三个大豆<bold>ms3</bold>雄性不育突变体的等位突变分析

朱玉雪; 黄圆圆; 徐研; 付爱根; 徐敏; 余君萍; ZHU Yuxue; HUANG Yuanyuan; XU Yan; FU Aigen; XU Min; YU Junping

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西北大学生命科学学院/西部资源与生物技术教育部重点实验室/陕西省生物技术与生化工程重点实验室，西安 710069

最近更新：2024-06-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20231231004

摘要

大豆雄性不育系对发挥大豆杂种优势具有重要价值，然而传统的三系杂交存在恢复系来源受限等问题，而环境敏感型细胞核雄性不育系在不同条件下育性可以改变。本文对ms3（Washington）、ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）3个独立突变体的表型和突变位点展开了进一步研究，分别进行了不育表型鉴定、高通量测序、分子标记设计及突变位点验证、分析突变对MS3蛋白结构的影响、ms3（Plainview）花药半薄切片等实验。实验结果表明突变体花粉大量败育，只有零星被I₂-KI染液染成黑色的不规则花粉粒。高通量测序结果显示，ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）在MS3第3个外显子的PHD编码区域出现了大片段插入，导致MS3蛋白PHD结构域被破坏，这个等位基因命名为ms3-1；ms3（Plainview）在MS3第1个外显子缺失了一个A，导致移码突变，开放读码框仅编码40个氨基酸，蛋白功能完全丧失，这个等位基因命名为ms3-2。半薄切片结果显示，在花药发育中后期ms3（Plainview）的绒毡层和花粉发育出现异常。综上，本研究的结果为ms3的应用和MS3基因改造提供了材料和依据。

关键词

大豆; 细胞核雄性不育; MS3; PHD结构域

大豆起源于中国，是重要的粮食作物，为人类提供植物蛋白和油脂^［

1］。亚洲人长期以来的饮食习惯和养殖模式决定了对大豆的大量需求。然而由于我国耕地面积不足、大豆单产不高，导致大豆总产量不足以满足国内需求，因此我国大豆严重依赖进口^{［参考文献 2-3}2-3］。为了国家粮食安全发展，提高大豆单产成为育种家的首要目标。杂交育种可以显著提高作物的产量^{［参考文献 4

百度学术}4］，根据导致雄性不育基因的来源不同，雄性不育可分为细胞核雄性不育和细胞质雄性不育。而细胞核雄性不育又根据其败育的稳定程度分为稳定雄性不育和条件敏感型雄性不育^{［参考文献 5

百度学术}5］。条件敏感型雄性不育的育性转换因素一般为光周期、温度和湿度等环境因子，因此又可以分为光敏雄性不育、温敏雄性不育、光温敏雄性不育和湿度敏感型雄性不育。生产上常用的杂交育种体系分为由细胞质雄性不育系介导的三系杂交育种和由光温敏雄性不育系介导的两系杂交育种^{［参考文献 6-9}6-9］，目前前者已成功应用于大豆杂交种创制^{［参考文献 9

百度学术}9］。稳定细胞核雄性不育突变体由于育性稳定、恢复材料广泛，近年来通过转基因技术人工构建保持系也突破了稳定不育系繁种的瓶颈，在杂种优势中应用潜力巨大^{［参考文献 10-14}10-14］。

迄今为止，在大豆中已经鉴定出大约30个细胞核雄性不育系，其中ms0、ms1~ms9、msp、msNJ、ms12^［

15-17］属于雄性不育雌性可育类型，ms1、ms2、ms3、ms4、ms6和ms12^{［参考文献 16

百度学术}16，18］不育位点已得到克隆鉴定。ms1（Glyma.13g114200）编码酪蛋白样蛋白GmNACK2，该蛋白作为丝裂原活化蛋白激酶（NPK1，nucleus- and phragmoplast-localized protein kinase 1）活性的激活剂，在减数分裂过程中发挥作用，在ms1中GmNACK2蛋白被破坏，导致第二次减数分裂结束后，小孢子母细胞无法正常分裂，形成多核小孢子，进而造成雄性不育^{［参考文献 10

百度学术}10，19-20］。ms2（Glyma.10g281800）在第833位出现一个点突变，T被C取代，异亮氨酸变为苏氨酸，且该基因第3个外显子C端15 bp和第3个内含子N端159 bp的片段被16 bp的新序列取代，发生移码突变，导致氨基酸翻译在102位过早终止^{［参考文献 21

百度学术}21］。MS2基因编码bHLH（Basic Helix-Loop-Helix）转录因子，参与花药和花粉的发育以及花粉内壁和外壁的形成，而ms2突变体花药在四分体时期退化，无法释放小孢子，导致雄性不育^{［参考文献 21

百度学术}21］。ms3由Glyma.02g107600突变导致，该基因编码一个PHD-finger结构域，ms3突变体中PHD结构域被破坏，导致ms3出现光敏雄性不育表型^{［参考文献 22

百度学术}22］。ms4（Glyma.02g243200）则在第3个外显子存在一个碱基A的插入，导致移码突变，终止密码子过早出现，从而产生只含有430个氨基酸的截短蛋白，且截短蛋白中不包含PHD蛋白，致使突变体无法产生有活力的花粉^{［参考文献 23

百度学术}23］。在ms6 （Ames1）中，Glyma.13g066600存在一个点突变，导致GmTDF1-1 DNA结合域的第76位亮氨酸被组氨酸取代。TDF1（Tapetal Development and Function 1）是一种R2R3 MYB转录因子，在调节绒毡层退化中发挥作用，GmTDF1-1是大豆中的同源蛋白，在调节绒毡层发育与退化、花药壁层发育和小孢子减数分裂等方面发挥作用，突变体GmTDF1-1蛋白被破坏，导致花粉败育^{［参考文献 24

百度学术}24］。ms12突变体中编码CDC20蛋白的MSA基因存在343 bp的碱基缺失，导致蛋白C端WD40结构域被破坏。在拟南芥中，CDC20家族成员在减数分裂染色体的分离中发挥作用，cdc20.1是一个雄性不育突变体，而ms12的染色体在减数分裂中期（Ⅱ）在细胞内呈弥散状分布在赤道板上，所以MSA的候选基因可能是CDC20的同源基因^{［参考文献 16

百度学术}16］。

最近三年对大豆细胞核雄性不育位点的鉴定和功能报道显示，ms1、ms2、ms4、ms6都是稳定的细胞核雄性不育突变体，只有ms3是一个条件敏感型细胞核雄性不育突变体。然而，ms3突变体最早于1971年在Calland×Cutler的F₃群体中发现，此突变体命名为ms3（Washington），又称为T273^［

25］，而后大豆中又发现了两个独立的ms3突变体，ms3（Flanagan）（T284）和ms3（Plainview）（T291）。ms3（Flanagan）（T284）可能是Wabash的天然异交后代，父本未知，其突变等位基因命名为ms3（Flanagan）^{［参考文献 26-27}26-27］。ms3（Plainview）（T291）发现于（Viking×Classic II）×（Mitchell×Columbia）的F₂群体^{［参考文献 28

百度学术}28］。这3个突变体均被报道是稳定的细胞核雄性不育突变体。2009年，Cervantes-Martinez等^{［参考文献 29

百度学术}29］将ms3定位在2号染色体上两个简单重复序列（SSR， simple sequence repeat）分子标记（Satt 157和Satt 542）之间。2022年，Hou等^{［参考文献 22

百度学术}22］发现ms3由Glyma.02g107600最后一个外显子末端突变导致，报道的ms3等位突变在基因第1882位之后序列发生了改变，导致终止密码子在第1885~1887位提前出现，编码MS3蛋白C末端只剩部分PHD结构域。Hou等^{［参考文献 22

百度学术}22］使用的ms3突变体育性受到了光周期的调控：日照时长短于13.5小时，突变体完全不结荚；日照长于15.5小时，突变体单株结荚数为8~27个；日照在13.5~15.5小时之间（中等长度），单株结荚数为2~6个。通过CRISPR/Cas9在Williams 82中敲除MS3基因的PHD结构域的完整编码区后，突变植株在中等长度日照条件下不结实^{［参考文献 22

百度学术}22］。这说明不同等位突变对MS3基因功能的影响是不同。

为探究ms3（Washington），ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）中的MS3位点的突变类型，本文对ms3（Washington），ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）的材料分别进行了高通量测序，对相应的ms3不育位点进行了鉴定，并对ms3新的等位ms3（Plainview）突变体进行了表型分析。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本实验从美国国家植物种质中心（U.S. National Plant Germplasm System）获得了3种ms3的杂合子后代T273H （PI 548250）、T284H（PI 548261）和T291H（PI 548268），并从中分离出纯合突变体ms3（Washington）、ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）及相应的纯合野生型MS3（Washington），MS3（Flanagan）和MS3（Plainview），用于进一步研究。

以上材料于2023年5月中下旬种植于陕西省西安市碑林区（108.93 °E， 34.23 °N），种植方式采用室外营养土培养（5~6株/盆，规格5.5 cm×5.5 cm×6 cm，口径5.5 cm，底径3.5 cm，高度6 cm），日照时长在12 h 10 min 至14 h 30 min。

1.2 突变体的表型鉴定

体式显微镜观察：分别取纯合突变体ms3（Washington）、ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）及相应的纯合野生型MS3（Washington）、MS3（Flanagan）和MS3（Plainview）初开的花朵（盛开不到3小时），置于体式显微镜（目镜放大倍数10×，物镜放大倍数0.7~4.5×）下进行解剖观察及拍照。观察内容包括野生型和突变体的完整花朵以及去掉萼片和花瓣之后的雄雌蕊部分，每种类型的材料观察3株，每株观察3~5朵。

花粉育性观察（碘染）：从开放前一天的花苞中取出花药，置于滴有I₂-KI溶液（碘化钾2g，蒸馏水300 ml，碘1g）的载破片上，用镊子夹碎花药释放花粉，用I₂-KI溶液染色。染色后样品置于光学显微镜（目镜放大倍数10×，物镜放大倍数20×）下，观察花粉在I₂-KI溶液中的染色情况，判断花粉育性。

1.3 DNA提取和高通量测序

大豆基因组DNA（gDNA）的高通量测序样品用植物基因组DNA试剂盒（CW0531M，康为世纪）提取，ms3（Washington）、ms3（Flanagan）、ms3（Plainview）和Williams 82的叶片DNA利用经典CTAB法^［

30］提取，取植株顶端幼嫩叶片100 mg左右。

之前报道表明ms3是由于Glyma.02g107600基因突变而导致的，该基因在Williams 82参考基因组（Wm82.a2.v1）中的位置为Gm02：10，270，908~10，267，934 bp。为了探明3个ms3突变体在Glyma.02g107600位点发生了何种变异，本研究对3个突变体材料进行了二代高通量测序。首先通过观察花粉育性区分不育单株，分别选取ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）各8株，ms3（Washington）12株，取植株顶端大小一致的幼嫩叶片 1~2片，提取gDNA并进行质检，质检合格后，应用华大DNBSEQ测序平台进行PE150测序，测序深度为30×。得到测序文件后，将过滤掉低质量和接头污染的clean reads用BWA（Burrows-Wheeler Aligner ）软件比对到参考基因组Wm82.a2.v1上。比对得到的bam格式文件通过IGV （Integrative Genomics Viewer）工具进行查看，SNP和InDels用GATK进行检测^［

31］。

1.4 PCR扩增和Sanger测序

为了验证ms3的突变位点，利用大豆基因组DNA（gDNA）进行PCR扩增。首先，ms3-2突变无法使用常规分子标记进行判断，需采用PCR-Sanger测序结合法。因此设计1对特异性扩增突变位点的引物MS3-2F/MS3-2R，获得目的片段（1500 bp左右），切下目的条带送至生工生物公司（西安），利用上游引物MS3-2F进行Sanger测序。第二，针对ms3-1有大片段序列插入的特点，设计2对引物，1对检测MS3（MS3WT-1F/MS3WT-1R），另1对特异性检测ms3-1（MS3WT-1F/MS3MU-1R）。引物使用SnapGene软件设计，引物序列见表1。PCR反应体系为40 μL，含2×Prime STAR Mix DNA 聚合酶预混液（高保真）（Takara）20 μL，上下游引物各0.8 μL，DNA模板2 μL，ddH₂O 16.4 μL。PCR扩增程序为：98 ℃ 预变性1 min；然后 98 ℃变性10 s，53 ℃退火15 s，72 ℃ 延伸15s，共循环32次；最后72 ℃延伸5 min。扩增产物通过1%琼脂糖凝胶电泳（1×TAE）进行检验分析。

表1 鉴定突变位点所用引物

Table 1 Primers for identification of mutation sites

引物名称 Primer name	引物序列（5'-3'） Primer sequences（5'-3'）
MS3-2F	GATAGAAGCTACACAAGTTCC
MS3-2R	GAGTCGATGCCTTCTACTAAC
MS3WT-1F	TAGGAAACTACTTGGTTCGTCG
MS3WT-1R	GGGCTTCATCATTTGGAATTCG
MS3MU-1R	GGCTATCAAACTAGTTTGACTC

1.5 MS3蛋白结构的预测

登录Alphafold网站（https：//alphafold.ebi.ac.uk/），输入MS3氨基酸序列在线预测蛋白三级结构，下载预测文件，使用软件PyMOL进行编辑，分析突变对MS3蛋白结构的影响。

1.6 花药半薄切片

ms3（Plainview）具有一个新的等位突变，且是一个功能完全丧失型突变体。为了解析MS3蛋白完全丧失后对花药发育有何影响，对ms3（Plainview）和对应野生型MS3（Plainview）各发育时期的花药进行半薄切片和显微观察。采集 MS3（Plainview）和ms3（Plainview）的花序置于FAA溶液（乙醇∶乙酸∶甲醛∶水=5∶1∶1∶3）中抽气30 min以上，更换新鲜的FAA固定液4 ℃长期保存。固定后的花序经梯度乙醇溶液（50%、60%、70%、85%、95%）脱水，每梯度脱水10 min，然后用无水乙醇脱水处理两次，每次 30 min。完全脱水后的材料经饱和番红乙醇溶液（番红1.5 g、无水乙醇100 ml）染色2 h，采用 Heraeus Kulzer Technovit H7100-GMA试剂盒（海德创业生物科技有限公司）进行渗透和包埋处理，具体操作步骤如下：用树脂和无水乙醇等体积混合配制预渗透液，将材料浸没在预渗透液中处理2 h。倒掉预渗透液，将材料浸没在渗透液（1 g 硬化剂 I 溶解于100 ml 树脂）中 4 ℃过夜处理。用镊子将材料摆放在包埋板孔中，使花苞的顶端朝向包埋板孔的两端，吸取聚合液（15 ml 渗透液混合1 ml 硬化剂 II）于包埋板孔中至聚合液完全覆盖材料。将包埋板置于42 ℃ 烘箱中约 30 min，待聚合液凝固后，再将包埋板置于 65 ℃烘箱中，放置 48 h以上。用 Leica RM2265 半薄切片机将包埋后的材料切成 2 μm 的薄片，固定于载玻片上，用0.5%甲苯胺蓝染液染色，经过中性树胶封片后在光学显微镜下拍照观察。

2 结果与分析

2.1 3个ms3突变体的表型观察

3个ms3突变体与其对应的野生型在花的外观形态一致，没有明显区别（图1A、E、I）。在花盛开初期，野生型花药已经开裂，可观察到大量花粉包裹在花药上，而突变体花药干瘪，花药上无花粉包裹（图1B、F、J）。I₂-KI染色及显微观察也显示，野生型花药可以释放大量游离且饱满的圆形花粉粒（图1C、G、K），花粉粒被染成均匀的黑色，而3个ms3花药中只释放出零星的不正常的花粉粒（图1D、H、L），花粉粒出现抱团、大小形状不规则、无法被染成黑色等状况。ms3（Plainview）花粉败育现象相比其他两个等位尤为严重，观测视野中基本没有任何花粉粒（图1L）。以上观察结果表明，ms3（Washington）、ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）花粉在前期发育中就出现了问题。另外发现ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）偶尔会结1个荚，而ms3（Plainview）从未出现自结荚现象（结果未显示），结合花粉观测的结果（图1C-D、G-H、K-L），ms3（Plainview）的基因突变可能对花粉发育造成了更不利的影响。通过对3个ms3突变体与其对应的野生型的表型观察可以发现，3个ms3突变体表现出明显的不育特征。

图1 ms3三个等位突变和对应野生型的表型

Fig.1 Phenotypic of three allelic mutations of ms3 and corresponding wild type

A、B、E、F、I、J：标尺=1 mm；C、D、G、H、K、L：标尺=100 μm。红色箭头和蓝色箭头分别指示正常的（左侧）和异常的（右侧）花药表型（B、F、J）；红色三角箭头和蓝色三角箭头分别指示I₂-KI染色正常（C、G、K）与异常（D、H、L）的花粉粒；橙色三角箭头指示I₂-KI染色正常，但形态异常的花药粒（H）

A，B，E，F，I，J： Scale bar=1 mm； C，D，G，H，K，L： Scale bar=100 μm. The red and blue arrows indicate normal （left） and abnormal （right） anther phenotypes （B， F， J）； Red and blue arrowhead indicate normal （C， G， K） and abnormal （D， H， L） pollen grains with I₂-KI staining； The orange arrowhead indicates normal stained pollen grains with abnormal morphology （H）

2.2 3个ms3突变体中的等位突变分析

高通量测序的比对结果显示，ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）突变体序列在Gm02：10，268，024~10，268，032 bp处出现了异常堆积，没有reads可以横跨这个区间，造成了一个断点，说明该处有序列插入（图2A）。进一步对该区间reads进行序列比对，发现ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）的插入旁邻序列是一致的，插入事件造成断点处序列“AGTAGGTGT”在插入片段两端出现同向重复（图2C）；比对到断点两边的reads之间没有序列重叠（图2C），根据从断点两端获得的最长的插入序列推断，该插入片段长度大于240 bp。测序数据还显示ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）的插入事件与之前发表的ms3相同^［

22］（图2C），说明它们的突变位点来源相同，因此，将这个等位突变命名为ms3-1（图3A）。

图2 3个ms3突变体中的等位变异

Fig. 2 Characterization of mutant alleles in three ms3 lines

A：ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）的突变位点；红色矩形框标注异常堆积。B：ms3（Plainview）的突变位点；红色箭头指示的是碱基缺失。C：ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）突变位点reads分析。蓝色的矩形框指示的是插入位点的正向重复序列。红色小写字母指示的是突变体中的插入序列

A： Mutation sites in ms3 （Washington） and ms3 （Flanagan）； The red rectangle indicates abnormal mapping of reads. B： The mutation site in ms3 （Plainview）； The red arrow points to a base deletion. C： The reads analysis around the MS3 mutated site of ms3（Washington）and ms3（Flanagan）. The blue rectangles indicate the forward repeat sequence of insertion sites. The red lowercase letters represent the insertion sequence of the mutant

图3 ms3等位突变位点的鉴定

Fig.3 Identification of ms3 allelic mutation sites

A：MS3的基因和蛋白结构模式图。红色箭头指示的是突变位点。黑色矩形框指示的是外显子区域。绿色矩形框指示的是MS3蛋白PHD（Plant homeobox domain）结构域。B：PCR测序结果显示ms3（Plainview）的突变位点。红色矩形框表示MS3 （Plainview）、ms3 （Plainview）和杂合子之间的序列差异。C：共显性的方法鉴定ms3（Washington），ms3（Flanagan）存在大片段的插入。Marker：DL2000 。Het：杂合子

A： Gene and protein structure model of MS3.The red arrow indicates the mutation site. The black rectangular box indicates the exon region. The green rectangle indicates the MS3 protein PHD （Plant homeobox domain） domain. B： PCR sequencing showed the mutation site of ms3（Plainview）. The red rectangular box indicates the sequence difference among the MS3 （Plainview）， ms3 （Plainview） and heterozygotes. C： The co-dominant method identified the presence of large fragment insertion in ms3（Washington） and ms3 （Flanagan）. Marker： DL2000. Het： Heterozygote

ms3（Plainview）的测序数据显示，它与ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）不同，在Gm02：10，268，024~10，268，032 bp处序列正常（图2A），但在位于Gm02：10，270，875 bp处的T碱基发生了缺失（图2B），由于参考基因组显示的是负链，这个位点对应的是Glyma.02g107600基因第28位的A碱基（图3A），是一个新的等位突变，将其命名为ms3-2。单碱基缺失导致ms3-2出现移码突变，蛋白翻译至第40个氨基酸就提前终止（图3A）。

高通量测序结果确定了ms3（Washington）、ms3（Flanagan）和ms3（Plainview）的突变位点，并将ms3（Washington）和ms3（Flanagan）的等位突变命名为ms3-1，ms3（Plainview）的等位突变命名为ms3-2。ms3-1在MS3第3个外显子的PHD编码区域存在一个大片段插入，ms3-2则在MS3第1个外显子缺失了一个碱基A。

2.3 ms3等位检测的分子标记设计

本研究针对ms3-1和ms3-2突变位点的特性分别设计分子标记对这两个等位的基因型进行检测。通过ms3-2突变体的Sanger测序峰图可以清晰地看出在MS3（Plainview）样本中第一个外显子区域有7个碱基A，而在ms3（Plainview）样本中该区域只有6个碱基A，而杂合子在第7个碱基的位置是一个双峰（A/G），说明ms3（Plainview）在第一个外显子上缺少了一个碱基A（图3B）。这与图2B中的高通量测序结果（由于Glyma.02g107600基因在染色体上是反向互补的，所以高通量测序结果显示是缺失碱基T）一致，证明该位点确实发生了突变，而且这对分子标记可以有效的对ms3（Plainview）的基因型进行鉴定（图2B）。ms3-1突变存在一个大片段序列插入，设计的2对引物中1对（MS3WT-1F/MS3WT-1R）检测野生型MS3，另1对引物（MS3WT-1F/MS3MU-1R）特异性检测突变型ms3-1。2对引物共用同1个正向引物MS3WT-1F，此引物位于插入位点的上游；扩增MS3的反向引物MS3WT-1R设计在突变位点的下游，扩增ms3-1的反向引物MS3MU-1R设计在插入序列上（图3A）。纯合MS3基因型可以用引物对MS3WT-1F/MS3WT-1R扩增出780 bp的条带，ms3-1基因型可以用引物对MS3WT-1F/MS3MU-1R扩增出874 bp的条带，杂合子使用上述2对引物都能扩增出条带（图3C）。这2对引物一起可以组成一对共显性分子标记，为ms3-1基因型的鉴定建立了更为便捷的方法。因此，针对ms3-1和ms3-2这两个等位突变分别设计的两种分子标记及鉴定的实验结果也证实了两个等位基因序列的正确性及鉴定方法的有效性。

2.4 突变对蛋白结构的影响

Glyma.02g107600（MS3）由3个外显子和2个内含子构成（图3A），编码长656个氨基酸的多肽链，在氨基酸残基600和645之间存在一个PHD-finger结构域。从MS3蛋白三级结构图中可以看到，蛋白的N末端是散环结构，C末端是一个由两个反向平行的β折叠片和一个α 螺旋组成的PHD-finger结构（图4）。ms3-2在第一个外显子上缺少了一个碱基A，导致开放阅读框发生移码突变，仅编码40个氨基酸，移码位点在N末端的散环区（图4），导致MS3蛋白结构基本完全丧失，因此，ms3-2应该是一个功能完全丧失突变体（null mutation）。而ms3-1的插入导致PHD-finger结构域的翻译在第一个β折叠片后终止（图4）。通过对蛋白结构的推断，本研究中ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）突变体雄性不育可能就是由于PHD结构域遭到了破坏，无法产生正常的可育花粉。

图4 MS3蛋白三级结构

Fig.4 Tertiary structure of MS3 protein

被红色虚线圆圈标出的深蓝色区域显示了MS3蛋白的PHD结构域；五角星分别指示两个突变蛋白的氨基酸突变起始位点

The dark blue area marked by a red dashed circle shows the PHD domain of the MS3 protein； The pentagram indicates the amino acid mutation initiation sites of the two mutant proteins respectively

2.5 花药半薄切片观察

花药发育至四分体时期（S8期），ms3（Plainview）与MS3（Plainview）开始出现不同，主要表现在ms3（Plainview）绒毡层开始出现小的空泡化，但此时，四分体的形态没有明显区别，四分体被花粉囊腔内填充的胼胝质包裹（图5A，D）。花药发育至自由小孢子时期（S9）期，可育花药中自由小孢子处于游离状态，绒毡层进一步浓缩（图5B）。而ms3（Plainview）小孢子形状开始不规则，部分出现空泡化，绒毡层边缘有小颗粒物质出现，向花粉囊腔凸出，挤压小孢子的生存空间（图5E）。花药发育至S11期时，内皮层呈现出空泡膨大的状态，此时可育花药的体壁细胞层和绒毡层进一步降解，为花粉粒的发育提供营养物质（图5C）。而ms3（Plainview）突变体花药绒毡层依然处于深度着色的状态，表明绒毡层中的营养物质不能向小孢子（花粉粒）转移，此外壁细胞层和绒毡层进一步挤压花粉囊腔内含物，此时花粉粒的发育似乎停滞，依然是不规则的空泡化（图5F）。

图5 MS3（Plainview）和ms3（Plainview）突变体花药半薄切片

Fig.5 Anther semi-thin sections of MS3（Plainview） and ms3（Plainview）

红色箭头分别标注的是正常的（A~C）和异常的（E~F）绒毡层细胞。黑色箭头指示的是饱满的（B~C）和空泡化的（E~F）小孢子。紫色箭头指示的是绒毡层中出现的异常颗粒（E~F）。比例尺=25 μm

Red arrows indicate the normal （A-C） and abnormal （E-F） tapetum cell. The black arrows indicate the plump and vacuolated microspores. The purple arrows point the abnormal granular particles（E-F）. Scale =25 μm

通过观察ms3（Plainview）与MS3（Plainview）的花药半薄切片图像，发现ms3（Plainview）在花药发育的中后期绒毡层和花粉发育出现异常，导致花粉败育。半薄切片的结果与花药碘染后只有零星花粉粒被染成黑色的结果一致，说明MS3在绒毡层降解和小孢子发育调控过程中发挥着决定性的作用。

3 讨论

植物同源异型结构域PHD是锌指结构域家族的一类转录调控因子，主要在细胞核中发挥作用，可以作为激活因子或抑制因子两种形式参与转录调控作用，可以与各种组蛋白修饰酶相互作用^［

32-34］，在单子叶植物与双子叶植物的雄配子发育调控过程中功能保守^{［参考文献 23

百度学术}23］。目前的研究表明，PHD转录因子参与雄配子发育的调控主要涉及减数分裂和绒毡层降解及小孢子发育过程^{［参考文献 34

百度学术}34］。大豆雄性不育基因MS4及其拟南芥同源基因MMD1（MALE MEIOCYTE DEATH1）都有参与减数分裂末期胞质分裂过程的报道，并且MS4与MMD1编码蛋白的PHD结构域被破坏会导致小孢子发育异常，造成花粉大量败育^{［参考文献 23

百度学术}23，35］。大豆MS3、拟南芥MS1、玉米ZmMS7以及水稻PTC1（PERSISTANT TAPETAL CELL1）/OsMS1均被报道参与绒毡层降解过程，且几种同源蛋白的缺失均会影响绒毡层程序性死亡的正常进行，导致出现绒毡层增殖失控、降解延迟以及小孢子逐渐坏死等发育异常行为，说明在进化过程中该蛋白的功能相对保守^{［参考文献 22

百度学术}22，36-38］。在本研究中，ms3（Plainview）突变体在发育后期也出现了绒毡层和花药发育异常的现象，可能与其发生移码突变、无法编码正常的PHD功能蛋白有关。

ms3（Washington）和ms3（Flanagan）突变体在PHD结构域区域产生了大片段插入突变，导致PHD结构域的受损。ms3（Plainview）突变体则是由于第一个外显子上单碱基的缺失导致翻译提前终止，最终导致功能蛋白的缺失。本研究中，ms3（Plainview）的花粉败育现象比ms3（Washington）与ms3（Flanagan）更为严重。在观察3个突变体结实情况时发现，ms3（Washington）与ms3（Flanagan）偶尔会结1个荚，而ms3（Plainview）从未发现结荚现象。表明2种突变形式导致的突变在最终结实性上存在一定的差异性。相应地，在Hou等^［

22］的研究中，经CRISPR/Cas9编辑得到的MS3-KO突变体PHD结构域被完全破坏，几乎不产生花粉粒和自交豆荚，与本研究中的ms3（Plainview）的突变类型与表型一致。而天然等位突变ms3及本研究中的ms3（Washington）和ms3（Flanagan）只是缺失了部分PHD结构域，偶尔能观察到零星的花粉粒。这些现象说明大豆MS3蛋白PHD结构域的完整性对雄性育性也存在一定影响。

ms3（Washington）和ms3（Flanagan）的突变位点与Hou等^［

22］鉴定到的ms3突变位点一致，并观察到了自交结实现象，但结实率较低，可能与材料种植条件有关。在Hou等^{［参考文献 22

百度学术}22］的研究中，ms3在≤13 h 30 min的短日照条件下完全不育，但在≥15 h 45 min的长日照条件下育性恢复。本研究中的ms3（Flanagan）、ms3（Washington）和ms3（Plainview）种植于西安（34°23′N），生长期间的日照时长在12 h~14 h 30 min之间，其自交结实率低可能是材料种植维度偏低、光照时长不足导致的。而ms3（Plainview）突变材料从未观察到结实现象，可能是因为ms3（Plainview）在第一个外显子处产生了移码突变，造成了整个蛋白功能的缺失，所以表现出完全不育的现象。同样的情况在大豆MS3的水稻同源物PTC1/OsMS1中也存在。PHD结构域缺失的水稻ptc1突变体产生完全不育的表型^{［参考文献 38

百度学术}38］；而在保守“LXXLL”基序中由亮氨酸转变为脯氨酸的突变体tgms-9和osms1^wenmin呈现出温敏雄性不育的表型^{［参考文献 39-40}39-40］。tgms-9和osms1^wenmin突变体在低温下（22 ℃）育性正常，随着温度的升高（23~29 ℃），突变体表现出温敏雄性不育的表型^{［参考文献 39-40}39-40］。虽然大豆MS3和水稻MS1（PTC1）同样被证明是条件敏感型雄性不育基因，但是两种作物中突变体的育性转换条件却不尽相同。其具体的调控机制可能与突变位点不一致有关（“LXXLL”保守的基序与温敏机制有关，而PHD结构域与光敏机制有关），也可能是不同物种差异导致。有必要进行更为细致的研究来回答，比如在大豆中对保守的“LXXLL”进行单碱基编辑，或者是在水稻中对PHD结构域进行敲除来进行分析。

上述研究表明，发生在PHD-finger结构域的突变，通常与条件敏感型不育突变体的形成密切相关。因此，ms3（Washington）和 ms3（Flanagan）作为条件敏感型不育突变体可以考虑将来作为两系杂交育种的环境敏感型细胞核雄性不育系材料使用。而ms3（Plainview）突变体的突变位点与Hou等^［

22］鉴定到的突变位点不同，并且表现彻底败育的表型，可以作为一种稳定的雄性不育材料用作种质资源筛选。本研究明确了种质资源库中3种突变体的具体突变类型，发现了一个新的功能完全缺失型等位突变（ms3-2），解析了其对育性的影响，并开发了验证ms3-1和ms3-2基因型的鉴定方法，对ms3突变体和MS3基因资源在杂交育种工作中的应用有着一定的指导意义。

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