摘要
通过挖掘水稻籽粒中锌含量显著关联的QTL，并结合基因功能注释、单倍型和灌浆期籽粒相对表达量分析，筛选与水稻籽粒锌含量相关的候选基因。本研究以139份西北早粳稻核心种质资源为试验材料，结合重测序获得的1800920个高可信度SNPs，基于一般线性模型（GLM，general linear model）进行全基因组关联分析，对显著QTL区间内候选基因进行功能注释，并对进一步筛选后的基因进行单倍型和籽粒灌浆期相对表达量分析，以期筛选出与籽粒锌含量相关的候选基因和优势单倍型。结果表明，139份水稻中籽粒锌含量存在丰富的表型变异，且符合正态分布。全基因组关联分析共关联到12个显著SNP，分布在第1、2、4、10、11号染色体上，结合候选区间内的基因功能注释，推测定位在囊泡中的OsFRDL2可能与水稻籽粒锌元素富集相关；单倍型和灌浆期籽粒相对表达量分析表明，OsFRDL2在优势单倍型Hap5中表达量相对较高。因此推测OsFRDL2可能与水稻籽粒锌元素富集相关。研究结果为解析水稻籽粒锌元素富集机制和开发富锌水稻分子标记提供理论基础，为培育富锌水稻提供基因资源。
水稻是世界上主要粮食作物之一，是全世界近一半人口的主
挖掘水稻籽粒锌含量相关的基因是培育富锌水稻的关键，然而，水稻籽粒中锌元素的富集机制尚不明确。目前，部分水稻籽粒锌含量的相关基因已被克隆，如OsZIP9、OsNAS1、OsNAS2、OsNAS3、ZIP8等。定位在质膜上的OsZIP9具有锌内流转运蛋白活性，与野生型相比，敲除OsZIP9的转基因株系的根、茎和籽粒中的锌含量显著降低，过表达株系籽粒中的锌含量则显著增
水稻籽粒锌含量是由多基因控制的数量性状，长期以来，学者们大多采用连锁分析法来挖掘相关基因。张现伟
随着生物信息技术的迅速发展，全基因组关联分析成为近年来基因组学研究的热点，与传统的双亲种群绘图法相比，全基因组关联分析无需构建双亲后代群体，可以使用自然群体或者人工选择群体，且SNP标记密度
139份西北早粳稻核心种质资源，由宁夏大学农学院宁夏优势特色作物现代分子育种重点实验室提
采用GB 5009.14-2017食品安全国家标准食品中锌的测定（https：//www.miit.gov.cn/cms_files/filemanager/oldfile/threes trategy/threestrategy/ueditorupload/file/20170420/149 2665719113006905.pdf）的火焰原子吸收光谱法测定水稻籽粒中的锌元素。将139份西北早粳稻核心种质资源籽粒烘干，使用砻谷机（东孚久恒JDMZ 100，北京）脱壳、粉碎机（飞穗JFSD-70，上海）粉碎磨成米粉。准确称取样品1 g（±0.0001g）于锥形瓶内并加入10 mL混合酸（V硝酸∶V高氯酸= 5∶1），静置12 h以上，直至完全消解；消解液放置在电热板（格丹纳HT-400，广州）上，设置温度120℃ 0.5 h、180℃ 2 h进行消煮，210℃消煮至白烟散尽，停止加热，此时溶液为无色透明或淡黄色；待溶液冷却至室温后，转移到50 mL棕色容量瓶中用超纯水定容，进行2~3次润洗，过滤、稀释，每次消煮设置3次重复及2个空白对照，置于4℃冰箱。通过稀释1000 mg/kg标准溶液制备校准标准溶液，分别为0、0.4、0.8、1.2、2.0、2.4 μg/mL，用原子吸收分光光度计（日立Z-2000，日本）测定水稻籽粒中锌含
水稻在开花时标记为1 d，每间隔5 d取水稻籽粒，使用RNAsimple总RNA试剂盒（北京天根生化有限公司）提取RNA，使用微量核酸蛋白仪（Thermo Nanodrop2000分光光度计，上海）和电泳法检测RNA质量，若A260/A280=2.0，有3条带或前两条带，则说明RNA质量良好。使用PrimeScriptTMII 1st Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒（TaKaRa）进行反转录获取cDNA，使用生物染料法荧光定量试剂盒（TB GreenTM Premix EX TaqTMII）测定候选基因在灌浆期的相对表达量，扩增体系如下：2×TB Green™Premix Ex Taq 10μL，正反向引物各0.8 μL（F：TTGGCGTTCAGGTGGGAC，R：GACCGGGTC AGCCATGAG），cDNA 2 μL，RNase Free dH2O 6.4 μL。扩增程序如下：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，45个循环。采用
以日本晴IRGSP 1.0（https：//plants.ensembl.org/Oryza_sativa/Info/Index）为参考基因组，利用139份水稻种质表型值进行全基因组关联分析，计算模型采用GLM。使用plink 1.8（https：//zzz.bwh.harvard.edu/plink/download.shtml）检测全基因组中所有潜在的多态性SNP位点，以最大缺失率高于5%、最小等位基因频率10%以下为标准筛选出可信度高的SNP位点，利用Admixture软件（www.genetics.ucla.edu/software/admixture）结合主成分分析（PCA，principal component analysis）和邻接法（NJ，neighbor-jointing）进化树进行群体结构分析，R 语言和Python进行绘图，通过R 4.3.2（https：//www.r-project.org/）绘制曼哈顿图与QQ图展示关联分析结果。
以显著SNPs上下游各延伸300 kb作为候选区间，利用国家水稻数据中心（https：//www.ricedata.cn）对候选区间内的基因进行注释。筛选出与水稻籽粒锌累积相关的基因，使用plink 1.8提取候选基因外显子区域的基因型，Microsoft Excel 2010进行数据处理，使用Haploview（https：//www.broadinstitute.org/haploview/haploview）进行单倍型分析、Origin 2022（https：//www.originlab.com/2022）绘图。
139份水稻籽粒平均锌含量为19.46 mg/kg，最大值为38.67 mg/kg，最小值为11.58mg/kg，变异系数为20.87%，水稻籽粒锌含量表型符合正态分布，可用于GWAS分析（
图1 锌含量正态分布图
Fig.1 Zn content normal distribution
通过illumina技术对139份西北早粳稻核心种质进行10×重测序获得1800920个高质量SNPs（数据未发表），假定该群体的亚群数为1~10，计算其交叉验证误差，结果发现当亚群数为6时，交叉验证误差值最小，为0.59709（
图2 139份水稻种质资源分析
Fig. 2 Analysis of 139 rice germplasm resources
A：不同K值水平下的交叉验证误差值；B：连锁不平衡衰减图；C：139份水稻种质群体结构主成分分析结果；D：139份水稻种质系统发育树；E：139份水稻种质的群体结构分析
A：Cross-validation error values at different K levels；B：Chain imbalance decay diagram；C：Results of principal component analysis of the population structure of 139 rice germplasm；D：Phylogenetic tree of 139 rice germplasm；E：Population structure analysis of 139 rice germplasm
使用一般线性模型进行全基因组关联分析（
图3 水稻籽粒锌元素含量GLM模型曼哈顿图（A）和QQ图（B）
Fig.3 Manhattan（A） and QQ plots（B） of GLM model for Zn element content of rice seeds
绿点表示-log10（p）>7.39的SNP位点
Green dots represent SNP loci with -log10 （p） > 7.39
染色体 Chromosomes | 物理位置（bp） Position | 参考碱基 Reference base | 变异碱基 Alternative base | -log10（P） |
|---|---|---|---|---|
| 1 | 10733893 | G | T | 7.65 |
| 24685613 | T | A | 7.54 | |
| 2 | 25039237 | A | G | 8.76 |
| 25039216 | G | A | 8.16 | |
| 4 | 14561845 | C | T | 8.30 |
| 10 | 8209641 | T | C | 8.45 |
| 8209600 | T | C | 8.36 | |
| 6697167 | G | C | 7.78 | |
| 7805849 | G | T | 7.72 | |
| 9010319 | G | A | 7.52 | |
| 8211675 | G | A | 7.41 | |
| 11 | 13732866 | G | A | 7.48 |
以显著SNPs上下游各延伸300 kb作为候选区间，区间内共包含717个候选基因，通过国家水稻数据中心对其进行功能注释，筛选到4个与水稻籽粒锌含量相关的基因，分别为LOC_Os01g18670、LOC_Os01g42900、LOC_Os10g11860、LOC_Os10g13940（OsFRDL2）。基因LOC_Os01g18670为MDR型ABC转运蛋
通过单倍型和灌浆期籽粒表达差异显著性分析，结果表明OsFRDL2可能与水稻籽粒中锌元素的富集相关。OsFRDL2在外显子和非翻译区具有5个差异SNPs位点且连锁性较强（
图4 OsFRDL2分析结果
Fig.4 Analysis results of OsFRDL2
A：外显子区单倍型分析；B：不同单倍型品种籽粒锌含量差异显著性分析，不同小写字母表示在P<0.05水平上差异显著；C：籽粒灌浆期的相对表达量，* 与 ** 分别表示在P<0.05 和P<0.01 水平上差异显著；D：OsFRDL2单倍型分析
A： Haplotype analysis of exon region； B： Significant difference analysis of grain zinc content in different haplotype varieties， different lowercase letters indicated significant difference at the P < 0.05 level； C： The relative expression of grain filling stage， * and * *indicate， significant difference at the level of P < 0.05 and P < 0.01， respectively； D： Haplotype analysis of OsFRDL2
多药及毒性化合物外排转运蛋白，又称解毒外排转运蛋白（DTXs，detoxification efflux carriers），广泛存在于细菌、真菌、植物和哺乳动物
MATE蛋白家族代表了植物中的一个大型转运家族，但大多数基因在该家族中的作用尚未得到研
基于全基因组重测序数据，使用一般线性模型对139份种质的籽粒锌含量进行全基因组关联分析。结果显示，水稻籽粒的锌元素共关联到12个显著SNPs，其候选区间包含717个候选基因。通过基因功能注释，初步筛选获得4个可能与水稻籽粒锌元素积累相关的候选基因。将候选基因进行单倍型和灌浆期籽粒表达量分析，最终确定基因OsFRDL2的不同单倍型在水稻籽粒锌含量上具有差异显著性，通过测定含有Hap1和Hap5的不同品种籽粒灌浆期的相对表达量，结果表明，含有Hap5的品种中基因表达量始终高于含有Hap1的品种。因此OsFRDL2可作为与水稻籽粒锌含量相关的候选基因进行后续分析与验证。
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