摘要
Whirly是一类能与单链 DNA 分子结合的植物特异转录因子，在细胞核以及细胞器内都起着广泛且复杂的作用。为探究茄子Whirly基因的功能和进化关系，本研究开展了基因家族成员生物信息学鉴定，包括系统进化关系、基因结构、保守基序及启动子中的顺式作用元件，分析了其在不同组织、外源激素处理和逆境胁迫下表达模式。结果表明，茄子Whirly基因家族包含两个家族成员，分别命名为SmWHY1和SmWHY2，它们与番茄中Whirly基因亲缘关系最近。SmWHY1和SmWHY2在不同组织中均能表达，在叶片中SmWHY1的表达水平高于SmWHY2，在其他组织中SmWHY2的表达水平高于SmWHY1。两个基因的表达均受到脱落酸、茉莉酸甲酯、水杨酸、低温胁迫和病原菌诱导，但不同处理或基因型响应程度存在差异，在抗绵疫病种质G114中能够保持较高的表达水平。以上结果表明SmWHY1和SmWHY2可能在调控茄子生长发育和逆境响应中具有重要作用。
关键词
Whirly基因家族广泛存在于植物界，其编码产物主要定位在叶绿体和线粒体中，是高度保守的单链DNA结合（SSB，single-strand DNA binding）蛋白。Whirly蛋白具有Whirly结构域、N末端结构域和C末端多变区。Whirly结构域包含的一段细胞核定位信号（NLS）是最重要的结构域，在不同物种中高度保守，能与单链 DNA结合；N端结构域一般包含叶绿体或线粒体定位信号肽和转录激活结构域；C末端多变区具有自我调节区，主要参与调节Whirly蛋白与单链DNA结合活
Whirly基因已在众多植物中陆续报道，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.
茄子（Solanum melongena L.）是一种重要的蔬菜作物，在世界范围内广泛栽培。茄子生长期长，易受各种生物和非生物胁迫，影响产量和品
本研究所用材料包括三月茄、G42、G114和EP28。三月茄为四川省地方品种，引进后自交6代，用于开展不同组织、低温处理和激素处理的基因表达研究。G42和G114为抗果实绵疫病种质，分别引自USDA（United States Department of Agriculture）和CGN（Centre for Genetic Resources， The Netherlands），引进后自交6代。 EP28为感果实绵疫病紫长茄稳定自交系（F10）。所有植物材料于2022年秋季种植于江苏省农业科学院试验基地，按常规管理。
从拟南芥基因组数据库（https：//www.arabidopsis.org/）中下载拟南芥Whirly基因的序列AtWHY1（AT1G14410）、AtWHY2（AT1G71260）和AtWHY3（AT2G02740），在茄子基因组数据库（http：//eggplant-hq.cn/Egg-plant/home/index）中进行序列比对，获得茄子Whirly基因家族成员。Whirly蛋白的相对分子量和等电点使用Protparam程序（https：//web.expasy.org/protparam/）进行分析。利用GSDS 2.0程序（http：//gsds.gao-lab.org/）分析基因结构，绘制出外显子-内含子结构图。利用MEME Suite 5.5.0（https：//meme-suite.org/meme/）鉴定茄子和拟南芥Whirly基因家族的保守基序，根据E-value值筛选可信度大的基序。在Plantcare程序上（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）分析基因的启动子序列（ATG上游1500bp）的顺式作用元件，利用TBtools软件将结果可视化。
在Sol Genomics Network（https：//solgenomics.net/）中下载番茄、辣椒、马铃薯和烟草的Whirly家族基因序列。在EnsemblPlants（http：//plants.ensembl.org/index.Html）中下载大豆和黄瓜的Whirly家族基因序列，使用MEGA 7.0软件构建茄子、番茄、辣椒、马铃薯、烟草、拟南芥、大豆和黄瓜的 Whirly 蛋白序列进化树，校验参数Bootstrap值设置为1000次重复。
三月茄于4片真叶期选取生长一致的植株进行根、茎和叶取样，开花结果期选取开花当天的花瓣、花药、花萼、子房、柱头和花后15 d果实取样。激素处理时，取长势一致的三月茄植株叶片分别浸入400 μmol/L脱落酸溶液、100 μmol/L茉莉酸甲酯溶液和2 mmol/L水杨酸溶液中，叶背面朝下，置于28℃人工培养箱中，16 h光照/8 h黑暗，设置0 h、3 h、6 h、12 h和24 h共5个取样时间点。低温处理时，4片真叶期时，取长势一致的三月茄植株分别置于4℃和28℃人工培养箱中，16 h光照/8h黑暗，相对湿度为60%。设置0 h、3 h、6 h、12 h和24 h共5个取样时间点。采样均为3次生物学重复，每次重复5株混合取样，样品保存于-80℃冰箱中。
基因在不同组织及响应激素和低温的表达模式采用qRT-PCR分析。总RNA提取采用总RNA提取试剂盒（天根生化科技（北京）有限公司，北京），cDNA第1链合成采用cDNA单链合成试剂盒（北京全式金生物技术有限公司，北京），按照说明书进行操作。SmWHY1的引物为AGGCTGCCC-ACATTTAGTA和CCCAGTCATATTTGCGATC；SmWHY2的引物为TCGCCAGAGTTCTCACCTTT和ACAGACAGCGAGAAGACCTG，内参基因选用β-actin。利用AceQ qPCR SYBR Green Master Mix试剂盒（诺唯赞生物科技股份有限公司，南京）和实时荧光定量PCR仪（罗氏，瑞士）进行qRT-PCR分析。配制20 μL反应体系，其中，2×AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 0.8 μL，上下游引物各0.4 μL （10 μmol/L），ddH2O 8.4 μL。反应程序，95℃预变性5 min； 95℃变性10 s， 57℃退火30 s， 72℃延伸30 s， 40个循环；熔解曲线温度设置60℃～95℃，每个反应进行3次重复。利用
利用拟南芥Whirly基因在茄子基因组HQ-1315（http：//eggplant-hq.cn/Eggplant/home/index）中进行比对，共发现两个茄子Whirly基因：Smechr1001570和Smechr1200905，分别命名为SmWHY1和SmWHY2（
图1 茄子Whirly家族基因结构和蛋白基序
Fig.1 The gene structure and protein motif of the Whirly family
A：茄子Whirly基因结构；B：茄子和拟南芥Whirly蛋白保守基序
A： Structures of Whirly gens in eggplant； B： Conservative motifs of Whirly gene family in eggplant and Arabidopsis
利用MEME suite软件进行茄子和拟南芥Whirly基因家族的蛋白保守基序分析，结果表明不同Whirly基因的基序存在差异（
为探明茄子Whirly基因的进化，构建了茄子、番茄、辣椒、马铃薯、烟草、拟南芥、大豆和黄瓜的 Whirly 基因进化树（
图2 8个物种24个Whirly基因的系统进化树
Fig.2 Phylogenetic tree of twenty-four Whirly genes in eight plant species
茄子Whirly基因家族启动子序列顺式作用元件分析结果见
基因 Gene | 元件名称 Element name | 功能 Function |
|---|---|---|
| SmWHY1 |
TATA-box CAAT-box TCA-element MBS GATA-motif MRE CGTCA-motif TGACG-motif CAT-box |
转录起始点上游约-30bp处核心启动子元件 启动子和增强子区域中的共同顺式作用元件 参与响应水杨酸的顺式作用元件 参与干旱诱导的MYB结合位点 光响应元件的一部分 参与光响应的MYB结合位点 参与茉莉酸甲酯响应的顺式调控的顺式调控元件 参与茉莉酸甲酯响应的元件 分生组织表达相关的顺式调控元件 |
| SmWHY2 |
TATA-box CAAT-box MBS ARE GARE-motif TATC-box AuxRR-core |
转录起始点上游约-30bp处的核心启动子元件 启动子和增强子区域中的共同顺式作用元件 参与干旱诱导的MYB结合位点 厌氧诱导所必需的顺式作用调节元件 赤霉素响应元件 参与赤霉素响应的顺式调控元件 参与生长素响应的顺式调控元件 |
对茄子SmWHY1和SmWHY2在不同组织中的表达水平进行了比较分析，结果见
图3 茄子Whirly基因在不同组织中的相对表达水平
Fig.3 Relative expression levels of eggplant Whirly genes in different tissues
不同小写字母表示在0.05水平上差异显著，下同
Different lowercase letters represent significant differences at 0.05 level， the same as below
不同激素处理后，SmWHY1和SmWHY2在0~24 h内的表达水平均表现为降低-升高-降低趋势，具体表达水平变化因激素和基因而异（
图4 茄子Whirly基因在激素处理下的相对表达水平
Fig.4 Relative expression levels of eggplant Whirly genes treated with different hormones
低温处理下，SmWHY1和SmWHY2的表达水平在0~24 h内表现为升高-降低-升高的趋势（
图5 茄子Whirly基因在低温处理下的相对表达水平
Fig.5 Relative expression levels of eggplant Whirly genes under low temperature
接种后1 d，3份材料均无明显症状。接种后3 d，抗病材料G42和G114无明显症状，感病材料EP28接种点开始褐变。接种后5 d，抗病材料G42和G114无明显症状，感病材料EP28接种点开始腐烂。基因表达分析发现，SmWHY1和SmWHY2的表达水平均表现为下降，但响应程度有差异（
图6 茄子Whirly基因在接种P. capsici后的相对表达水平
Fig.6 Relative expression levels of eggplant Whirly genes after inoculation withP. Capsici
Whirly作为植物特有的转录因子，在植物生长发育和胁迫响应中具有重要作
Whirly基因在调控植物非生物胁迫抗性中具有重要作用。研究发现，在盐、干旱和低温胁迫下，番茄Whirly基因的表达水平表现为上调，过表达SlWHY1能减轻低温引起的植株萎蔫症
Whirly基因在调控植物病害抗性中具有重要作用。研究发现，番茄SlWHY2的表达受到青枯假单胞菌侵染的诱导，过表达SlWHY2能提高烟草对病原菌的抗
参考文献
Desveaux D， Allard J， Brisson N， Sygusch J. A new family of plant transcription factors displays a novel ssDNA-binding surface. Nature Structural Biology， 2002， 9（7） ： 512-517 [百度学术]
Krause K， Kilbienski I， Mulisch M， Rödiger A， Schäfer A， Krupinska K. DNA-binding proteins of the Whirly family in Arabidopsis thaliana are targeted to the organelles. FEBS Letters， 2005， 579（17） ： 3707-3712 [百度学术]
Grabowski E， Miao Y， Mulisch M， Krupinska K. Single-stranded DNA-binding protein Whirly1 in barley leaves is located in plastids and the nucleus of the same cell. Plant Physiology， 2008， 147（4） ： 1800-1804 [百度学术]
Zhuang K Y， Liu Z B， Kong F Y， Zhang S， Meng C， Yang M M， Wang Y， Ma N N， Meng Q W. WHIRLY1 regulates HSP21.5A expression to promote thermotolerance in tomato. Plant and Cell Physiology. 2020， 61（1） ： 138-145 [百度学术]
姚沁涛，张文蔚，刘莉，韩榕，简桂良，齐放军. Whirly转录因子对非寄主菌诱导水稻HR反应的负调控作用. 中国农业科技导报， 2008， 10（5） ： 53-58 [百度学术]
Yao Q T， Zhang W W， Liu L， Han R， Jian G L， Qi F J. The negative regulatory effect of Whirly transcription factor on non host bacteria induced HR response in rice. China Journal of Agricultural Science and Technology， 2008， 10 （5）： 53-58 [百度学术]
Prikryl J， Watkins K P， Friso G， Prikryl J， Watkins K P， Friso G， van Wijk K J， Barkan A. A member of the Whirly family is a multifunctional RNA and DNA binding protein that is essential for chloroplast biogenesis. Nucleic Acids Research， 2008， 36（16） ： 5152-5165 [百度学术]
Zhang Y F， Hou M M， Tan B C. The requirement of WHIRLY1 for embryogenesis is dependent on genetic background in maize. PLoS ONE， 2013， 8（6）： e67369 [百度学术]
李清，王洪，郭禄芹，罗秋兰. 大豆Whirly基因家族的鉴定和表达分析. 大豆科学， 2019， 38（2） ： 204 -211 [百度学术]
Li Q， Wang H， Guo L Q， Luo Q L. Identification and expression analysis of soybean Whirly gene family. Soybean Science， 2019， 38 （2）： 204-211 [百度学术]
Zhao S Y， Wang G D， Zhao W Y， Zhang S， Kong F Y， Dong X C， Meng Q W. Overexpression of tomato WHIRLY protein enhances tolerance to drought stress and resistance to Pseudomonas solanacearum in transgenic tobacco. Biologia Plantarum， 2018， 62（1） ： 55-68 [百度学术]
吕艳艳，魏小春，赵艳艳，原玉香，王志勇，杨双娟，郑小兰，姜俊，李艳，张梦园，姚秋菊，张强，张晓伟. 辣椒Whirly基因家族的鉴定及表达分析.华北农学报， 2019， 34（2）：72-78 [百度学术]
Lv Y Y， Wei X C， Zhao Y Y， Yuan Y X， Wang Z Y， Yang S J， Zheng X L， Jiang J， Li Y， Zhang M Y， Yao Q J， Zhang Q， Zhang X W. Identification and expression analysis of pepper Whirly gene family. North China Agricultural Journal， 2019， 34 （2）： 72-78 [百度学术]
Desveaux D， Marechal A， Brisson N. Whirly transcription factors： Defense gene regulation and beyond. Trends in Plant Science， 2005， 10（2） ： 95-102 [百度学术]
Desvesux D， Després C， Joyeux A， Subramaniam R， Brisson N. PBF-2 is a novel single-stranded DNA binding factor implicated in PR-10a gene activation in potato. The Plant Cell， 2000， 12（8）： 1477-1489 [百度学术]
Desvesux D， Subramaniam R， Després C， Mess J N， Lévesque C， Fobert P R， Dangl J L， Brisson， N. A “Whirly” transcription factor is required for salicylic acid-dependent disease resistance in Arabidopsis. Developmental Cell， 2004， 6（2）： 229-240 [百度学术]
孙宇，刘志鑫，叶子，罗睿雄，蒲金基，张贺. 杧果Whirly基因鉴定及其在病菌侵染过程中的表达分析. 西北植物学报， 2021， 41（1）： 37-45 [百度学术]
Sun Y， Liu Z X， Ye Z， Luo R X， Pu J J， Zhang H. Identification of the Whirly gene in mango and its expression analysis during pathogen infection. Northwest Botanical Journal， 2021， 41 （1）： 37-45 [百度学术]
Janack B， Sosoi P， Krupinska K， Humbeck K. Knockdown of WHIRLY1 affects drought stress-induced leaf senescence and histone modifications of the senescence-associated gene HvS40. Plants， 2016， 5（3）： 37 [百度学术]
Isemer R， Krause K， Grabe N， Kitahata N， Asami T， Krupinska K. Plastid located WHIRLY1 enhances the responsiveness of Arabidopsis seedlings toward abscisic acid. Frontiers in Plant Science， 2012， 3： 283 [百度学术]
杨洋， 赖恭梯， 赖钟雄. 三明野生蕉Whirly转录因子的克隆及其在低温胁迫下的定量表达分析.热带作物学报， 2014， 35（8）： 1533-1538 [百度学术]
Yang Y， Lai G T， Lai Z X. Cloning and quantitative expression analysis of the transcription factor Whirly in Sanming wild banana under low temperature stress. Journal of Tropical Crops， 2014， 35（8） ： 1533-1538 [百度学术]
Miao Y， Jiang J， Ren Y， Zhao Z. The single-stranded DNA-binding protein WHIRLY1 represses WRKY53 expression and delays leaf senescence in a developmental stage-dependent manner in Arabidopsis. Plant Physiology， 2013， 163（2） ： 746-756 [百度学术]
Zhang Y， Hou M， Tan B. The requirement of WHIRLY1 for embryogenesis is dependent on genetic background in maize. PLoS ONE， 2013， 8（6） ： e67369 [百度学术]
黄晨星，任育军，李燕云，缪颖. 拟南芥WHIRLY2基因超表达引起拟南芥角果发育异常的分子细胞学分析.福建农林大学学报：自然科学版，2016，45（3） ： 277-281 [百度学术]
Huang C X， Ren Y J， Li Y Y， Miao Y. Molecular cytological analysis of Arabidopsis thaliana cuticle dysplasia caused by overexpression of WHIRLY2 gene. Journal of Fujian Agriculture and Forestry University： Natural Science Edition， 2016，45 （3）： 277-281 [百度学术]
孔凡英，邓永胜，周斌，孟庆伟. Whirly转录因子研究进展. 植物生理学报， 2012， 48（7） ： 643-653 [百度学术]
Kong F Y， Deng Y S， Zhou B， Meng Q W. Research progress on Whirly transcription factors. Journal of Plant Physiology， 2012， 48 （7）： 643-653 [百度学术]
庞强强. 茄子HSFs和HSPs基因鉴定及其在高温下的表达模式分析. 广州：华南农业大学， 2016 [百度学术]
Pang Q Q. Identification of HSFs and HSPs genes in eggplant and analysis of their expression patterns under high temperature. Guangzhou：South China Agricultural University， 2016 [百度学术]
李涛，孙保娟，李植良，黎振兴，罗少波，徐小万，衡周，宫超，游倩. 茄子对青枯病的抗性机制研究现状与展望. 广东农业科学， 2021， 48（9） ： 40-50 [百度学术]
Li T， Sun B J， Li Z L， Li Z X， Luo S B， Xu X W， Heng Z， Gong C， You Q. Current status and prospects of research on the resistance mechanism of eggplant to bacterial wilt. Guangdong Agricultural science， 2021， 48 （9）： 40-50 [百度学术]
Livak K J， Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the
王谧，周晓慧，刘松瑜，杨艳，刘军，庄勇. 茄子果实绵疫病病原菌鉴定与种质资源抗性评价. 植物遗传资源学报， 2022， 23（5） ： 1281-1286 [百度学术]
Wang M， Zhou X H， Liu S Y， Yang Y， Liu J， Zhuang Y. Identification of pathogens conferring phytophthora fruit rot and their reactions in eggplant germplasm resources. Journal of Plant Genetic Resources， 2022， 23 （5）： 1281-1286 [百度学术]
Wang B， Duan H， Chong P， Su S， Shan L， Yi D， Wang L， Li Y. Systematic selection and validation of suitable reference genes for quantitative realtime PCR normalization studies of gene expression in Nitraria tangutorum. Scientific Reports， 2020， 10：1-10 [百度学术]
Krupinska K， Desel C， Frank S， Hensel G. WHIRLIES are multifunctional DNA-binding proteins with impact on plant development and stress resistance. Frontiers in Plant Science， 2022， 13： 880423 [百度学术]
Wei Q， Wang J， Wang W， Hu T， Hu H， Bao C. A high-quality chromosome-level genome assembly reveals genetics for important traits in eggplant. Horticulture Research， 2020， 7： 153 [百度学术]
Akbudak M， Filiz E. Whirly （Why） transcription factors in tomato （Solanum lycopersicum L.）： Genome‑wide identification and transcriptional profiling under drought and salt stresses. Molecular Biology Reports， 2019， 46： 4139-4150 [百度学术]
庄焜扬. 温度胁迫下番茄叶绿体与细胞核双定位WHIRLY1蛋白的功能分析. 泰安：山东农业大学， 2020 [百度学术]
Zhuang K Y. Functional analysis of dual localization WHIRLY1 protein in tomato chloroplasts and nuclei under temperature stress. Taian：Shandong Agricultural University， 2020 [百度学术]
赵淑亚. 番茄SlWHY2基因的克隆、表达和功能分析.泰安：山东农业大学， 2016 [百度学术]
Zhao S Y. Cloning， expression and functional analysis of tomato SlWHY2 gene. Taian：Shandong Agricultural University， 2016 [百度学术]
Yan Y， Liu W， Wei Y， Shi H. MeCIPK23 interacts with Whirly transcription factors to activate abscisic acid biosynthesis and regulate drought resistance in cassava . Plant Biotechnology Journal， 2020， 18： 1504-1506 [百度学术]
Zhou L， Li J， He Y， Liu Y， Chen H. Functional characterization of SmCBF genes involved in abiotic stress response in eggplant （Solanum melongena） . Scientia Horticulturae， 2018， 233： 14-21 [百度学术]
Lai C， Que Q， Pan R， Pan R， Wang Q， Gao H， Guan X， Che J， Lai Get. The single-stranded DNA-binding gene Whirly （Why1） with a strong pathogen-induced promoter from Vitis pseudoreticulata enhances resistance to Phytophthora capsici. International Journal of Molecular Sciences， 2022， 23： 8052 [百度学术]