摘要
通过对水稻萌发耐淹性进行QTL定位和稳定位点的聚合效应分析，可以为萌发耐淹性基因的精细定位及后续分子辅助育种奠定基础。本研究利用一个包含144份家系的强萌发耐淹性粳型杂草稻WR-4与籼稻品种广百香占的F2：3定位群体，基于1K mGPS SNP芯片构建了一个包含825个Bin标记的高密度遗传图谱，利用完备区间作图法共检测到10个萌发耐淹性QTL，分布于水稻第3、4、7、8、9和10染色体上，LOD值介于3.6~21.3之间，可解释3.0%~21.1%的表型变异。其中，具有较高LOD值和贡献率的2个主效QTL（qGS4-1和qGS7-1）能够被重复检测到，是后续基因克隆的候选位点。根据Bin标记分型结果将不同子代在两个稳定QTL区间内分为WR型和广百香占型，在F2：3群体中进行聚合效应分析，发现聚合增效等位基因数量越多的家系，其淹水条件下的胚芽鞘越长，这些携带多个耐性QTL的株系可为分子育种培育耐低氧萌发水稻新品种提供亲本资源。
低氧胁迫下出苗率下降是限制直播稻安全生产的关键因素，筛选强萌发耐淹性的水稻种质对直播稻新品种的选育具有重要意义。由于土地的不平整和排水后强降雨的影响往往导致直播稻播种后淹涝的发
为探明水稻萌发耐淹性的遗传基础，国内外已有多项研究报道，并在不同群体中检测到萌发耐淹性相关的QTL。Jiang
近年来，全基因组测序技术的发展为直接鉴定全基因组上的单核苷酸多态性（SNPs）提供了一个有效的平台。通过滑动窗口方法将同一基因型的相邻SNPs组合成Bins，作为QTL分析的有效遗传标记。Bin-markers构建的高密度图谱成功地促进了多个物种数量性状的遗传研
定位群体来自以粳型杂草稻WR-4和籼稻品种广百香占杂交构建的F2：3分离群体，该群体包含144个家系。其中WR-4是在江苏省连云港市青口盐场试验基地收集的杂草稻资源，该种质在前期的水稻萌发耐淹性鉴定筛选中表现出较强的耐低氧能力，广百香占为来源于广东省的常规籼稻品种，耐低氧能力较弱。定位群体及双亲于2022年5-10月间均种植于连云港市农业科学院东辛农场试验基地（东经119°32′，北纬34°56′），每份材料种植6行，每行8株，行株距为26.65 cm×16.65 cm，均单本种植于同一试验田，常规肥水管理。为减少萌发耐淹性鉴定中种子休眠带来的干扰，所有供试种质均在设置50℃的鼓风干燥箱（上海昕仪DHG-9240A）中处理7 d以打破种子休眠。
本研究于2022年、2023年连续两年对WR-4、广百香占及其F2：3家系进行萌发耐淹性鉴定，每品种或家系挑选饱满均一的种子36粒，分3次重复，在1.5%（v/v）次氯酸钠溶液中处理12 min，并用纯水冲洗8次，将种子置于20 cm深的透明塑料杯中，随后将纯水小心地倒满杯中，确保种子沉入杯底，将这些杯子置于30 ℃的人工气候培养箱（海博RX-500DH）中，每天傍晚检查水位线刻度并补充水分，每3 d更换一次纯水。参照孙志广
采集亲本及144个F2：3家系的幼嫩叶片，采用十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）法进行DNA提取，利用华智水稻生物技术有限公司1K mGPS芯片进行基因分型，利用QTLIciMappingV4.1软件将所有样本中同一段序列上2个交换点自检不发生重组的SNP位点看作一个Bin标记，以Bin标记的起点确定其所在的物理位置，最终获得由825个Bins标记构建的高密度遗传图谱，相邻Bins间的平均间隔为442.3 kb。随后利用Kosambi函数将重组率转换为遗传距离，利用QTLIciMappingV4.1软件中的完备区间作图法（ICIM，inclusive composite interval mapping
利用Microsoft Excel 2010软件进行数据录入和三线表的绘制；利用GraphPadPrism8.3.0软件进行柱状图、频率分布直方图的绘制和统计分析；利用MapGene2Chromosomev2.0（http：//mg2c.iask.in/mg2c_v2.0/）进行连锁图谱的绘制；利用QTLIci MappingV4.1软件进行上位性分析环状图的绘制。
利用1K mGPS水稻SNP芯片对WR-4、广百香占及其F2：3群体进行检测，共获得位于水稻12条染色体上的5420个高质量SNP标记，其中多态性良好的标记多达2787个，占比51.4%，每条染色体上平均携带的多态性标记为232.3个，在水稻第1染色体上分布最多（311个），占比11.2%；在第12染色体上分布最少（156个），占比0.57%（
图1 多态性标记在水稻染色体上的分布
Fig.1 Distribution of polymorphic markers on rice chromosomes
A：多态性SNP标记在水稻染色体上的分布；B：多态性Bin标记在水稻染色体上的分布
A： Distribution of polymorphic SNP markers throughout the rice chromosomes； B： Distribution of polymorphic Bin markers throughout the rice chromosomes
在前期的萌发耐淹性种质资源筛选中，本研究获得了1份强萌发耐淹性粳型杂草稻种质资源WR-4，为验证其萌发耐淹性，本研究对其进行了重新鉴定，30 ℃下淹水11 d后WR-4的胚芽鞘长为38.7 mm，表现较强的萌发耐淹性，广百香占的胚芽鞘长仅为19.0 mm，表现为感性，两者之间存在极显著差异（
图2 杂草稻WR-4的萌发耐淹性表现
Fig.2 Germinability of weedy rice WR-4 under submerged condition
A：淹水条件下WR-4与广百香占表型图；B：淹水条件下WR-4与广百香占胚芽鞘长。**表示在P＜0.01水平上差异显著；黑色圆点表示每个个体的原始值；GBXZ代表籼稻品种广百香占；下同
A： Phenotypic image of WR-4 and GBXZ under submerged condition； B： Coleoptile length of WR-4 and GBXZ under submerged condition. ** indicate significant difference at the level of P＜0.01；The black dot indicates each individual’s raw value；GBXZ stands for Guangbaixiangzhan （an indica cultivar）；The same as below
为了检测萌发耐淹性QTL，本研究于2022年对WR-4、广百香占及其F2：3群体进行萌发耐淹性鉴定，粳型杂草稻WR-4淹水后的胚芽鞘长平均值为37.8 mm，而籼稻品种广百香占淹水后的胚芽鞘长为18.4 mm，WR-4/广百香占F2：3分离群体胚芽鞘长的变化范围为13.2~38.9 mm，在28~32 mm处出现峰值，呈典型的正态分布特征（KS-检验，P>0.05），表明该群体的萌发耐淹性由多个QTL共同控制（
图3 WR-4/广百香占F2：3群体萌发耐淹性表型分布直方图
Fig.3 Frequency distribution of germinability under submerged condition （GS） in an F2：3 population derived from the cross between WR-4 and Guangbaixiangzhan （GBXZ）
年份 Year | 数量性状位点 QTL | 染色体 Chromosome | 标记区间 Marker interval | LOD值 LOD scores | 贡献率 （%） Phenotypic variation explained | 加性效应 Additive effect |
|---|---|---|---|---|---|---|
| 2022 | qGS3 | 3 | M791~M792 | 11.0 | 9.4 | 2.1 |
| qGS4-1 | 4 | M928~M930 | 15.4 | 14.0 | -2.7 | |
| qGS7-1 | 7 | M1797~M1807 | 21.3 | 21.1 | 3.4 | |
| qGS7-2 | 7 | M1757~M1758 | 10.2 | 8.5 | -0.1 | |
| qGS8-1 | 8 | M1906~M1908 | 3.6 | 3.1 | 0.4 | |
| qGS9 | 9 | M2123~M2133 | 5.0 | 3.8 | -0.6 | |
| qGS10 | 10 | M2325~M2326 | 7.5 | 6.0 | 1.9 | |
| 2023 | qGS3 | 3 | M791~M792 | 8.9 | 7.6 | 1.7 |
| qGS4-1 | 4 | M928~M930 | 14.6 | 13.8 | -2.5 | |
| qGS4-2 | 4 | M912~M913 | 7.7 | 7.2 | 2.0 | |
| qGS7-1 | 7 | M1797~M1807 | 16.0 | 15.4 | 2.8 | |
| qGS7-2 | 7 | M1757~M1758 | 3.9 | 3.0 | -0.4 | |
| qGS8-2 | 8 | M1956~M1957 | 5.7 | 5.2 | 0.4 | |
| qGS8-3 | 8 | M1999~M2001 | 3.6 | 3.3 | -0.1 | |
| qGS9 | 9 | M2123~M2133 | 4.9 | 3.9 | -0.3 | |
| qGS10 | 10 | M2325~M2326 | 6.3 | 5.2 | 1.6 |
正的加性效应表示有益等位基因来自亲本WR-4，负的加性效应表示有益等位基因来自亲本广百香占
A positive additive effect indicates that beneficial alleles come from parent WR-4， a negative effect indicates that beneficial alleles come from parent Guangbaixiangzhan （GBXZ）
图4 WR-4/广百香占F2：3群体中检测到的萌发耐淹性QTL
Fig.4 QTL for germinability under submerged condition （GS） detected in WR-4/GBXZ F2：3 population
红色字体的分子标记指示相应QTL的位置
Markers in red font indicates the location of corresponding QTL
为验证以上QTL的可靠性，本研究于2023年再次对144个WR-4/广百香占F2：3家系及双亲进行萌发耐淹性鉴定，粳型杂草稻WR-4淹水后的胚芽鞘长平均值为39.6 mm，而籼稻品种广百香占淹水后的胚芽鞘长为19.5 mm，WR-4/广百香占F2：3分离群体胚芽鞘长的变化范围为12.0~38.9 mm，与2022年的表型数据整体趋势一致，呈现出典型的正态分布特征（KS-检验，P>0.05）（
本研究选取稳定表达且LOD值大于10、贡献率超过10%的2个QTL（qGS4-1和qGS7-1）进行聚合效应分析，根据不同QTL区间的Bin标记基因型将株系分为WR型和GBXZ型，剔除杂合型株系，取淹水处理后的胚芽鞘长平均值进行统计分析。根据2个QTL位点的组合情况将WR-4/广百香占F2：3群体分为4种组合类型，依次命名为qGS4-1+qGS7-1、qGS4-1、qGS7-1、None，表型值分别为33.4 mm、27.7 mm、26.7 mm、23.7 mm（
图5 QTL的聚合效应和上位性分析
Fig.5 Pyramiding effect and epistatic effect analysis of QTL
A：两个稳定QTL的聚合效应分析；B：上位性分析环形图。柱状图上方的不同字母表示在P＜0.05水平上差异显著，环形图上的数字表示分子标记在相应染色体上的位置（cM），红色虚线上的数字表示两处扫描位置间的LOD值
A： Analysis of pyramiding effect of two stable QTL； B： Cyclic graph for epistatic analysis. Different letter above the bar indicate significant difference at the level of P＜0.05， numbers on the cyclic graph represent marker position in cM on the corresponding chromosome， numbers on the dotted red lines represent LOD score between the two scanning positions
利用QTLIciMappingV4.1软件，以LOD值等于6作为阈值，共检测到23对上位性互作位点，共解释了47.0%的表型变异（
QTL定位分辨率的大小取决于标记密度和QTL置信区
低氧胁迫下直播稻种子的萌发与出苗能力，是选育直播稻品种的先决条件，因此强萌发耐淹性种质和基因的发掘、利用是实现直播稻育种可持续发展的关键所在。本研究共鉴定到10个萌发耐淹性QTL位点，分别坐落于水稻第3、4、7、8、9、10号染色体上，LOD值介于3.6~21.3，表型贡献率介于3.0%~21.1%（
综上所述，本研究鉴定获得的萌发耐淹性QTL，qGS4-1、qGS4-2、qGS8-1、qGS8-3尚未被报道，可能是新鉴定的QTL。其中qGS4-1能够被重复检测到，贡献率为13.8%~14.0%，LOD值为14.6~15.4，且经过聚合效应分析能显著提高携带家系的萌发耐淹能力，是稳定表达的QTL，具有一定的育种价值。本研究结果为这些QTL的克隆、功能分析和分子设计育种奠定了良好的基础。
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