子 中国山西 6.53±0.48 14.49±0.36 0.45 S0S-15 √
82 野糜子 中国新疆 12.78±0.72 10.48±0.50 1.22 S0 √
83 IPM 1044 阿富汗 11.53±0.88 14.23±0.06 0.81 S0 √
84 WHITE FRENCH COMMERCIAL 澳大利亚 11.67±0.37 8.88±0.28 1.31 S0 √
85 IPM 1116 巴基斯坦 13.24±1.00 12.02±1.11 1.10 S0 √
86 IPM 1037 阿根廷 10.23±0.44 10.35±0.28 0.99 S0 √
87 德国 德国 11.99±0.68 8.75±0.83 1.37 S0 √
88 GE.2013-28 格鲁吉亚 9.82±1.08 8.11±0.40 1.21 S0 √
89 Teisengun Suizanmensan 韩国 10.51±0.76 14.90±0.33 0.71 S0 √
90 DOMACE BIELE 捷克斯洛伐克 9.12±0.09 7.79±0.39 1.17 S0 √
91 罗马尼亚 罗马尼亚 11.34±0.09 9.17±0.86 1.24 S0 √
92 SNOBIRD 美国 10.47±0.05 12.37±0.67 0.85 S0 √
93 PI 427250 尼泊尔 8.89±0.14 8.39±0.38 1.06 S0 √
94 墨西哥 墨西哥 14.03±1.08 7.95±0.39 1.77 S0 √
95 尼泊尔 尼泊尔 7.64±0.21 8.72±0.34 0.88 S0 √
96 塔吉克斯坦 塔吉克斯坦 7.73±0.09 9.81±1.05 0.79 S0 √
97 Veselopodoljanskoe 38 乌克兰 17.59±0.97 15.54±0.13 1.14 S0 √
98 LOVASZPATONAI PIROS 匈牙利 8.75±0.44 8.24±0.20 1.06 S0 √
99 意大利 意大利 10.83±0.53 7.02±0.06 1.54 S0 √
100 科瓦尔杰特 俄罗斯 11.2±0.05 7.79±0.42 1.44 S0 √
均值 / 6.07 15.30 0.44

S0：代表GBSSI-S基因exon9-intron10区段无碱基缺失；S-15：代表该区段有15 bp碱基缺失，S0S-15代表杂合基因型；LY：代表GBSSI-L基因intron5-exon7区段存在A碱基替换G；LF：代表intron8-intron 9区段有碱基A插入；LC：代表该两个区段无A碱基替换G、无碱基A插入；√ 表示存在相应的基因位点

S0：Indicate without 15 bp deletion at exon9-intron10 of GBSSI-S gene；S-15：With 15bp deletion at the region；S0S-15：Indicate heterozygous genotype ； LY： A nucleotide base A substitution for G at intron5-exon7 of GBSSI-L gene； LF： A nucleotide base A insertion at intron8-intron 9 region； LC： No nucleotide base A substitution for G and no nucleotide base A insertion at the regions； √ indicates the presence of corresponding gene loci

100份糜子种质资源支链淀粉含量变化幅度为4.55%~56.73%，平均15.30%，地方品种、育成品种和国外引进材料支链淀粉含量平均值分别为16.52%、13.82%、9.96%。育成品种晋黍9号（序号48）和地方品种庆阳饿死牛（序号4）、S02036（序号6）支链淀粉等含量较高，分别为56.73%和44.74%、42.85%； 地方品种紫秆白黍（序号38）和育成品种齐黍1号（序号60）支链淀粉含量较低，分别为4.55%、5.16%。淀粉直/支比是影响含淀粉食品加工工艺参数的重要因素［

33］，本研究淀粉直/支比变化幅度为0~1.77，平均为0.44。Bienvenido ［34］依据淀粉直/支比将稻米划分为低（<0.05）、较低（0.06~0.14）、中等（0.15~0.25）、较高（0.26~0.33）、高直/支比（>0.33）5个类别。依据该标准，100份糜子材料淀粉直/支比低、较低、中等、较高、高的数量依次为29、10、3、5、53，直/支比<0.05的材料基本为糯性材料，直/支比>0.33的材料占53%，高直/支比数量居多。

2.2 糜子种质资源分子标记检测

3对引物int5Lf/R3、M12/R12、M5/R11特异性和稳定性好，对100份糜子DNA进行PCR均能扩增出清晰的目标条带。引物M5/R11扩增GBSSI-S基因exon9-intron10区段，扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳能有效区分S0、S-15基因型及S0S-15杂合型（图1），3种基因型检出数量分别为59个、35个、6个（表2）。引物int5Lf/R3、M12/R12扩增GBSSI-L基因的intron5-exon 7区段和intron8-intron 9区段，在所有材料中分别扩增出223 bp和645 bp的特异片段，电泳条带清晰亮度强，为下一步的酶切提供了充足的底物。

图1  引物M5/R11对部分糜子样品GBSSI-S位点PCR扩增电泳图

Fig. 1  Electrophoretic PCR products of some broomcorn millet samples with primers M5/R11

M：Marker Ⅰ； 1-22： 序号同表2

1-22： Serial numbers are the same as in table 2

2.3 糜子种质资源Waxy基因分型

采用int5Lf/R3、M12/R12引物对GBSSI-L基因进行PCR扩增，扩增产物采用限制性内切酶ACC Ⅰ和EcoN Ⅰ消化，通过优化酶切条件达到了预期的酶切效果（图2，图3）。酶切结果显示，100份研究材料中，在intron5-exon 7区段和intron8-intron 9区段能被内切酶ACC Ⅰ消化即存在碱基A替换G的LY型有18份，被内切酶EcoN Ⅰ消化有碱基A插入的LF型44份，可以被两种内切酶同时消化即既有碱基A替换G、又有碱基A插入的LY/LF型为2份，既无A碱基替换G、又无碱基A插入的LC基因型有36份（表2）。

图2  部分糜子样品ACC I酶切电泳图

Fig.2  Electrophoretic enzyme digestion products of some broomcorn millet samples with ACC Ⅰ

M： 500 bp plus marker； 序号同表2

Sample numbers are the same as in table 2

图3  部分糜子样品EcoN I酶切电泳图

Fig.3  Electrophoretic enzyme digestion products of some broomcorn millet samples with EcoN I

M： 500 bp plus marker； 1-24： 序号同表2

1-24： Sample numbers are the same as in table 2

基于M5/R11标记检测及两种酶切结果对100份糜子材料进行基因分型，共发现9种基因型（表3）。在全部材料中，S0/Lc基因型数量最多，共33份，其次是S-15/LF有25份，S0/LF有17份；S0/LY与S-15/LY各有9份，S0S-15/LF、S0S-15/LC、S0S-15 /LYLF各有2份；发现1例S-15 /LC基因型；所有材料中不存在S0 /LYLF、S0S-15/LY、S-15 /LYLF三种类型。综上，S0/Lc和S-15/LF是本研究材料中粳、糯糜子的主要基因型。

表3  不同基因型糜子直链淀粉含量
Table3  Amylose content in different genotypes of broomcorn millet germplasm

基因型

Genotype

数量

Number

直链淀粉含量（%）

Amylose content

标准误

Standard deviation

变异区间（%）

Range of variation

变异系数（%）

Coefficient of variation

S0/LY 9 8.81±3.14 ab 1.05 4.77~13.70 35.60
S0/LF 17 8.44±4.65 ab 1.13 4.12~22.50 55.11
S0/LC 33 10.39±4.46 a 0.78 3.75~22.78 42.92
S-15/LY 9 0.87±1.06 c 0.35 0~3.24 121.75
S-15/LF 25 0.31±1.01 c 0.20 0~4.72 330.98
S0S-15/LF 2 2.00±1.18 c 0.84 1.16~2.83 59.19
S0S-15/LC 2 3.66±4.06 bc 2.87 0.79~6.53 110.90
S0S-15/LYLF 2 4.31±3.60 bc 2.55 1.76~6.85 83.60
S-15 /LC 1 3.84 / / /

小写字母表示差异显著性（P<0.05）

Different letters indicate the significance of difference at P<0.05

2.4 糜子种质资源Waxy基因型与直链淀粉含量的关系

本研究对各基因型直链淀粉含量均值进行多重比较（表3），发现GBSS I-S基因野生型S0无论与GBSS I-L哪种基因型组合，直链淀粉含量都明显高于突变型S-15。在检测到的9种基因型中纯合野生型S0/LC直链淀粉含量最高，变异区间为3.75%~22.78%，变异系数为42.92%；突变型S-15与LY、LF任何一种结合，直链淀粉含量均较低，变异区间为0~4.72%，最大变异系数为330.98%；杂合基因型S0S-15/LF、S0S-15/LC、S0S-15/LYLF直链淀粉含量介于野生型和突变型之间，变异区间为0.79%~6.85%，最大变异系数为110.90%。对糜子基因型和直链淀粉含量进行显著性分析，结果显示不同基因型间差异性显著（P<0.05）。

2.5 糜子种质资源Waxy基因序列多态性分析

采用Geneious v 8.0.2对16个糜子代表性材料的PCR产物DNA序列进行比对，结果分3种情况：引物int5Lf/R3扩增序列与参考基因组（ID：GU199253）比对（图4），发现散尾儿（序号17）、黄粒糜（序号30）、科瓦尔杰特（序号100）3个样品在扩增区段第 283位点发生了单碱基A替换G，其他13个样品不存在碱基替换。16个样品序列比对结果存在碱基替换与否，与内切酶ACC Ⅰ酶切鉴定结果完全一致，证明采用内切酶ACC Ⅰ可准确鉴定GBSS I-L基因intron5-exon 7区段单碱基A替换G。

图4  引物int5Lf/R3扩增序列与糜子参考基因组比对

Fig. 4  Alignment of sequences generated from millet germplasm by primers int5Lf/R3

引物M12/R12扩增序列与参考基因组（ID：GU199253）序列比对（图5），发现黄黍子（序号1）、河间白黍子（序号9）、赤糜2号（序号64）、陇糜11号（序号57）等9个品种在exon 9第314位点后插入1个腺嘌呤残基A，这与内切酶EcoN Ⅰ酶切鉴定结果一致。同时发现晋黍9号（序号48）有5个SNP位点，其中碱基替换4处，分别为第325、392、425、556位点（均是A替换为G）；颠换1处，为第571位点（T颠换为A）。赤糜2号（序号64）有45个SNP位点，包括碱基插入1个（第519位点插入C ），碱基替换30个，颠换14个，变异位点与变异类型丰富。其他7个品种未发现变异位点，基因序列与参考基因组一致。

图5  引物M12/R12对糜子扩增产物序列与参考基因组比对

Fig. 5  Alignment of sequences generated from millet germplasm by primers M12/R12

引物M5/R11扩增序列与参考基因组（ID：GU199261）序列比对（图6），发现散尾儿（序号17）、河间白黍子（序号9）、黄黍子（序号1）、晋黍9号（序号48）、黑糜子（序号53）5个品种，在exon10第14~28碱基对之间有一段15 bp的碱基缺失，缺失序列为5′-AGGCGCTGAACAAGG-3′。exon10中15 bp的碱基缺失导致糜子淀粉由粳性变为糯性，这5份糜子的直链淀粉含量均小于3.7%，基因型检测与表型鉴定结果完全吻合。其他11个品种不存在15 bp的碱基缺失，但从中发现了大量SNP位点，其中甘谷黑蝉背（序号2）有1个碱基插入（第552位点插入G）；庆阳饿死牛（序号4）有2个碱基替换（第550位点 A替换为C，第551位点 G替换为A）；甘谷黑蝉背（序号2）、会宁保安红（序号3）、科瓦尔杰特（序号100）存在1个碱基替换（均为第561位点A替换为G）；晋糜9号（序号48）有1个碱基替换（第426 位点G替换为A）和3个颠换（第401和476位点C颠换为G，第502位点A颠换为T）；黑糜子（序号53）和赤糜2号（序号64）各发现30个SNP位点，黑糜子有14个碱基替换和16个颠换；赤糜2号有1个碱基插入（第260位点插入G）、14个碱基替换和15个颠换。

图6  引物M5/R11对糜子扩增产物序列与参考基因组比对

Fig. 6  Alignment of sequences generated from millet germplasm by primers M5/R11

3 讨论

直链淀粉/支链淀粉的含量及其比例与谷类作物的食味品质和加工品质密切相关。快速准确测定直链淀粉含量对于粮食品质评价、指导农产品加工和淀粉合理利用具有重要的意义。目前，谷物中直链淀粉含量测定常用方法有I2-KI比色法、双波长法及近红外光谱分析法等，不同方法各有其优缺点［

35］，其中双波长法检测原理是基于直链和支链淀粉与碘离子形成的络合物有不同的吸收波长，且不同波长下的吸光度差值与直链淀粉含量成正比［36］，该方法具有准确度高、重复性好、简便高效等优点。本研究采用双波长微量分析法测定100份糜子直链淀粉/支链淀粉含量，结果显示直链淀粉含量变化幅度为0~22.78%，平均为6.07%，总淀粉含量变幅为45.50%~63.58%，与邵欢欢等［15］和田翔等 ［16］对糜子淀粉含量检测结果（总淀粉含量变幅分别为58.43%~75.45%和67.60%~75.10%）相比较低，这可能与供试材料的遗传机制以及来源地气候环境、土壤水肥和栽培措施等因素［37-39］有关。作物在灌浆结实阶段遇到高温、极端干旱条件，会引起种子组织加速老化，生理机能降低，同时酶的活性也提早丧失，不利于贮藏物质的积累和转化［40-41］。直链淀粉含量是决定谷物适口性和消化特性的重要因素，糯质和低直链淀粉类型更受消费者欢迎［9］。本研究地方品种和育成品种中的直链淀粉含量平均值偏低，分别为4.45%和4.99%，原因是糯性材料占比很高，而国外引进材料中无完全糯性和糯性品种。不同来源地糜子直链淀粉含量的差异，间接地反映了育种家的选择方向和当地消费者的饮食偏好。

分子标记辅助选择可对基因型直接进行快速、准确选择，本研究采用标记M5/R11对100份糜子资源进行检测，能鉴定出GBSSI-S基因exon9-intron10区段的S0、S-15、S0S-15类型。标记int5Lf/R3和M12/R12的 PCR产物采用内切酶 ACC Ⅰ和EcoN Ⅰ消化剪切，可准确鉴定出GBSS I-L基因intron5-exon7区段和intron8-intron9区段的LY、LF、LC位点，结合M5/R11标记检测结果，对糜子Waxy基因进行了基因分型。在100份糜子资源中共发现9种基因型，野生型S0/Lc数量最多，占33%，突变型S-15/LF、S-15/LY分别占25%和9%，中间类型S0S-15/LF、S0S-15/LC、S0S-15 /LYLF各占2%。其中基因型检测与表型直链淀粉含量对应的材料有97份，二者相关性达97%，直链淀粉含量均值最高的基因型为S0/Lc（10.32%），最低的基因型为S-15/LF（0.31%），可见GBSSI-S基因的等位变异对直链淀粉含量的影响起决定性作用。Araki等 ［

42］对源于欧洲和亚洲的 178份糜子材料进行基因分型研究，发现日本和韩国的完全糯性表型多数是由基因型S-15/LY引起的（95.7%），而本研究材料的完全糯性大多由基因型S-15/LF产生（25.0%），这与刘晓欢［25］对241份中国糜子的研究结果一致。国内外学者［24-26， 29］对糜子种质资源的研究未发现S-15/LC基因型，而本研究中的24号材料地方品种惠农黄粘黍，反复检测其直链淀粉含量为3.84%，基因分型为S-15和LC，是唯一检测到的S-15/LC类型，该基因型可能是确实存在的新类型，也可能由试验材料不纯引起，后期需要重新采集样品进一步测试，以确定是否为新的变异类型。基于功能分子标记与限制性内切酶酶切技术，即可对四倍体糜子Waxy基因进行准确分型，与传统基因测序法相比，具有操作简便、重复性好、高效低成本等优点，可用于糜子育种研究工作。

Waxy 基因在禾谷类作物水稻、高粱、玉米、小麦、谷子和糜子中广泛存在，变异位点和变异类型非常丰富。迄今为止发现Waxy等位基因的突变位点50多个，大多由转座子或反转录转座子插入到Waxy基因的外显子、内含子或侧翼区域，引起Waxy基因功能不表达［

43］。本研究通过对糜子Waxy基因测序，部分样品除了有前人研究发现的GBSS I-L基因intron5-exon7区段存在碱基A替换为G、intron8-intron9区段存在腺嘌呤残基A插入和GBSSI-S基因exon9-intron10区段存在15 bp的碱基缺失之外［24］，还从地方品种甘谷黑蝉背（序号2）、黑糜子（序号53）和育成品种赤糜2号（序号64）等材料中发现了大量新的SNP位点，如在intron8-intron9区段，赤糜2号有45个SNP位点，包括1个碱基插入、30个碱基替换、14个颠换；在GBSSI-S基因exon9-intron10区段，黑糜子有14个碱基替换和16个颠换；赤糜2号有1个碱基插入、14个碱基替换和15个颠换，变异类型非常丰富。这些新发现的SNP位点对糜子淀粉组成与含量的影响如何，还需进一步的实验研究来解析。

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