玉米<bold>PDI</bold>基因家族鉴定和表达模式分析

吴金丽; 汤泽洋; 鲁鑫; 周志强; 郭长虹; 李新海; WU Jinli; TANG Zeyang; LU Xin; ZHOU Zhiqiang; GUO Changhong; LI Xinhai

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玉米PDI基因家族鉴定和表达模式分析 PDF

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吴金丽 ^1,2
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汤泽洋 ^1,2
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鲁鑫 ²
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郭长虹 ¹
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李新海 ^1,2
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1. 哈尔滨师范大学生命科学与技术学院黑龙江省分子细胞遗传与遗传育种重点实验室，哈尔滨 150025； 2. 中国农业科学院作物科学研究所/作物分子育种国家工程实验室，北京100081

最近更新：2024-01-08

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20230621001

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摘要

蛋白质二硫键异构酶（PDI，protein disulfide isomerase）作为硫氧还蛋白家族的一员，是一种氧化还原酶，广泛存在于动物、植物及微生物中。在植物中，蛋白质二硫键的形成和异构主要由二硫键蛋白催化完成，在参与蛋白质正确组装折叠方面至关重要。本研究以拟南芥PDI家族基因序列信息为基础，利用同源序列比对方法，从玉米中鉴定出21个PDI基因，除8号染色体外，非均匀地分布在其余玉米9条染色体上。进化树分析表明，玉米PDI基因家族分为4个进化分支11个发育组，同一发育组的基因结构和保守基序相似。顺式作用元件分析表明，PDI基因家族启动子含响应逆境胁迫、植物激素及胚乳特异表达的顺式作用元件。表达模式分析表明，PDI基因家族在胚、胚乳和籽粒中表达量较高，在授粉后10 ~20 d的胚乳中表达量呈下降趋势，然后表达量又呈现上升趋势。生物多样性分析发现：ZmPDIL1-1基因存在多样性。亚细胞定位结果表明ZmPDIL1-1定位在内质网。本研究结果为玉米PDI家族基因功能研究提供参考。

关键词

玉米; PDI基因家族; 基因表达; 亚细胞定位

玉米（Zea mays L.）是一种重要的粮、饲兼用作物，其中 70％玉米用作饲料。普通玉米中蛋白质组分不平衡，限制了在动物饲料中的应用，而籽粒蛋白质是决定玉米品质的重要因素。玉米籽粒中蛋白质的积累，除受到蛋白质翻译和蛋白前体代谢相关基因直接调控外，蛋白亚基的修饰、折叠等相关基因修饰效应也广泛作用于蛋白质的合成。

蛋白质二硫键异构酶（PDI，protein disulfide isomerase）是硫氧还蛋白家族的成员^［

1］，硫氧还蛋白中含有一个或多个功能域为-CXXC-的硫氧还蛋白酶活性中心^{［参考文献 2

百度学术}2］。在氧化状态下，PDI活性中心的二硫键与底物二硫键结合， PDI活性中心为还原状态。在还原状态下，PDI活性中心的二硫键催化底物二硫键的异构或者夺取底物的二硫键，此时PDI活性中心为氧化状态。因此，PDI是一种兼具氧化、还原、异构化和分子伴侣作用的多功能酶。在哺乳动物和酵母中，对PDI的结构与功能研究比较清楚，而植物中的PDI研究相对较少。近年来，随着生物信息学、分子生物学等技术的快速发展，已相继从水稻、大豆、玉米和紫花苜蓿中克隆出PDI基因，并对其进行亚细胞定位和进化树分析^{［参考文献 3-4}3-4］。在玉米floury-2突变体中诱导PDI作为分子伴侣的作用，同时PDI在醇溶蛋白加工和组装成蛋白质小体的不同阶段与BiP协同发挥作用^{［参考文献 5

百度学术}5］。通过对水稻不同组织器官中PDI基因表达分析，发现水稻PDI基因在胚乳组织中高表达，说明该基因可能与籽粒中蛋白质的形成密切相关^{［参考文献 6

百度学术}6］。在拟南芥中，PDI参与中间体淀粉的生物合成^{［参考文献 7

百度学术}7］，并在咖啡中促进了植物环蛋白的高效积累^{［参考文献 8

百度学术}8］。

玉米籽粒蛋白质含量为8%~10%，其中80%贮存在胚乳中，主要为醇溶蛋白（60%以上）。据报道，Opaque2（O2）是一种调控贮藏物质积累的转录因子，在种子发育过程起重要作用^［

9］，可以直接或间接与ZmbZIP22和ZmMADS47蛋白相互作用，调节醇溶蛋白基因的表达^{［参考文献 10-11}10-11］，同时还发现ZmABI19直接调控O2表达，在zmabi19纯合突变体中O2基因的mRNA和蛋白水平显著下降，下游醇溶蛋白基因表达也随之明显下降^{［参考文献 12

百度学术}12］。由此可见，调控玉米籽粒蛋白质合成的基因研究较多，但是参与蛋白质正确组装折叠的基因在玉米中鲜有报道。本研究以拟南芥PDI家族基因为参考，采用同源比对方法，在玉米参考基因组B73中鉴定玉米PDI基因家族成员，对玉米PDI基因家族的理化性质、功能域、同源基因系统发育、染色体定位、共线性分析、启动子顺式作用元件、表达模式及亚细胞定位等进行研究，为玉米PDI基因家族中基因功能研究提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

本研究所用玉米自交系B73由中国农业科学院作物科学研究所提供。材料种植于作物科学研究所昌平试验基地，行长4 m，株距25 cm，种植10行，重复3次，常规田间管理。

相关试剂：RNA-easy Isolation Reagent（诺唯赞生物科技股份有限公司）、FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix（天根生化科技有限公司）、SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）（天根生化科技有限公司）、2×Phanta Flash Master Mix（Dye Plus）（诺唯赞生物科技股份有限公司）、 pEASY^®-T&B Zero Cloning Kit（北京全式金生物技术股份有限公司）。

载体质粒：pAN580-GFP-3Flag、CPB-GFP-3Flag、内质网标记载体KDEL。

1.2 方法

1.2.1 玉米PDI基因家族成员鉴定

从maizeGDB（https：//www.maizegdb.org）数据库中获取玉米B73 RefGen_v5基因组序列、基因编码区序列、蛋白序列和注释文件，从拟南芥TAIR10（https：//www.arabidopsis.org/）^［

13］下载基因序列和蛋白序列，从NCBI（https：//www. ncbi.nlm.nih.gov/）下载水稻基因序列和蛋白序列。本研究以拟南芥21个已知基因的蛋白序列为参考^{［参考文献 14-15}14-15］，使用默认参数（E-value＜1e^-10，identity>50%）在玉米蛋白序列中进行Blast和Hmm搜索，取交集并去除重复，从而在玉米参考基因组B73进行筛选，筛选出的玉米PDI基因家族成员均以参考基因组中的T001转录本进行分析。利用SMART（http：//smart. embl-heidelberg.de/）在线网站预测，确定候选基因的蛋白序列是否包含硫氧还蛋白结构域（PF00085）。

1.2.2 玉米PDI基因家族蛋白基本信息

利用TBtools软件^［

16］分析玉米PDI家族成员的基本蛋白特性；使用Cell-PLoc（http：//chou.med.harvard.edu/bioinf/Cell-PLoc）^{［参考文献 17

百度学术}17］预测玉米PDI蛋白的亚细胞定位位置。

1.2.3 玉米PDI基因家族的序列分析及同源基因建树

通过ClustalX软件比对玉米、拟南芥和水稻PDI蛋白序列，利用MEGAX中的Neighbor-Joining构建3个物种的进化树^［

18］。通过Bootstrap重复1000次^{［参考文献 19

百度学术}19］，利用iTOL（https：//itol.embl.de/）对关系树进行优化^{［参考文献 20

百度学术}20］。拟南芥PDI基因家族分类结果可作为玉米PDI基因家族的分类依据。

1.2.4 玉米PDI基因家族系统发育建树、保守基序、保守结构域和基因结构分析

为研究玉米PDI家族基因之间的结构异同，利用MEME（http：//meme-suit.org/）在线网站分析蛋白序列，确定保守结构域，设置保守基序数量为10，其他为默认参数^［

21］，并利用TBtools软件可视化。将从maizeGDB数据库下载的注释文件和玉米PDI基因家族的ID文件输入到TBtools软件，得出基因结构图^{［参考文献 22

百度学术}22］。

1.2.5 染色体定位和共线性分析

从TBtools软件获取玉米PDI基因的染色体位置信息。利用玉米参考基因组B73、拟南芥和水稻基因组文件和注释文件，使用TBtools软件对玉米、拟南芥和水稻PDI基因家族进行物种间共线性分析和玉米PDI基因家族的物种内共线性分析。

1.2.6 启动子顺式作用元件分析

利用TBtools软件从注释文件中提取PDI基因家族成员起始密码子（ATG）前2000 bp的DNA序列，利用Plant-Care（http：// bioinformatics. Psb. ugent. be/ webtools/plantcare/html）对顺式元件进行预测^［

23］，利用 TBtools 进行可视化。

1.2.7 总RNA提取和RT-PCR分析

提取自交系B73灌浆期的根、茎、雄穗、雌穗、叶、旗叶、苞叶、花丝、胚、胚乳和籽粒11个组织部位，以及授粉后10、15、20、25、30 d的胚乳总RNA。利用RNA-easy Isolation Reagent试剂盒提取总RNA，以提取的总RNA为模板，使用FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix反转录试剂盒得到cDNA。利用玉米PDI家族基因特异性引物进行反转录PCR（RT-PCR），以玉米Ubi基因作为内参，RT-PCR采用1 μg/μL模板cDNA 0.8 μL， 1 μmol/μL正向和反向引物各0.8 μL（表1），8 μL Mix酶，无菌水补足至20 μL。PCR反应过程为98 ℃预变性30 s；98 ℃变性10 s，60 ℃复性5 s，72 ℃延伸2 s，变性复性延伸共30个循环；最终72 ℃ 1 min。PCR产物在1.5％的琼脂糖凝胶上观察。

表1 玉米PDI基因家族转录表达水平检测中使用的引物信息

Table 1 Primer information used in the transcriptional expression level detection of PDI gene family in maize

引物名称 Primer name	正向引物序列（5′-3′） Forward primer sequence（5′-3′）	反向引物序列（5′-3′） Reverse primer sequence（5′-3′）
ZmPDIL1-1	CCAAGCACCCCTTCATGGTC	GTAGCAAGCGGCCTGTTCTT
ZmPDIL1-2	CCAAGCACCCCTTCATGGT	AAGCGGCCTGTTCTTCTCC
ZmPDIL2-1	ACTTCCCCTTCTATTTTTGGCA	TTGTCTCGCTCCACAAAGAC
ZmPDIL2-2	CCCCTTCTATTTTTGGCAATCC	CCTCACTGTCTCGTTCCACAA
ZmPDIL3-1	CTCCCGCCATACCACAAATC	GCTTCACAGTCAACACACCAA
ZmPDIL4-1	TGGTTTCCCAAAGGTTCCCT	TCAGAACCACGACGCTTGAA
ZmPDIL4-2	ATCCAATGGTTCCCGAAAGG	CTCTGGGGTGAGAACCACAA
ZmPDIL5-1	AAGCAAGGACCTTTGGATTGTG	TCCACCTTGTACTTGCTCATCA
ZmPDIL5-2	GGACATTTGGATTGTGG	GAAAACCTTCCACCTTG
ZmPDIL6-1	CCGAAGAGACCTTCTCCGAC	TCCGCACCTTCCATAACCTT
ZmPDIL7-1	GTCGATTTCTACGCGCCA	AAAGCATGAGGGTAGGGAAC
ZmPDIL7-2	GTGCGGCCACTGCAAGA	GCATGAGGGTAGGGAAC
ZmPDIL7-3	ACTTCTACGCTCCCTGG	TCAAAGTAGGGAACCCAT
ZmPDIL8-1	AGGTTGACTGCACTGAGGAA	ACTCTCAGTATCACGTTCACCAT
ZmPDIL9-1	TGAGAATGAAAGTATGCACCCA	AGCTAATAAGCGAGTCACGAGT
ZmPDIL10-1	GTCTCGACGGAGGGGTACT	AACCCGTGGAAACATTGAGC
ZmPDIL10-2	CAGGGCTCCGGGGTCA	AAAAGGGCACCACGAAGCAT
ZmPDIL10-3	TCGTGGAATCCGTTCTTGGT	GGCACCACGAGGCATAGAAA
ZmPDIL10-4	TCGCGCAATCCGTCCTTAG	GTGAGAATGGGCACCACGA
ZmPDIL11-1	CCGAAATCGCCATCGCCTT	GATGCCGTAGTGCTTCTCCA
ZmPDIL11-2	GCTGGAGATCATGGATCGGG	ATAGCTGGTACGTCTCCGGG
Maize-Ubi	TAAGCTGCCGATGTGCCTGCGTCG	CTGAAAGACAGAACATAATGAGCACAG

1.2.8 实时荧光定量PCR分析

利用NCBI设计定量引物，以玉米Ubi基因作为内参。使用SuperReal PreMix Plus（SYBR Green）试剂盒进行荧光定量PCR试验（qRT-PCR），体系及步骤按照说明书，采用2^-ΔΔCT计算相对表达量^［

24］，应用SPSS分析数据。

1.2.9 多样性分析

根据MaizeGDB重测序结果，对29份自交系材料中ZmPDIL1-1基因编码区进行分析，用MEGAX对查找出的前10个变异位点多序列比对。

1.2.10 亚细胞定位

为了解PDI基因参与蛋白质正确组装折叠的功能，选择1个预测定位在内质网的基因进行验证。本研究以基因ZmPDIL1-1为例，以玉米自交系B73授粉后10 d的籽粒 cDNA为模板，扩增ZmPDIL1-1基因的CDS序列，将目标条带胶回收连到通用载体T&B Zero上并进行一代Sanger测序，测序结果与B73 参考序列比对正确。以与参考序列一致的T&B-Zero-ZmPDIL1-1克隆载体为模板，利用同源重组方法将ZmPDIL1-1不含终止密码子的CDS序列连接到含绿色荧光蛋白GFP报告基因的玉米瞬时表达载体pAN580上，构建35S启动子驱动的pAN580-ZmPDIL1-1-GFP基因表达的融合载体。同时，将ZmPDIL1-1不含终止密码子的CDS序列连接到含绿色荧光蛋白GFP报告基因的烟草瞬时表达载体CPB上，构建35S启动子驱动的CPB-ZmPDIL1-1-GFP基因表达的融合载体。

2 结果与分析

2.1 玉米PDI基因家族的鉴定

以拟南芥21个PDI家族基因的蛋白序列为参考，结合生物信息学方法，在玉米蛋白序列中进行Blast和Hmm搜索，鉴定出21个PDI基因。根据玉米PDI蛋白与拟南芥PDI蛋白的系统发育关系，将其命名为ZmPDIL1-1~ ZmPDIL11-2。由表2可知，PDI基因家族有3~13个外显子。外显子数目的改变，可能是可变剪切导致的。玉米PDI基因家族编码蛋白的长度为150~568个氨基酸，等电点在4.69~9.87之间，蛋白分子量19457.61~62417.13 Da。不稳定系数24.56~53.70，有14个蛋白不稳定系数＜40，大多数是稳定蛋白质，这表明该家族编码的蛋白在理化性质方面的多样性。亚细胞定位预测发现，ZmPDIL1-1、ZmPDIL1-2、ZmPDIL4-1和ZmPDIL4-2蛋白定位在内质网，其他蛋白在叶绿体上都有定位，但ZmPDIL2-1和ZmPDIL7-1蛋白定位在叶绿体和细胞质，同时ZmPDIL5-1、ZmPDIL5-2和ZmPDIL7-2蛋白定位在叶绿体、细胞质和细胞核，说明PDI基因家族编码的蛋白不仅参与内质网的折叠，还可能在叶绿体参与光合作用以及在细胞核和细胞质发挥作用。

表2 玉米PDI基因家族成员的基本信息

Table2 Basic information of PDI gene families in maize

基因ID Gene ID	基因名称Gene name	氨基酸数量（aa） Number of amino acid	编码区长度（bp） CDS length	分子量（Da） Molecular weight	外显子/内含子 Exon/intron	理论等电点 Theoretical isoelectric point
Zm00001eb168910	ZmPDIL1-1	514	1542	56873.65	10/9	5.01
Zm00001eb112590	ZmPDIL1-2	512	1536	56683.22	10/9	4.91
Zm00001eb229180	ZmPDIL2-1	561	1683	61888.65	11/10	4.74
Zm00001eb210140	ZmPDIL2-2	568	1704	62417.13	11/10	4.69
Zm00001eb375710	ZmPDIL3-1	515	1545	57506.75	13/12	5.05
Zm00001eb282710	ZmPDIL4-1	355	1065	38836.45	11/10	6.24
Zm00001eb131360	ZmPDIL4-2	367	1101	40122.76	10/9	5.91
Zm00001eb314620	ZmPDIL5-1	430	1290	46012.47	9/8	5.66
Zm00001eb100620	ZmPDIL5-2	439	1317	47096.66	9/8	5.58
Zm00001eb013190	ZmPDIL6-1	150	450	16835.46	4/3	5.16
Zm00001eb422640	ZmPDIL7-1	410	1230	45908.61	3/2	4.96
Zm00001eb082680	ZmPDIL7-2	418	1254	46962.8	5/4	4.86
Zm00001eb243460	ZmPDIL7-3	420	1260	46469.16	5/4	4.90
Zm00001eb106180	ZmPDIL8-1	381	1143	42824.43	15/14	7.24
Zm00001eb295030	ZmPDIL9-1	441	1323	49358.3	12/11	7.20
Zm00001eb410330	ZmPDIL10-1	303	909	33772.3	4/3	8.93
Zm00001eb042300	ZmPDIL10-2	178	534	19457.61	4/3	9.87
Zm00001eb255320	ZmPDIL10-3	178	534	19598.73	4/3	5.67
Zm00001eb194120	ZmPDIL10-4	323	969	36148.48	4/3	8.76
Zm00001eb105800	ZmPDIL11-1	456	1368	49526.39	4/3	8.40
Zm00001eb322440	ZmPDIL11-2	461	1383	50049.97	4/3	8.38

基因ID Gene ID	基因名称Gene name	不稳定系数Instability index	脂溶指数Aliphatic index	亲水指数Hydrophilic index	染色体Chromosome	亚细胞定位 Subcellular localization
Zm00001eb168910	ZmPDIL1-1	32.69	82.06	-0.251	4	内质网
Zm00001eb112590	ZmPDIL1-2	31.53	82.56	-0.268	2	内质网
Zm00001eb229180	ZmPDIL2-1	37.59	86.45	-0.258	5	叶绿体，细胞质
Zm00001eb210140	ZmPDIL2-2	36.38	85.9	-0.224	4	叶绿体
Zm00001eb375710	ZmPDIL3-1	31.58	92.45	-0.167	9	叶绿体
Zm00001eb282710	ZmPDIL4-1	29.01	86.28	-0.247	6	内质网
Zm00001eb131360	ZmPDIL4-2	24.56	85.1	-0.255	3	内质网
Zm00001eb314620	ZmPDIL5-1	33.35	84.44	-0.138	7	叶绿体，细胞质，细胞核
Zm00001eb100620	ZmPDIL5-2	32.19	85.58	-0.145	2	叶绿体，细胞质，细胞核
Zm00001eb013190	ZmPDIL6-1	31.04	95.4	-0.106	1	叶绿体
Zm00001eb422640	ZmPDIL7-1	35.01	93.44	-0.111	10	叶绿体，细胞质
Zm00001eb082680	ZmPDIL7-2	36.91	99.81	-0.019	2	叶绿体，细胞质，细胞核
Zm00001eb243460	ZmPDIL7-3	41.93	96.71	-0.009	5	叶绿体
Zm00001eb106180	ZmPDIL8-1	39.64	77.98	-0.37	2	叶绿体
Zm00001eb295030	ZmPDIL9-1	39.98	77.26	-0.283	6	叶绿体
Zm00001eb410330	ZmPDIL10-1	53.70	101.75	0.167	10	叶绿体
Zm00001eb042300	ZmPDIL10-2	42.13	89.94	0.211	1	叶绿体
Zm00001eb255320	ZmPDIL10-3	45.71	104.1	0.374	5	叶绿体
Zm00001eb194120	ZmPDIL10-4	52.78	89.23	-0.059	4	叶绿体
Zm00001eb105800	ZmPDIL11-1	49.91	82.94	-0.221	2	叶绿体
Zm00001eb322440	ZmPDIL11-2	48.98	82.91	-0.233	7	叶绿体

2.2 系统发育分析

为深入了解PDI基因在不同物种中的演化规律，利用MEGAX软件对玉米（Zea mays L.）、拟南芥（Arabidopsis thaliana L.）和水稻（Oryza sativa L.）PDI家族基因蛋白序列共同构建系统发育树（图1）。以拟南芥PDI基因家族进化树为划分依据，将来自不同植物PDI家族基因划分为4个分支，4个分支划分成11个系统发育组。分支1由系统发育组Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅶ组成，其中Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ组PDI蛋白在N端和C端尾部有两个活性硫氧还蛋白结构域，而Ⅶ组PDI蛋白在N端具有一个活性硫氧还蛋白结构域。分支2由系统发育组Ⅳ、Ⅴ和Ⅵ组成，其中IV和Ⅴ组的PDI蛋白在其N端有两个活性硫氧还蛋白结构域，Ⅵ组的PDI蛋白在N端包含一个硫氧还蛋白结构域。分支3由系统发育组Ⅺ组成，其PDI蛋白在C端有一个单一的活性硫氧还蛋白结构域。分支4由Ⅷ、Ⅸ和Ⅹ组成，其PDI蛋白包含一个活性硫氧还蛋白结构域。综上所述，PDI基因在植物进化过程中结构域稳定且保守。

图1 玉米（Zm），拟南芥（At）和水稻（Os）中PDI家族基因系统进化树

Fig.1 Phylogenetic tree of PDIs in Zea Mays L. （Zm），Arabidopsis Thaliana （L.） Heynh. （At） and Oryza sativa L. （Os）

2.3 玉米PDI基因家族系统发育建树、保守基序、保守结构域和基因结构分析

利用TBtools分析玉米PDI基因家族编码的氨基酸序列的保守基序、保守结构域和基因结构（图2）。在玉米PDI基因家族中，同一个发育组中预测的保守基序具有同一性，如系统发育组XI中ZmPDIL11-1和ZmPDIL11-2均仅有Motif 1、Motif 3和Motif 8 3个保守基序，其他发育组的保守基序一致或相近。蛋白质二硫键异构酶的结构域为硫氧还蛋白，筛选到的PDI基因均至少有一个硫氧还蛋白结构域。基因内含子和外显子的组成是决定基因功能的重要依据^［

25］，同一发育组的外显子数量相同或相近，说明PDI基因家族在氨基酸残基进化方面相对保守。

图2 玉米PDI基因家族系统进化树（A）、蛋白保守基序（B）、蛋白结构域（C）和基因结构（D）

Fig.2 The phylogenetics（A）， conserved motifs（B）， domains（C）and gene structure（D） of PDI gene family in maize

2.4 玉米PDI基因家族染色体定位和共线性分析

从玉米注释文件中提取染色体长度信息同时对21个基因进行染色体定位。PDI基因家族分布在玉米10条染色体的9条上，在2号染色体上分布5个基因，除8号染色体外，其他染色体上含有1~3个基因（图3）。这表明玉米PDI基因家族成员在染色体上的分布是非均匀的。

图3 玉米PDI基因家族在染色体上的分布

Fig.3 The distribution of PDI gene family on chromosomes of maize

不同的颜色表示基因在染色体上的密度，由红到蓝表示由高到低

Different colors indicate the density of genes on chromosomes， from red to blue indicate high to low

在植物进化过程中复制事件对基因家族成员的扩增起重要作用^［

26］。如果2个同源基因之间的间距小于5个基因，称串联重复，如果2个同源基因之间的间距大于5个基因称片段重复。本研究在对玉米PDI基因家族的扩增过程中，得到了8个重复基因对，均是片段重复（图4），表明片段重复是玉米PDI基因家族进化中的重要环节。通过对玉米、水稻和拟南芥PDI基因家族进行共线性分析，共鉴定到19对共线性关系，其中，有13个玉米PDI基因与11个水稻PDI基因存在16对共线性关系（图5），表明PDI家族在禾本科作物进化过程中具有较高的保守性。

图4 玉米PDI基因家族共线性分析

Fig.4 Synteny analysis in PDI gene family of maize

图5 玉米、拟南芥和水稻PDI基因家族共线性分析

Fig.5 Synteny analysis in PDI gene family of Z. mays， A. thaliana and O. sativa

2.5 玉米PDI基因家族启动子顺式作用元件分析

通过对启动子中顺式作用元件的分析，可为基因的功能研究提供基础^［

27］。已有的研究表明，启动子区的顺式作用元件与基因特异应答表达存在一定的相关性^{［参考文献 28-29}28-29］。在PDI基因家族的启动子区中发现多个与逆境胁迫、植物激素和胚乳发育有关的顺式作用元件（CREs，cis-acting elements）（图6）。对逆境胁迫响应的元件有干旱响应元件MBS（CAACTG）、光响应元件Box-4（ATTAAT）、厌氧诱导元件ARE（AAACCA）、低温响应元件LTR（CCGAAA）以及防御和应激响应元件TC-rich repeats（CACCGTT）等，推测 PDI基因可能参与了多种胁迫应答反应。对植物激素响应的元件有茉莉酸甲酯（MeJA）、赤霉素（GA）、脱落酸（ABA）、水杨酸（SA）和生长素（IAA）。其中，部分PDI基因还存在参与植物生长发育以及籽粒发育的元件，比如响应分生组织元件和响应胚乳发育元件，推测蛋白质二硫键异构酶可能在玉米生长发育过程中发挥一定的功能，特别是含有响应胚乳发育元件可能在籽粒胚乳中参与蛋白质的正确组装和折叠。

图6 玉米PDI基因家族启动子的顺式作用元件分析

Fig.6 Cis-acting elements analysis in promoter region of PDI gene family in maize

2.6 玉米PDI基因家族表达模式分析

采用RT-PCR技术分析21个玉米PDI基因在授粉后灌浆期的11个组织部位表达模式，同时采用qRT-PCR技术分析21个玉米PDI基因在授粉后不同时间胚乳表达模式。RT-PCR分析表明（图7），PDI基因家族的不同发育组间表达趋势各不相同，但同一发育组的基因表达模式相同或相近。玉米PDI基因家族主要在胚、胚乳和籽粒中表达量较高，除此之外， ZmPDIL8-1在根和茎中表达量较高，ZmPDIL11-1和ZmPDIL11-2在茎、雄穗和叶中表达量较高。qRT-PCR分析显示（图8），玉米PDI基因家族在授粉后不同时间胚乳的表达量存在差异，将授粉后10 d的胚乳表达量记为1，多数基因在授粉后10~20 d表达量呈下降趋势，但ZmPDIL1-1和ZmPDIL10-4在20~25 d表达量仍下调。ZmPDIL1-1和ZmPDIL10-4在25~30 d表达量呈上升趋势，其余19个基因在授粉后20~30 d表达量呈上升趋势。种子发育10 ~20 d是淀粉快速积累的时间^［

30］，推测蛋白质二硫键异构酶在授粉后20~30 d籽粒胚乳发育期行使蛋白质正确折叠的功能。

图7 玉米PDI基因家族不同组织部位表达模式分析

Fig.7 Analysis of expression patterns of different tissue sites of maize PDI gene family

R：根；St：茎；Ta：雄穗；Ea：雌穗；L：叶；FL：旗叶；Br：苞叶；Fi：花丝；Em：胚；En：胚乳；Gr：籽粒

R： Root；St： Stem；Ta： Tassel；Ea： Ear；L： Leaf；FL：Flag leaf；Br： Bract；Fi： Filament；Em： Embroy；En： Endosperm；Gr： Grain

图8 授粉后不同时间玉米PDI基因家族胚乳表达模式分析

Fig.8 Analysis of endosperm expression patterns of PDI gene family in maize at different time after pollination

2.7 ZmPDIL1-1基因的多样性分析

根据玉米自交系重测序数据，对29份材料中ZmPDIL1-1基因编码区的前10个变异位点进行分析（图9），分别为T+34C、C+39A、G+42A、G+45C、G+46A、T+50C、C+51G、C+53T、G+54T、G+76C。说明ZmPDIL1-1基因存在多样性。

图9 ZmPDIL1-1基因的多样性分析

Fig.9 Diversity analysis of ZmPDIL1-1 gene

左侧字母代表材料名称；+34：代表编码区第34个碱基，他同

The letter in the left the name of material；+34：Represents the 34th base of the coding region， others is the same

2.8 ZmPDIL1-1蛋白亚细胞定位分析

以ZmPDIL1-1为例，构建35S启动子驱动的pAN580- ZmPDIL1-1-GFP融合表达载体，转化至玉米原生质体中，结果表明pAN580- ZmPDIL1-1-GFP与内质网标记载体共定位。同时，构建35S启动子驱动的CPB-ZmPDIL1-1-GFP融合表达载体，注射到烟草叶片细胞中，结果表明CPB- ZmPDIL1-1-GFP与内质网标记载体共定位（图10）。研究结果表明ZmPDIL1-1定位在内质网，符合在内质网中参与蛋白质组装折叠的定位特征。

图10 ZmPDIL1-1的亚细胞定位

Fig.10 The subcellular localization of ZmPDIL1-1

A： ZmPDIL1-1在玉米原生质体中的亚细胞定位；B： ZmPDIL1-1在烟草叶片中的亚细胞定位；比例尺：20 μm

A： Subcellular location of ZmPDIL1-1 in maize protoplasts ； B： Subcellular location of ZmPDIL1-1 in tobacco leaves；Bar： 20 μm

3 讨论

蛋白质二硫键异构酶是硫氧还蛋白家族的一员。PDI在真核生物内质网中是含量最高的家族蛋白，占细胞蛋白总量的0.4%^［

31-32］，在原核生物中，催化蛋白质二硫键的形成和异构的任务主要由二硫键蛋白催化完成^{［参考文献 33

百度学术}33］。蛋白质二硫键异构酶在大部分组织和器官中组成性表达，具有催化蛋白质二硫键氧化、还原和异构等功能，与此同时具有分子伴侣活性和参与新陈代谢等功能^{［参考文献 34-35}34-35］，对催化内质网中新生肽链氧化折叠、维持蛋白以及细胞功能等方面具有重要作用。本研究以拟南芥21个PDI基因家族成员蛋白序列为靶序列，在玉米参考基因组B73中共鉴定出21个PDI基因，系统进化树分析发现，玉米PDI基因家族分为4个分支，4个分支包含11个系统发育组。Motif分析表明，位于进化树同一系统发育组中的PDI基因家族成员之间保守基序种类和数量基本保持一致，同时Domain分析表明PDI基因家族成员都包含硫氧还蛋白结构域。玉米PDI基因家族中亲缘关系近的基因间，外显子内含子结构相似，进一步表明PDI家族基因在进化上的保守性。在生物体进化中基因复制起着关键作用^{［参考文献 36

百度学术}36］，基因复制主要有两种方式：片段复制和串联复制^{［参考文献 36-37}36-37］。基因家族成员扩增分析表明，片段复制对玉米PDI基因家族成员扩增更为重要。

启动子中顺式作用元件对基因的表达起到调控作用。顺式作用元件分析表明，PDI基因家族含有参与逆境胁迫和植物激素的多种顺式作用元件。此外，PDI基因家族还包含参与胚乳发育的顺式作用元件，推测PDI基因家族可能在玉米籽粒发育过程中发挥重要作用。通过表达模式分析以及亚细胞定位分析发现该基因家族部分基因可能在内质网上行使功能，但细胞体中内质网的功能多样，包括作为稳定钙离子的内环境、为其它细胞器提供脂质供体，同时对蛋白质降解、定量控制和新生蛋白质分子的折叠有着重要作用，尤其是可以增加新生蛋白的折叠效率。目前，植物PDI生物学功能主要集中在调控种子萌发与发育^［

38-41］，Shimoni等^{［参考文献 42

百度学术}42］、Li等^{［参考文献 43

百度学术}43］首先报道了PDI参与种子胚乳的形成以及蛋白质的折叠。在水稻突变体esp2中，PDIL1-1是醇溶蛋白和谷蛋白在内质网中正确组装和配送所必需的^{［参考文献 44

百度学术}44］。Han等^{［参考文献 45

百度学术}45］研究表明， PDIL1-1的缺失导致水稻粉状淀粉的形成及其对内质网胁迫的响应。Satoh-Cruz等^{［参考文献 46

百度学术}46］证明PDIL1-1不对称地分布内质网的池状皮层上，同时参与水稻胚乳内质网谷蛋白前体的成熟过程。Okuda等^{［参考文献 47

百度学术}47］证实GmPDIL6在种子贮藏蛋白的合成过程中主要在子叶中表达，GmPDIL6的mRNA水平在内质网的胁迫下显著上调，推测GmPDIL6可能在内质网中进行氧化折叠，发挥主要作用的就是蛋白质二硫键异构酶。因此，PDI基因可能在玉米蛋白质折叠以及玉米籽粒发育方面发挥重要作用。

PDI基因家族参与植物体内蛋白质折叠，在植物生长发育过程起重要作用。在水稻中研究较为深入，目前对玉米PDI基因家族在蛋白质组装折叠过程中的功能了解有限。本研究提供了玉米PDI基因家族的进化关系、结构域、染色体定位、共线性关系、顺式作用元件，以及11个组织部位在相同时间的表达模式分析和胚乳在授粉后不同时间的表达量变化。研究结果为从玉米基因组中选择参与蛋白质组装折叠、解析玉米PDI相关基因的生物学功能提供参考依据。

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