香雪兰花色花香物质合成和调控研究进展

张佳; 李月庆; 单晓彤; 王丽; 高翔; ZHANG Jia; LI Yueqing; SHAN Xiaotong; WANG Li; GAO Xiang

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张佳
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李月庆
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单晓彤
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高翔
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东北师范大学生命科学学院分子表观遗传学教育部重点实验室，长春130024

最近更新：2024-05-10

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20241229002

摘要

花香和花色是花卉作物重要的观赏性状，是决定花卉品质、影响花卉经济价值的关键因素，因此，培育花色丰富、花香怡人的花卉新品种长期以来都是园艺工作者的主要育种目标。香雪兰作为球根切花品种的代表，其花朵颜色鲜艳、香气怡人，是研究植物花色花香的良好材料。本文综述了香雪兰花色花香合成代谢通路以及转录调控的研究进展，重点介绍了控制香雪兰花色苷合成的关键结构基因FhCHS1、FhDFR、Fh3GT、Fh5GT和萜类物质合成的关键结构基因FhTPS1～FhTPS14，此外还介绍了野生种TPS基因的天然等位基因变体序列之间的微小氨基酸差异驱动的酶的催化活性和产物特异性，为阐明花香种间遗传差异奠定了基础。花色苷的合成除了受到结构基因的调控，也受到MYB-bHLH-WD40的调控，花香的合成则受到FhMYB21L2和FhMYC2的调控，此外FhMYB21L2协同调控了黄酮醇合酶基因FhFLS2的表达，最后展望了花色苷和萜类物质合成的潜在应用前景。

关键词

花色; 花香; 转录调控

在植物的演化过程中，花器官是重要的性状变革，极大地促进了被子植物的繁荣。为了保证有性繁殖，被子植物进化出了复杂的花部器官特征，如花色、花香、花型和花蜜等，这些特征通常被称为传粉综合征^［

1］，其中花色花香是重要的观赏形状，是决定花卉品质的重要因素，因此解析花色花香之间的关系具有重要意义。

花色是观赏植物最重要的特征之一，一般来说，花朵中的色素可分为叶绿素（Chlorophyll）、类黄酮（Flavonoid）、类胡萝卜素（Carotenoid）和甜菜碱（Betaine）^［

2-3］。甜菜碱虽然可以赋予花朵红、橙、黄等颜色，但仅存在于石竹目中，并且与花青素相互排斥^{［参考文献 4-5}4-5］。黄酮类化合物则存在于各种植物组织或器官中，其赋予大多数植物的花黄色、红色、紫色和蓝色。类胡萝卜素与类黄酮共同存在决定了自然界中绝大多数花朵的颜色。类黄酮不仅负责参与植物的着色，也参与了多种生物学过程，例如吸引传粉昆虫^{［参考文献 6

百度学术}6］、抵御病虫害^{［参考文献 7

百度学术}7］、适应紫外辐射等^{［参考文献 8

百度学术}8］。迄今为止，已鉴定出6000多种黄酮类化合物^{［参考文献 9

百度学术}9］，主要分为异黄酮、黄酮、黄酮醇、黄烷醇和花青素、鞣红、橙酮等，其中花青素是花卉和水果中最常见的色素^{［参考文献 10-13}10-13］。花青素的生物合成受各种环境因素的影响，例如强光照会促进花青素的积累^{［参考文献 14-15}14-15］，而低温则促进切花牡丹花青素的积累^{［参考文献 16

百度学术}16］，液泡pH值也会影响花青素的颜色，当液泡pH值为酸性时花青素呈现出红色，中性为蓝色，碱性则为浅黄色^{［参考文献 17

百度学术}17］，此外植物激素对于花青素的合成也具有复杂的调控作用^{［参考文献 18-19}18-19］。

花香的起源是生物进化中的一个重要事件，花香作为吸引传粉者的嗅觉信号，通过介导植物与传粉者互作影响物种形成，是被子植物繁荣的重要驱动力^［

1］。此外，花香在抵抗生物和非生物胁迫中也发挥着重要作用。花香是挥发性有机小分子（VOC，volatile organic compounds）的动态混合物，根据其独立的生物合成来源途径，主要可分为萜烯类（Terpenes）、苯类/苯丙素类（Benzenoid aromatics）和脂肪酸衍生物（Fatty acid derivatives）。其中相对低分子量的萜烯（如10碳单萜烯和15碳倍半萜）的种类最多。花香的生物合成也受到各种环境因素的影响，例如光照会促进花香释放^{［参考文献 20

百度学术}20］，高温会加快挥发物的释放^{［参考文献 21

百度学术}21］，不同的激素也会对花香产生不同的效果。

香雪兰（Freesia hybrida），又名小苍兰，是鸢尾科（Iridaceae）香雪兰属（Freesia klatt）的多年生草本植物，Klatt^［

22］于1866年建立了该属，香雪兰属植物主要分布在南非开普省南部地区，多数属内物种集中发现于北纬33°附近，生长在干燥的沙质平原到河流边缘。按照其原生习性，香雪兰属植物通常在秋季发芽，在冬季温度为8℃至10℃时开花^{［参考文献 23

百度学术}23］。现有记录表明，香雪兰最早于18世纪开始在欧洲种植，并在19世纪下半叶成为广受欢迎的园艺植物。Burman^{［参考文献 24

百度学术}24］于1768年遵循当时的分类学惯例，将香雪兰划分为剑兰属，直到1866年香雪兰才被划分为1个独特的属，1874年F. Leichtlinii 被发现后，该属才开始被园艺学家关注，香雪兰的种植也变得更加普遍^［25］。质体DNA序列系统发育分析表明，香雪兰属的16个野生种可分为两个亚属，其中Freesia refracta、Freesia speciosa、Freesia alba subsp. Laxa、Freesia grandiflora、Freesia andersoniae、Freesia corymbosa、Freesia verrucosa、Freesia sparrmannii、Freesia viridis为一个亚属，Freesia fucata、Freesia marginata、Freesia occidentalis、Freesia caryophyllacea、Freesia praececox、Freesia fergusoniae、Freesia leichtlinii为一个亚属。Freesia hybrida被认为是Freesia leichtlinii和Freesia corymbosa经长期杂交及多倍化所产生的现代园艺品种的统称^{［参考文献 26-27}26-27］，2021年俄罗斯亚热带科学中心对获得的108个杂交种香雪兰品质性状进行研究，其中7个被“俄罗斯国家遴选成就名录”授权用于生产，进一步推动了香雪兰花卉产业的发展^{［参考文献 28

百度学术}28］。此外香雪兰作为世界十大鲜切花之一，其花朵颜色丰富多彩，香气芬芳馥郁，是研究花色花香的良好材料。

1 香雪兰花色和花香物质

香雪兰因其花色鲜艳、香气宜人受到广泛喜爱。其花朵颜色多种多样，花色最早采用皇家园艺学会比色卡对其进行描述，通过对白色、橙黄色、紫红和蓝紫色系的香雪兰花色进行检测，结果表明香雪兰花色大致包含白色、橙色、红色、蓝色、紫色^［

29］，此外还包括象牙色、黄色、粉色、绿色、双色等（图1）。如图2香雪兰Red River^®中花器官的色素物质主要由花青素（飞燕草素、矮牵牛素、锦葵素、芍药素、矢车菊素衍生物）和黄酮醇（山奈酚和槲皮素衍生物）组成^{［参考文献 30

百度学术}30］。对‘Red Passion’、‘Castro’、‘Gold River’、‘SN Chenghuang’、‘White River5’4个花色不同的品种的类黄酮进行检测，结果表明‘White River’和‘Gold River’均未检测到花青素，而‘Red Passion’、‘Castro’和‘SN Chenghuang’的花青素含量随花瓣开放而增加^{［参考文献 31

百度学术}31］。近年来随着基因工程的发展，基于Illumina平台对小苍兰花瓣转录组进行从头测序，并利用EST-SSR标记对小苍兰种质的多态性进行筛选，为花青素生物合成基因研究提供了有效方法^{［参考文献 32

百度学术}32］。

图1 不同花色香雪兰的园艺种和野生种

Fig.1 Horticultural and wild species of fragrant snow orchids of different flower colors

Freessia vridis：野生种；其余的都为园艺种Freessia vridis：Wild species；The rest are horticultural species

图2 香雪兰Red River^®花器官中检测到的主要花色和花香物质

Fig.2 The main floral color and floral scent detected in the flower organs of Red River^®

此外，经过百余年的驯化，香雪兰的花香仍然得以留存，以栽培种香雪兰Red River^®为例，花香成分含量最多的是单萜类物质芳樟醇，其次是α-松油醇、顺式罗勒烯、反式罗勒烯、1，8-桉叶素、α-蒎烯、D-柠檬烯、α-环柠檬醛、橙花叔醇等挥发性萜类物质，二氢紫罗兰酮、β-紫罗兰酮等类胡萝卜素裂解产物也可以被检测到^［

33］。对‘Rosa Marie’、‘White Wing’、‘金童’、‘曙光’、‘香玫’、‘紫玉’和‘Royal Blue’的花香成分进行检测，结果表明‘Rosa Marie’主要挥发性成分为醇类和烯烃类，而其他6种则以芳樟醇为主要香气成分^{［参考文献 34

百度学术}34］，此外对‘Ancona’、‘Calvados’、‘Summer Beach’、‘Pink Passion’、‘Versailles’、‘SN 2 Hongtaige’、 ‘SN Ruxiang’、‘SN Zimeigui’、‘Soleil’等34种园艺种的挥发物进行检测，均包含单萜物质芳樟醇，此外还含有D-柠檬烯、罗勒烯、月桂烯、α-松油醇以及少量脂肪酸衍生物和苯丙素类物质^{［参考文献 35

百度学术}35］，在对‘Shiny Gold’的花香检测中结果也表明芳樟醇是主要的挥发性化合物^{［参考文献 36

百度学术}36］，这表明香雪兰最主要的挥发性成分为芳樟醇，并且花香资源丰富。

2 花色物质合成的酶学基础

在过去的几十年里，以矮牵牛（Petunia hybrida）、金鱼草（Antirrhinum majus L.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana）等双子叶和玉米（Zea mays）等单子叶植物为模型，解析了花青素的生物合成途径^［

37-38］。研究表明，在单子叶植物香雪兰中也存在相似途径（图3），花色苷的生物合成始于苯丙氨酸途径，经查耳酮合酶（CHS，chalcone synthase）、查耳酮异构酶（CHI，chalcone isomerase）、黄烷酮3-羟化酶（F3H，flavanone 3-hydroxylase）、黄烷酮3'-羟化酶（F3'H，flavonoid-3'-hydroxylase）和类黄酮-3'，5'-羟基化酶（F3'5'H，flavonoid-3'，5'-hydroxylase）羟基化形成二氢槲皮素和二氢杨梅素，编码这些酶的基因通常被认为是类黄酮生物合成途径中的早期基因（EBG，early biosynthetic gene），最后二氢黄酮醇在二氢黄酮醇还原酶（DFR，dihydroflavonol-4-reductase）、花青素合酶（ANS，anthocyanidin synthase）和类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶（3GT，flavonoid-3-O-glucosyltransferas）的作用下转化为有色花青素^{［参考文献 39-41}39-41］。这些酶编码的基因被认为是花青素生物合成途径中的晚期基因（LBG，late biosynthetic genes）。此外，黄酮醇合酶（FLS，flavonol synthase）、无色花青素还原酶（LAR，leucoanthocyanidin reductase）和花青素还原酶（ANR，anthocyanidin reductase）的作用分别导致类黄酮途径产生黄酮醇和原花青素。除了花青素外，黄酮醇对花色的形成也发挥着辅助作用^{［参考文献 42-44}42-44］。

图3 香雪兰Red River^®花色苷合成代谢通路

Fig.3 Anthocyanin anabolic pathway of Red River^®

Phenylalanine：苯丙氨酸；Cinnamic acid：肉桂酸； p-Coumaric acid：对香豆酸；p-Coumaroyl-CoA：香豆酰辅酶A；Malonyl-COA：丙二酰辅酶A； Naringenin chalcone：柚皮素查尔酮；Naringenin：柚皮素； Eriodictyol：圣草酚； Dihydrokaempferol：二氢山奈酚； Flavonol：黄酮醇； Dihydroquercetin：二氢槲皮素； Dihydromyricetin：二氢杨梅素； Leucodelphinidin：无色飞燕草素； Leucopelargonidin：无色天竺葵素； Leucocyanidin：无色矢车菊素； Delphinidin：飞燕草素； Cyanidin：矢车菊素； Delphinidin-3-glucoside：飞燕草素-3-O-葡萄糖苷； Cyanidin-3-glucoside：矢车菊素-3-O-葡萄糖苷； Malvidin-3-glucoside：锦葵素-3-O-葡萄糖苷； Petunidin-3-glucoside：矮牵牛素-3-O-葡萄糖； Peonidin-3-glucoside：芍药素-3-O-葡萄糖苷；PAL：苯丙氨酸解氨酶；C4H：肉桂酸4-羟氢化酶；4CL：4香豆酰辅酶A连接酶；CHS：查耳酮合酶；CHI：查耳酮异构酶；F3H：黄烷酮3-羟化酶；F3'H：黄烷酮3'-羟化酶；F3'5'H：黄酮-3'，5'-羟基化酶；DFR：二氢黄酮醇还原酶；LDOX：无色花青素双加氧酶；3GT：类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶；MT：甲基转移酶

查耳酮合酶是催化类黄酮生物合成途径中的第1个关键限速酶。多重序列比对表明，FhCHS1氨基酸序列中发现了保守的查耳酮合酶活性位点残基和查耳酮合酶特征序列。体外异源表达FhCHS1恢复了拟南芥 tt4 突变体种皮、子叶和下胚轴的色素沉着表型，过表达FhCHS1的转基因矮牵牛花色从白色变为粉红色。综上FhCHS1基因在香雪兰黄酮类化合物的生物合成中发挥着重要作用^［

45］。

相比于花色苷合成通路的上游结构基因，下游结构基因发挥着更重要的作用，其中二氢黄酮醇-4-还原酶作为NADPH依赖型还原酶超家族的一员，在花青素生物合成途径起关键作用。二氢黄酮醇-4-还原酶是一种关键的氧化还原酶，迄今为止，已从多种双子叶植物中分离出二氢黄酮醇还原酶基因，例如百脉根（Lotus japonicus）^［

46］、茶花（Camellia sinensis）^{［参考文献 47

百度学术}47］、苜蓿（Medicago truncatula）^{［参考文献 48

百度学术}48］、苹果（Malus domestica）^{［参考文献 49

百度学术}49］、橙子（Citrus sinensis）^{［参考文献 50

百度学术}50］、番薯（Ipomoea batatas）^{［参考文献 51

百度学术}51］、银杏（Ginkgo biloba）^{［参考文献 52

百度学术}52］和毛果杨（Populus trichocarpa）^{［参考文献 53

百度学术}53］。此外在香雪兰Red River^®中也鉴定出3个二氢黄酮醇还原酶基因，命名为FhDFR1、FhDFR2 和FhDFR3。FhDFRs的过表达恢复了拟南芥tt3-1下胚轴颜色积累的表型，表明FhDFRs可以在植物中将二氢槲皮素转化为无色花青素。体外酶促产物的高相液相色谱分析表明，FhDFR1、FhDFR2和FhDFR3可以利用二氢槲皮素和二氢杨梅素生成无色花青素。相反，转基因分析和生化分析均未证明 FhDFRs 蛋白可以将二氢山奈酚还原为无色天竺葵素。这些结果与香雪兰中检测到的花青素种类一致，大量的飞燕草素衍生物伴有少量花青素衍生物，而天竺葵素衍生物并未检测到。因此，可以推断二氢黄酮醇还原酶的底物特异性是香雪兰中积累的花青素苷元类别的决定因素^{［参考文献 54

百度学术}54］。

花青素往往以糖苷的形式稳定地储存在液泡中，因此糖基化对花青素的合成至关重要。花青素糖苷通常是由UDP-类黄酮糖基转移酶（UFGT，uridine diphosphate glycosyltransferase）催化合成的。在香雪兰中首先分离得到了编码UDP-类黄酮糖基转移酶的基因Fh3GT1，初步证明其参与花青素3-O-葡萄糖苷的生物合成。Fh3GT1可以识别多种类黄酮底物，UDP-葡萄糖和UDP-半乳糖都可以作为Fh3GT1糖基供体，但是Fh3GT1催化UDP-半乳糖的活性相对较低。此外，Fh3GT1能够以糖依赖性方式在3-、4-'和7-位上糖基化飞燕草素。将Fh3GT1基因引入拟南芥UGT78D2突变体后，因类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶功能丧失而导致突变体中的花青素和黄酮醇无法积累的表型得以成功恢复，表明Fh3GT1在体内作为类黄酮3-O-葡萄糖基转移酶发挥作用。此外，矮牵牛稳转实验结果也表明，Fh3GT1的过表达上调了矮牵牛类黄酮合成途径相关基因的表达。这些结果表明，Fh3GT1是一种使用UDP-葡萄糖作为糖基供体的类黄酮3-O-糖基转移酶，可能参与香雪兰中的类黄酮的糖基化修饰^［

28，55］。

此外，花青素的糖基化和黄酮醇的糖基化可能是由不同的3-O-葡萄糖基转移酶控制的，Fh3GT1的表达模式和酶学特征与黄酮醇的积累并不能很好地吻合，因此从香雪兰中克隆出了Fh3GT1的旁系同源基因Fh3GT2、Fh3GT3、Fh3GT4，进一步实验证明只有Fh3GT2具有催化活性，并且Fh3GT2主要催化山奈酚糖基化，而Fh3GT1主要催化槲皮素和花青素的糖基化。原生质体瞬时转染实验表明，Fh3GT2可以被调控黄酮醇表达的转录因子FhMYBF1和调控花青素表达的转录因子FhPAP1激活，而Fh3GT1只能被FhPAP1激活。综上，香雪兰3-O-葡萄糖苷转移酶功能出现了一定程度的分化^［

56］。除了花青素3-O-葡萄糖苷，花青素5-O-葡萄糖苷也发挥着至关重要的作用，烟草过表达Fh5GT1和 Fh5GT2增加了花青素的积累，表明UDP-5-O-葡萄糖苷转基因酶在香雪兰花青素的糖基化中也发挥着重要的作用^{［参考文献 57

百度学术}57］。

除了花青素，类胡萝卜素在香雪兰的着色也发挥着辅助作用，藏红花醛和藏红花素也是类胡萝卜素的衍生物，具有许多重要的应用价值。藏红花醛赋予藏红花辛辣的香气，可用作食用香精^［

58-59］。藏红花酸和藏红花素对心血管疾病、神经系统疾病等多种疾病具有显著的药用和保健功能^{［参考文献 60-62}60-62］，并且还可以抑制恶性肿瘤细胞增殖。与广泛的应用价值相反，藏红花醛和藏红花素仅在少数植物中合成，因此探索更多具有合成藏红花醛和藏红花素潜力的植物至关重要，香雪兰与藏红花同属于鸢尾科，香雪兰Red River^®可检测到藏红花醛和藏红花素。香雪兰中同样存在藏红花CCD2的同源基因。生化分析表明，FhCCD2 在7、8和7'、8' 双键处切割了玉米黄质，生成藏红花醛和藏红花素生物合成所必需的中间体，为香雪兰花色的形成起到辅助作用^{［参考文献 63

百度学术}63］。

3 花色苷转录调控

除了上述结构基因外，植物中类黄酮生物合成所涉及的转录调控机制也得到了广泛的研究。3个不同的转录因子基因家族，包括R2R3-MYB、碱性螺旋-环-螺旋（bHLH，basic Helix-Loop-Helix）和WD40重复序列（WD40），组成一个调节类黄酮代谢的蛋白复合物，称为MBW复合物^［

64］。拟南芥中至少有6个MYB（PAP1、PAP2、MYB113、MYB114、TT2、MYB5）、3个 bHLH（TT8、GL3、EGL3）和1个WD40（TTG1）调节二氢黄酮醇还原酶的表达已得到了很好的阐明^{［参考文献 65-68}65-68］。此外，在玉米、矮牵牛、烟草和其他被子植物中，尤其是双子叶植物中也鉴定出调节二氢黄酮醇还原酶表达的MBW复合物^{［参考文献 37

百度学术}37，69-70］。近期在香雪兰中进一步证实了该调控模型在被子植物中的保守性，从香雪兰中分离出两个 IIIf Clade-bHLH 调节基因FhGL3L和FhTT8L，并进行了功能鉴定。FhGL3L和FhTT8L表达模式与花青素和原花青素积累具有不同的相关性。当FhGL3L在拟南芥中过表达时，可以通过上调拟南芥内源转录因子和下游结构基因来增强花青素的积累，而毛状体形成受到抑制，与AtGL2的下调相关。相比之下，FhTT8L转基因品系中仅花青素和原花青素的积累得到加强。此外，FhGL3L与 AtPAP1、AtTT2 和 AtGL1 相互作用，而 FhTT8L 仅与 AtPAP1 和 AtTT2 相互作用。AtPAP1-FhGL3L/FhTT8L和AtPAP1-AtGL3/AtTT8均可以激活AtDFR的表达。当FhGL3L与强激活域VP16融合时，与AtGL1共转染可以激活AtGL2的表达。因此，可以得出结论，在香雪兰中bHLH转录因子的功能可能存在差异，并且在类黄酮生物合成和毛状体的形成中可能存在复杂的相互作用和调控网络^{［参考文献 71

百度学术}71］。

对香雪兰的WD40基因（命名为 FhTTG1）进行克隆与功能鉴定。FhTTG1可以与FhbHLH蛋白（FhTT8L和FhGL3L）相互作用，构成MBW复合物。此外，还发现FhTTG1向细胞核的运输依赖于FhbHLH转录因子。当FhTTG1与MYB和bHLH共转染时，可以显著激活花青素或原花青素生物合成相关基因启动子，这表明FhTTG1作为MBW复合体的成员来控制香雪兰中花青素、原花青素以及毛状体的生物合成^［

72］。

FhPAP1基因分别在香雪兰、拟南芥和烟草中过表达时，可以激活ABG以及TT8 进化枝FhTT8L、AtTT8和NtAN1基因的表达，并且FhPAP1可以与FhTT8L和FhTTG1相互作用形成保守的MBW复合物，与来自拟南芥的直系同源物共享相似的靶基因。不同的是，FhPAP1比拟南芥和烟草中的同源物表现出更高的反式激活能力，这体现在其对ABG基因的强激活作用上。此外，还发现FhPAP1可能是野生香雪兰物种驯化和快速进化过程中被选择的基因，用以产生强烈的花朵色素沉着。虽然MBW复合物的功能在单子叶植物和核心双子叶植物之间高度保守，但MYB转录因子的激活能力存在差异，并在被子植物的花色驯化和进化中发挥重要作用^［

73］。

在MBW复合体中，MYB转录因子通常起着特异性调控花色的作用，MYB转录因子可以分为MYB激活子和MYB抑制子两类，二者通过MBW复合物形成一个激活抑制的反馈调控网络来平衡花色苷的含量（图4）。FhMYB27和FhMYBx分别被证实是花青素合成相关的R2，R3 MYB和R3 MYB阻遏蛋白。FhMYBx可以通过与bHLH蛋白互作来阻碍MBW复合物的形成，FhMYB27主要通过其C末端的抑制结构域将激活复合物变为抑制复合物进而反馈调节香雪兰花青素的生物合成^［

74］。香雪兰花青素生物合成的复杂的调节网络与双子叶植物中报道的非常相似，进一步证明了被子植物花色苷合成调控网络的保守性。

图4 香雪兰Red River^®花色苷合成转录调控^［

74］

Fig.4 Transcriptional regulation of anthocyanin synthesis of Red River^®

W：FhTTG1蛋白；B：FhTT8L蛋白；绿色椭圆M：FhPAP1蛋白；紫色椭圆M：FhMYB27蛋白；蓝色椭圆M：FhMYB蛋白；箭头均表示激活作用，粉色表示以MBW复合物发挥功能，绿色表示以FhPAP1单独发挥作用；短线表示抑制作用

W： FhTTG1 protein；B： FhTT8L protein；Green elliptical M： FhPAP1 protein；Purple elliptical M： FhMYB27 protein；Blue elliptical M： FhMYBx protein；The arrows indicate activation，pink indicates the function of MBW complex， green indicates the function of FhPAP1 alone；Short lines indicate inhibition

除了FhPAP1， FhMYB5也可以促进花青素和原花青素的合成，香雪兰原生质体单独转染FhMYB5时，晚期类黄酮生物合成基因（例如FhDFR和FhLDOX）略有上调，而当 FhMYB5与FhTT8L或FhGL3L共转染时，早期和晚期类黄酮生物合成基因均显着上调。此外，FhMYB5在烟草和拟南芥中的过表达也可以显着上调类黄酮途径相关基因的表达^［

75］。

4 花香合成的酶学基础

萜类化合物具有异戊二烯的结构单元，由两种常见的五碳前体即异戊烯焦磷酸（IPP， isopentenyl pyrophosphate）及其同分异构体二甲基烯丙基二磷酸（DMAPP，dimethylallyl diphosphate）构成（图5）。根据异戊二烯单元数目不同，萜类化合物可以分为半萜化合物（C5）、单萜化合物（C10）、倍半萜化合物（C15）、二萜化合物（C20）、三萜化合物（C30）、四萜化合物（C40）及不规则萜化合物（C11或C16）等。其中，挥发性的单萜和倍半萜对花香的贡献最大。从合成通路上看，挥发性萜类物质的合成一般可以分为3个阶段。首先是IPP和DMAPP这两种五碳前体的合成。在植物中存在两条不同的五碳前体的合成途径，分别是以乙酰辅酶A为前体物质的甲羟戊酸（MVA， mevalonic acid）途径和以丙酮酸和甘油醛3-磷酸为前体的甲基赤藓醇4-磷酸（MEP， methylerythritol phosphate）途径。IPP和DMAPP形成之后，便可按不同比例在香叶基二磷酸合酶（GPPS，dimethylallyl pyrophosphate）、法呢基焦磷酸合酶（FPPS，farnesyl diphosphate synthase）等酶的作用下缩合生成植物界多种多样的挥发性萜类化合物的直接底物——香叶基二磷酸、橙花基焦磷酸和法呢基二磷酸等^［

76-77］。最后，这些底物经萜类合酶（TPS，terpene synthase）的催化，生成了结构丰富多样的挥发性萜类物质^{［参考文献 78-81}78-81］。目前，在甲羟戊酸途径和甲基赤藓醇4-磷酸途径两种途径中都发现了一系列参与挥发性萜烯催化反应的酶。其中，萜烯合成酶被认为是将香叶基二磷酸（GPP，geranyl diphosphate）和法呢基二磷酸（FPP，farnesyl diphosphate）底物分别转化为单萜烯和倍半萜的关键^{［参考文献 82-83}82-83］。

图5 萜类物质合成代谢通路

Fig.5 Terpenoid anabolic pathway

Acetyl-CoA：乙酰辅酶A；Acetoacety-CoA：乙酰乙酰辅酶A；HMG-CoA：3-羟基-3-甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶；Mevalonate：甲羟戊酸；MVP：甲羟戊酸-5-磷酸；MVPP：甲羟戊酸-5-二磷酸；IPP：异戊烯基焦磷酸；DMAPP：二甲基烯丙基焦磷酸；FPP：法呢基二磷酸；Sesquiterpenes：倍半萜烯；Pyruvate：丙酮酸；G3P：甘油醛-3-磷酸；DXP：1-脱氧-木酮糖-5-磷酸；MEP：2C-甲基-D-赤藓醇-4-磷酸；CDP-ME：4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓；CDP-MEP：4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇-2-磷酸；MECDP：2C-甲基-D-赤藓醇环二磷酸；HMBPP：1- 羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基 4-二磷酸；GGPP：香叶基香叶基二磷酸；GPP：香叶基二磷酸；Carotenoids：类胡萝卜素；Monoterpenes：单萜；Volatile carotenoid Derivatives：挥发性类胡萝卜素衍生物；AACT：乙酰乙酰CoA硫解酶；HMGS：羟甲基戊二酰CoA合酶；HMGR：羟甲基戊二酰CoA还原酶；MK：MVA激酶；PMK：二氧磷基MVA激酶；MPD：MVA焦磷酸脱羧酶；DXS：脱氧木酮糖-5-磷酸合酶；DXR：脱氧木酮糖磷酸盐还原异构酶；CMS：4-二磷酸胞苷-2-C-甲基-D-赤藓醇合酶；CMK：4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤藓糖激酶；MCS：2-甲基赤藓糖-2，4-环二磷酸合酶；HDS：1-羟基-2-甲基-2-（E）-丁烯基4-二磷酸合酶；IPK：异戊烯基单磷酸激酶；IDI：异戊烯基二磷酸异构酶；IDS：异戊二烯二磷酸合酶；FPPS：法呢基二磷酸合酶；GPPS：香叶基二磷酸合酶；GGPPS：香叶基香叶基二磷酸合酶；TPS：萜烯合酶；红色字体代表催化反应的酶，实线箭头表示直接催化，虚线箭头表示间接催化

The red font represents the enzyme that catalyzed the reaction， the solid arrow indicates direct catalysis， and the dotted arrow indicates indirect catalysis

根据序列和功能的相关性，TPS基因家族在系统发育上分为7个亚家族（TPS-a～TPS-h）^［

84］。迄今为止，TPS基因已在多种植物中被鉴定到^{［参考文献 85-88}85-88］，例如拟南芥^{［参考文献 87

百度学术}87］、番茄（Solanum lycopersicum）^{［参考文献 81

百度学术}81］、橙子（Citrus sinensis）^{［参考文献 88

百度学术}88］、桉树（Eucalyptus robusta Smith）^{［参考文献 89

百度学术}89］、葡萄（Vitis vinifera）^{［参考文献 90

百度学术}90］、苹果（Malus pumila）^{［参考文献 91

百度学术}91］和基部被子植物无油樟（Amborella trichopoda）^{［参考文献 92

百度学术}92］。从香雪兰 Red River^®和Ambiance两个释放不同类别挥发性化合物的品种中分离得到了8个FhTPS基因。通过顶空固相微萃取收集并通过GC/MS分析技术鉴定了两个品种的花香成分，结果表明在香雪兰花中总共检测到31种挥发性萜类物质，其中Red River^®有18种，Ambiance有19种，Red River^®和Ambiance含量最多的成分均为芳樟醇。相对而言，Red River^®含有更多种类的单萜而Ambiance则含有更多种类的倍半萜。进一步的分析结果表明，萜烯合酶基因TPS是决定两个品种中挥发性有机化合物差异的关键基因，从而克隆了Red River^®和Ambiance的TPS基因，命名为FhTPS1～FhTPS8，其中FhTPS5的序列无法从Ambiance中克隆出来，而FhTPS7则仅在Ambiance中获得。进一步的氨基酸序列比对结果表明，所有FhTPS蛋白均含有保守的DDXX（D/E）和（N，D）DX2（S，T，G）X3E（NSE/DTE）结构域，这些结构域对于辅助因子Mg²⁺的结合以及Mn²⁺催化萜烯生物合成至关重要。此外，FhTPS1、FhTPS2、FhTPS3和FhTPS5还具有另一个保守基序RRX8W，该基序负责催化单萜环化。系统进化分析表明，FhTPS6、FhTPS7和FhTPS8属于TPS-a进化枝；FhTPS1、FhTPS2、FhTPS3和FhTPS5属于TPS-b进化枝，而FhTPS4独立聚类到TPS-g进化枝中。通过体外酶活实验以及本氏烟草瞬转实验鉴定了FhTPS的功能。FhTPS1将香叶基二磷酸转化为单萜芳樟醇；FhTPS2主要将香叶基二磷酸转化为α-松油醇等单萜类物质；FhTPS8主要将法呢基二磷酸转化为α-古芸烯等倍半萜类物质。而FhTPS4、FhTPS6和FhTPS7可以同时识别香叶基二磷酸和法呢基二磷酸生成单萜和倍半萜类物质，其中FhTPS4可以催化香叶基二磷酸形成芳樟醇，催化法呢基二磷酸形成橙花叔醇；FhTPS6可以催化香叶基二磷酸形成月桂烯等单萜类物质，催化法呢基二磷酸形成α-芹子烯等倍半萜类物质；FhTPS7可以催化香叶基二磷酸形成月桂烯等，催化法呢基二磷酸形成可巴烯等倍半萜类物质；FhTPS3、FhTPS5则不具有催化功能；FhTPS2仅在Red River^®表达，FhTPS7在Ambiance表达量更高，并且其对法呢基二磷酸更高的利用效率导致了Ambiance比Red River^®释放出更多的倍半萜^{［参考文献 32

百度学术}32］。

除了香雪兰栽培种外，对8种野生种香雪兰的TPS基因进行了功能鉴定，并深入地研究了主要TPS等位基因以及关键氨基酸残基的功能。如图6所示，除了先前报道的现代园艺种中的8条TPS基因之外，又发现了7种新TPS基因，命名为FhTPS9~FhTPS14，它们控制不同香雪兰野生种中特异的萜类物质的合成。其中FhTPS9主要控制芳樟醇的合成，TPS10主要控制β-石竹烯的合成，TPS11主要控制α-法呢烯的合成，TPS12主要控制蒎烯的合成，TPS13主要控制柠檬烯的合成，TPS14主要控制橙花醇的合成。其中TPS2和TPS10的等位变异显著地影响了其编码蛋白的催化活性，并鉴定到了决定强催化能力的关键的氨基酸位点或基序。例如8个野生种中的TPS2在大多数位点具有相同的氨基酸序列，然而FleTPS2能够利用底物香叶基二磷酸产生α-松油醇，FcaTPS2则几乎检测不到α-松油醇的生成，除了基因表达差异以外，点突变实验结果表明，97位和205位的氨基酸残基可能决定α-松油醇的形成，证实了香雪兰属中等位基因确实存在功能差异的事实。TPS10催化的β-石竹烯在8种野生香雪兰物种中也表现出高度的释放差异，FviTPS10基因插入一段RIVVN氨基酸序列，而FviTPS10中RIVVN的缺失显著抑制了其β-石竹烯的形成。TPS的等位变异不仅影响了它们的催化活性，还可以影响编码蛋白的催化产物的种类和各产物之间的比例，而且这种产物种类和比例的差异也是由少量的氨基酸位点决定，FspTPS6的287位单个氨基酸变化显著影响了FspTPS6的产物组成。415、416位的氨基酸突变很大程度上影响了FspTPS6的功能。此外还选择FfeTPS6和FcoTPS6，通过上述类似的策略进一步探索影响这2种蛋白功能的关键位点。结果表明，447位和450位的氨基酸对于α-芹子烯的形成至关重要，可能是F. fergusoniae和F. corymbosa之间倍半萜类物质释放差异的原因。

图6 野生种香雪兰萜类物质合成代谢通路（稍有改动）^［

93］

Fig.6 Anabolic pathway of terpenoids in the wild species of the Freesia genus （Slight changes）

E-nerolidol：E-橙花叔醇；α-gurjunene：α-古芸烯；α-bergamotene：α-香柠檬烯；α-selinene：α-芹子烯；α-copaene：α-蒎烯；β-caryophyllene：β-石竹烯；（+）-△-cadinene：（+）-△-杜松烯；（Z）-β-ocimene：（Z）-β-柠檬烯；γ-terpinene：γ-松油烯；Myrcene：月桂烯；Linalool：芳樟醇；Nerol：橙花醇；Geraniol：牻牛儿醇；α-terpineol：α-松油醇；Sabinene：烩烯；（1R）-（+）-α-pinene：右旋α-蒎烯；CCDs：类胡萝卜素裂解双加氧酶；紫色箭头表示花香成分为倍半萜，蓝色箭头表示花香成分为类胡萝卜素衍生物，绿色箭头表示花香成分为单萜；实线箭头表示直接催化，虚线箭头表示间接催化，短线表示不能催化；黄色横线代表FfeTPS6蛋白，绿色横线代表FcoTPS6蛋白；花朵比例尺长度为1 cm

The purple arrow indicates that the floral component is sesquiterpens， the blue arrow indicates that the floral component is carotenoid derivatives， the green arrow indicates that the floral component is monoterpens， the solid arrow indicates direct catalysis， the dotted arrow indicates indirect catalysis， and the short line indicates that it cannot be catalyzed， the yellow horizontal line represents FfeTPS6 protein， the green horizontal line represents FcoTPS6 protein， and the length of the flower scale bar is 1 cm

上述结果完善了香雪兰植物中的花香基因资源，对野生植物物种中TPS基因的功能多样性和进化提出了新的见解，证明TPS基因的天然变体序列之间的微小氨基酸差异驱动了酶的催化活性和产物特异性，为阐明花香种间的遗传差异奠定了基础。此外，经过功能验证的TPS蛋白以及关键氨基酸位点的鉴定也将有助于建立具有芳香气味的花卉品种^［

93］。

5 花色花香协同调控

芳樟醇是香雪兰花香中含量最丰富的成分，而芳樟醇的形成由单萜合酶FhTPS1催化。以往的研究表明，调控TPS基因表达的转录因子种类众多，如MYB^［

94-95］、bHLH^{［参考文献 96

百度学术}96］、WRKY^{［参考文献 97

百度学术}97］、NAC^{［参考文献 98

百度学术}98］、bZIP^{［参考文献 99

百度学术}99］、AP2/ERF^{［参考文献 100-102}100-102］、SBP^{［参考文献 103

百度学术}103］和SRS^{［参考文献 104

百度学术}104］等类型。最近的研究表明在香雪兰花朵发育过程中两个MYB转录因子基因FhMYB21L1和FhMYB21L2与FhTPS1同步表达（图7），FhMYB21L1和FhMYB21L2可与FhTPS1启动子中的MYBCORE位点结合直接激活FhTPS1表达。与FhMYB21L2相比，FhMYC2表现出相反的表达模式，它的表达导致FhMYB21L2与FhTPS1启动子的结合减少，从而降低了共表达时的激活能力。在拟南芥中，AtMYB21和AtMYC2调节因子均被证明可以激活倍半萜合酶基因的表达，并且AtMYB21和AtMYC2在芳樟醇合酶基因表达中的调节作用也得到证实，这意味着MYB-bHLH复合物在这些基因中具有保守功能。综上MYB-bHLH复合物可以协同调控FhTPS1基因表达，从而控制芳樟醇在开花过程中的释放。此外，FhMYB21还可以调控黄酮醇合酶基因FhFLS2的表达，黄酮醇作为类黄酮的一种对花色的合成具有辅助作用。在香雪兰开花过程中发现了两个拷贝的FLS基因，FhFLS1有助于早期花芽、花托和花萼中的黄酮醇生物合成，受到SG7家族的MYB转录因子FhMYBF的调节，而 FhFLS2负责花朵发育晚期以及花瓣、雄蕊和雌蕊中的黄酮醇生物合成，由SG19家族的MYB转录因子FhMYB21L2调控。研究还发现AtMYB21和AtMYB24可以激活AtFLS1的表达，MYB21对FLS基因调控在香雪兰和拟南芥两个物种中的保守性，同时也表明花色花香的合成可能受到同一个转录因子调控，为阐释花香花色协同调控关系具有重要的理论价值和应用价值^{［参考文献 105-106}105-106］。

图7 FhMYB21L2与FhMYC2协同调控香雪兰FhTPS1和FhFLS2模式图

Fig.7 FhMYB21L2 and FhMYC2 synergistically regulate FhTPS1 and FhFLS2 patterns of Sycophantasia

6 展望

通过对不同野生种与园艺种的花色与花香的检测和鉴定，王丽等^［

107］前期利用染色体工程技术培育出5个具有花型大、花色艳、植株高等优良性状的香雪兰新品种，这表明研究花色花香的规律可以更好地指导亲本选配和提高杂交育种的效率。此外在香雪兰中不同种野生种中花香花色成分存在有和无的差异，这表明可以通过正向遗传学建立杂交群体通过混池测序（BSA seq）定位相关花色花香基因，开发紧密连锁分子标记，用于分子标记辅助选择育种。

我国是世界上众多花卉的起源和分布中心，然而大部分花卉品种依赖于进口。用基因编辑等分子育种手段，缩短驯化周期、加快育种进程，是实现我国花卉种业快速发展的有效途径。基因编辑技术育种依赖于重要性状形成机制的解析，而花香、花色是花卉作物重要的观赏性状，其多样性决定了花卉作物的品质和经济价值。研究表明，花卉植物在驯化和进化的历程中，花香和花色经常呈现协同变化的规律，表明了二者之间可能存在的复杂的内在联系。挥发性萜类物质、花色苷和类胡萝卜素是植物界广泛存在的影响花香、花色形成的最重要的色香物质，要想厘清花香、花色之间的协同变化机制，可以从阐释3类色香物质生物合成的协同调控机制入手。近年来，上述3类色香物质的合成和调控机制一直是植物分子生物学和观赏园艺领域的研究焦点，然而大部分工作都是单独聚焦个别物质开展，难以解释其控制的花香花色的协同变化机制。因此，需要寻找一种代表性观赏花卉研究并揭示花香花色协同形成的调控机制，为利用基因编辑技术进行花卉作物新品种培育提供靶点。

香雪兰作为单子叶球根草本花卉，目前已建立了组织和细胞水平的瞬时转化体系^［

108］，且可以进行稳定的遗传转化^{［参考文献 109

百度学术}109］，使得香雪兰已经具有发展成为球根花卉分子生物学研究的代表性物种的潜力。此外香雪兰花朵颜色鲜艳、香气宜人，并且花朵颜色与气味随着花朵发育呈现出协同变化。花朵发育早期无色无香，随着花朵发育花朵着色挥发出香味物质，这表明香雪兰中可能存在着一套或多套系统协同控制花色花香的形成，尽管一些转录因子已被证明可以调节颜色和气味通路基因或酶，但关于它们的真实功能、功能保守性、相互关系以及它们如何对信号通路做出反应仍然存在差距。总之，花朵内部一定存在一个高度复杂的网络，它整合了所有可以想象的因素，以精细调节颜色的合成和气味的形成^{［参考文献 110

百度学术}110］，值得进一步的研究。

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