水稻耐冷基因<bold>qCTS-9</bold>的核苷酸多样性及单倍型分析

郭玉静; 陈祖武; 董铮; 李小湘; 刘文强; 郭梁; 薛可欣; 郑晓明; 逄洪波; 潘孝武; GUO Yujing; CHEN Zuwu; DONG Zheng; LI Xiaoxiang; LIU Wenqiang; GUO Liang; XUE Kexin; ZHENG Xiaoming; PANG Hongbo; PAN Xiaowu

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水稻耐冷基因qCTS-9的核苷酸多样性及单倍型分析 PDF

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郭玉静 ^1,2
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陈祖武 ²
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李小湘 ²
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刘文强 ²
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郭梁 ²
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薛可欣 ^1,2
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郑晓明 ^3,4
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逄洪波 ⁵
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潘孝武 ^1,2
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1. 湖南大学生物学院隆平分院，长沙 410125； 2. 湖南省农业科学院水稻研究所，长沙 410125； 3. 中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081； 4. 三亚中国农业科学院国家南繁研究院，海南三亚 571700； 5. 沈阳师范大学生命科学学院，沈阳 110034

最近更新：2024-10-09

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240103001

摘要

qCTS-9是在多种苗期低温条件下稳定发挥作用的水稻耐冷基因，研究其耐冷优异单倍型及适应性进化模式，有利于为水稻耐冷育种提供基因资源和技术支撑。本研究利用116份栽培稻（Oryza sativa L.）和37份普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.），对qCTS-9基因的核苷酸多样性及单倍型进行了分析。结果表明，qCTS-9基因编码区内的14个SNPs组成了8种单倍型，其中的4个非同义SNPs组成3种功能单倍型，这3种功能单倍型之间表现出显著的耐冷性差异，编码区的第1535 bp处SNP可能是qCTS-9基因的关键变异位点。对qCTS-9基因启动子区顺式作用元件进行分析后发现，相比于野生稻和粳稻，低温敏感籼稻Hap4单倍型材料中-1107 bp有一个SNP （G→A），导致该处的MYB识别位点缺失，这个自然变异可能与籼稻耐冷性下降相关。野生稻包含栽培稻中qCTS-9基因的大部分变异，但在编码区及启动子顺式作用元件中无独有的变异位点；从野生稻向籼粳分化的过程中，耐冷相关等位或突变被固定和扩展，进而增强了其区域适应性。

关键词

水稻; 耐冷性; qCTS-9; 核苷酸多样性; 单倍型; 驯化

水稻（Oryza sativa L.）是世界上最重要的粮食作物之一，为世界一半以上的人口提供主食^［

1］。低温限制了水稻在全球的分布，在全球范围内，低温胁迫导致水稻减产广泛存在^{［参考文献 2

百度学术}2］。随着水稻连作面积的增加，以及水稻种植向高海拔以及高纬度寒冷地区的扩展，发生冷害的频率也在明显增加^{［参考文献 3

百度学术}3］。水稻在苗期会受到低温冷害的威胁，长江中下游的早籼稻因倒春寒引起烂秧死苗，寒地粳稻区低温引起生长抑制、生育期推迟。研究水稻耐冷基因的优异单倍型、适应性进化模式及驯化历史，将为水稻耐冷育种提供基因资源和技术支撑。

水稻的耐冷性是一种由数量性状位点（QTL，quantitative trait locus）控制的复杂性状^［

4-6］，这些遗传位点及其主基因可以作为提高水稻低温耐受性的分子模块^{［参考文献 7

百度学术}7］。迄今为止，已经克隆了一些水稻苗期耐冷基因。COLD1通过与G蛋白α亚基RGA1相互作用，激活Ca²⁺通道以感知低温，并增强G蛋白GTP酶活性，赋予水稻耐冷性^{［参考文献 8

百度学术}8］。GSTZ基因编码一个Zeta类谷胱甘肽转移酶，参与酪氨酸的分解代谢，该基因编码区的1个单核苷酸多态性（SNP，single nucleotide polymorphisms，A→G）引起第99位的氨基酸发生变异（Ile⁹⁹→Val⁹⁹），导致酶活性显著下降和耐冷性降低^{［参考文献 9

百度学术}9］。HAN1基因编码一种氧化酶，通过调控茉莉酸（JA，jasmonic acid）介导的低温反应负调控水稻的耐冷性^{［参考文献 10

百度学术}10］。转录因子OsbZIP71与OsbZIP73相互作用，通过调节脱落酸（ABA，abscisic acid）水平和活性氧（ROS，reactive oxygen species）的动态平衡，提高水稻的耐冷性^{［参考文献 11

百度学术}11］。COLD11基因编码DNA修复蛋白COLD11/RAD51A1，其第一外显子GCG重复数影响低温胁迫下编码蛋白修复DNA损伤的生化活性^{［参考文献 12

百度学术}12］。qCTS-9基因（Os09g0410300）编码转录起始因子TFIID subunit 2 （TAF2），TAF2是TFIID转录起始复合物家族的高度保守成员，在细胞周期调控中起重要作用^{［参考文献 13-14}13-14］，其启动子区的序列差异引起基因的差异表达，进而引起耐冷性的差异^{［参考文献 15

百度学术}15］；耐冷性是复杂数量性状，易受环境影响，但qCTS-9在多种苗期低温条件下稳定发挥耐冷性^{［参考文献 16

百度学术}16］，因此对qCTS-9基因耐冷优异单倍型的发掘具有重要应用价值。

本研究选择116份栽培稻（Oryza sativa L.）和37份普通野生稻（Oryza rufipogon Griff.），分析水稻苗期耐冷基因qCTS-9变异位点的多样性，挖掘苗期耐冷的优异单倍型及适应性进化模式，为通过分子育种提高水稻耐冷性提供支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究共使用116份栽培稻（材料信息详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240103001，附表1）和37份普通野生稻（材料信息详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240103001，附表2），这些水稻材料覆盖了14个国家及地区，包括中国（88份）、印度（11份）、日本（11份）、菲律宾（7份）、印度尼西亚（7份）、韩国（5份）、孟加拉国（5份）、尼泊尔（5份）、斯里兰卡（4份）、越南（3份）、缅甸（3份）、老挝（2份）、巴基斯坦（1份）及马来西亚（1份），主要分布在东亚、南亚及东南亚栽培稻主栽区。栽培稻材料包含89份粳稻（Japonica）、22份籼稻（Indica）、2份Aro以及3份Aus。

表1 不同单倍型分组在四种材料中的频率

Table 1 The frequency of different haplotype groups in the four materials

单倍型分组 Haplotype group	粳稻 Japonica		籼稻 Indica		Aro		Aus
单倍型分组 Haplotype group	数量 Number	比例（%） Proportion	数量 Number	比例（%） Proportion	数量 Number	比例（%） Proportion	数量 Number	比例（%） Proportion
Hap1	74	83.15	0	0	0	0	0	0
Hap2	13	14.61	5	22.73	0	0	0	0
Hap3	1	1.12	6	27.27	1	50.00	1	33.33
Hap4	0	0	6	27.27	0	0	0	0
Hap5	0	0	2	9.09	0	0	1	33.33
Hap6	0	0	1	4.55	1	50.00	1	33.33
FHap1	74	83.15	0	0	0	0	0	0
FHap2	14	15.73	7	31.82	1	50.00	1	33.33
FHap3	1	1.12	15	68.18	1	50.00	2	66.67
qCTS-9^Jap	74	83.15	0	0	0	0	0	0
qCTS-9^Ind	14	15.73	20	90.91	2	100	3	100

1.2 水稻材料的苗期耐冷性鉴定

对栽培稻群体进行耐冷性鉴定，幼苗培养与苗期低温黄叶率鉴定参考宋佳等^［

17］的方法。水稻种子在50 ℃烘箱中放置3 d打破休眠，浸种发芽后在28 ℃组培室（12000 Lux，12 h光照/12 h黑暗）中进行苗期培养，培养至三叶一心期时进行低温处理，置于4 ℃人工气候培养箱（12000 Lux，12 h光照/12 h黑暗）中低温胁迫处理24 h，处理结束后转移至原组培室恢复生长7 d。3次生物学重复，每个重复培养16株幼苗。叶片发黄超过一半面积记作黄叶，统计幼苗的黄叶率作为耐冷指标，黄叶率（%） =（黄叶个数/总叶数）×100% 。

使用SPAD-502型叶绿素仪测定苗期叶绿素含量，测定位置选取两叶一心期水稻幼苗第二叶的中上部，每个水稻品种取3次SPAD值的平均值为处理前SPAD终值，测定完成后将水稻幼苗置于10℃下胁迫48 h（12000 Lux，12 h光照/12 h黑暗）。胁迫完成后的水稻幼苗再次测定SPAD值，重复3次，取3次SPAD值的平均值为胁迫后终值。

1.3 重测序数据获取

本研究重测序数据来源于Zheng等^［

18］的研究，提取水稻叶片的DNA，每个样本使用约1.5 μg DNA构建文库，并在Illumina HiSeq平台进行测序，去除含有≥10%不确定碱基（N）的读数、质量评分（Phred quality score）< 5 的读数、与适配器有>10 nt对齐的读数（允许≤10%不匹配）、潜在的PCR重复，得到有效数据。采用日本晴（O. sativa ssp. japonica Nipponbare）基因组（MSU 7.0版本，http：//rice.plantbiology.msu.edu/pub/data/Eukaryotic_Projects/o_sativa/annotation_dbs/pseudomolecules/version_7.0/all.dir/）作为参考，比对测序数据。通过有效过滤（测序深度＞7×；最小等位基因频率＞0.01；缺失率＜0.02），获得高质量SNPs用于核苷酸多样性及单倍型分析。

1.4 统计分析

使用R包geneHapR^［

19］依据样本重测序数据绘制基因编码区核苷酸多样性图、单倍型分类图及单倍型网络图，可视化基因模型上的变异位置、单倍型分类和进化网络，绘图过程中删除杂合变异位点并丢弃含缺失数据的位点。使用CandiHap^{［参考文献 20

百度学术}20］软件进行水稻苗期耐冷黄叶率表型的箱线图绘制，利用GraphPad Prism9.0.0绘制低温处理前后叶绿素含量SPAD箱线图，同时采用Student’s的T检验进行差异显著性评估。从 NCBI （www.ncbi.nlm.nih.gov）网站下载qCTS-9启动子区序列（起始密码子上游2000 bp），利用在线工具PlantCARE （https：//bioinformatics. psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）预测基因启动子区顺式作用元件，结合试验样本的启动子区核苷酸多样性进行分析。使用Adobe Illustrator 2022软件对图片进行处理和编辑。

2 结果与分析

2.1 qCTS-9基因编码区的核苷酸多样性

qCTS-9基因（Os09g0410300）位于第9染色体，其编码区序列（CDS，coding sequence）在14531190 bp到14547560 bp之间（+链），CDS全长为4614 bp，共包含26个外显子，编码蛋白共有1537个氨基酸，包含保守的谷氨酸锌化氨肽酶（Gluzincin）结构域。116份栽培稻的重测序数据结果显示（图1），qCTS-9基因编码区（内含子除外）共有14个SNPs，包含7个非同义突变，其中3个SNPs位于Gluzincin结构域中，分别是1535 bp （A→G，Asn→Ser）、1746 bp（G→T，Leu→Phe）及1847 bp （G→A，Cys→Tyr）。核苷酸比对中未发现任何插入和缺失（InDel， Insertion and deletion）。进一步对37份野生稻材料的序列进行分析，发现野生稻编码区序列包含本研究中栽培稻编码区的绝大部分变异，但未发现野生稻特有的变异位点，其变异位点在栽培稻中全部能够找到。相比于野生稻，粳稻样本编码区无特有的变异，而部分籼稻材料的编码区内有3个位点324 bp （A→C）、2241 bp （A→G）及2844 bp （A→C）发生新的自然变异，但均为无义突变，表明qCTS-9基因不同SNPs位点在野生稻驯化过程中逐步固定在籼粳不同群体中。

图 1 qCTS-9基因编码区的核苷酸多样性

Fig.1 Nucleotide polymorphisms in the qCTS-9 coding region

红色的SNPs代表非同义突变位点

SNPs marked in red represent non-synonymous mutation sites

2.2 qCTS-9基因编码区单倍型分析

编码区的14个SNPs在116份栽培稻材料中共具有8个单倍型（图2A）。其中，Hap1和Hap2单倍型属于高频率单倍型，分别占样本总数的63.79%和15.52%，其余单倍型样本个数均在9个及以下。单倍型网络图展示了8个单倍型间的进化关系（图2B），单倍型间连线上点的数量代表两单倍型间的差异位点数量^［

19］，据此可将单倍型划分为变异位点更为相似的A和B两组。A组主要由粳稻构成，包含单倍型Hap1、Hap2及Hap6，B组主要由籼稻构成，包含单倍型Hap3、Hap4及Hap5；其中，Hap1和Hap4分别是粳稻和籼稻特有单倍型，且二者间差异位点最多，14个变异位点中只有6个变异位点相同，表现出最大的序列差异；其余单倍型均由籼稻和粳稻等共同组成，Hap7和Hap8由于所含样本数少于3个，分析时不予考虑。

图2 qCTS-9基因编码区单倍型分析

Fig. 2 Haplotypes analysis of qCTS-9 coding region

A：所有单倍型的分类图；B：所有单倍型的Network图，图例上方弧线按比例对应单倍型饼图不同样本数量，单倍型间连线上点的数量代表两单倍型间的差异位点数量；C：功能单倍型分类图；D：功能单倍型低温处理后黄叶率，不同小写字母代表P<0.05水平上的差异显著性；E：功能单倍型低温处理前后叶绿素含量（SPAD）， * 代表P<0.05水平上的差异显著性

A： The classification of all haplotypes for qCTS-9； B： The Network of all haplotypes for qCTS-9， the arc above the legend corresponds proportionally to the different sample sizes in the haplotype pie chart，the number of points on the line connecting haplotypes represents the number of differential sites between two haplotypes； C： The classification of functional haplotypes for qCTS-9； D： The value of yellow leaf rate of functional haplotypes for qCTS-9，different lowercase letters represent significant differences at the P<0.05 level； E：The changes of SPAD value in chlorophyll content of functional haplotypes before and after low temperature treatment，*： Significant differences at the level of P<0.05

为了进一步探究不同单倍型对耐冷表型的影响，对qCTS-9基因编码区的变异位点进行筛选，编码区发生变化的14处核苷酸中只有7处是非同义突变，筛去变异样本量少于3个的变异位点，最终得到4个功能SNPs：1535 bp （A→G， Asn→Ser）、1746 bp （G→T， Leu→Phe）、1847 bp （G→A， Cys→Tyr）、4514 bp （T→C， Ile→Thr）。这4个SNPs构成的3种功能单倍型FHap1（包括Hap1）、FHap2（包括Hap2、Hap6和Hap7）及FHap3（包括Hap3、Hap4、Hap5和Hap8），样本数分别为74个、23个和19个（图2C）。以低温处理后的黄叶率为形态学评价指标，发现单倍型FHap1与FHap3的平均黄叶率差异显著，分别为21.46%和79.69% （P=0.000< 0.05），表明FHap1单倍型的74份栽培稻材料的耐冷性更好，是优异单倍型，而FHap3单倍型的19份样本材料的则表现为低温敏感；另外23份样本材料所代表的FHap2单倍型平均黄叶率为52.91%，耐冷表现一般（图2D）。水稻在低温胁迫下会减少叶绿素合成，因此本研究在形态学指标黄叶率基础上增加光合生理指标叶绿素含量SPAD（详见https：//doi.org/10.13430/j.cnki.jpgr.20240103001，附表1），以进一步评价水稻样本的耐冷性。3种功能单倍型在低温处理后SPAD值都表现出显著降低，且无论处理前后，FHap1的SPAD值显著高于FHap3，即FHap1更耐冷，这与黄叶率指标表明的耐冷性结果相一致（图2E）。

3种功能单倍型在不同类型材料中的频率有明显差异（表1）：FHap1、FHap2及FHap3在粳稻样本中占比分别为83.15%、15.73%、1.12%，在籼稻样本中分别占比0、31.82%、68.18%，在Aro样本中分别占比0、50.00%、50.00%，在Aus样本中分别占比0、33.33%、66.67%，表明粳稻中耐冷的FHap1单倍型分布较多，而籼稻中则广泛存在对低温敏感的FHap3单倍型，这与粳稻整体耐冷性高于籼稻的特性相一致。功能单倍型FHap1与单倍型Hap1样本完全一致，全部由74份粳稻材料构成，FHap1中1535 bp处的碱基A是其特有的，根据此位点将所有单倍型分为qCTS-9^Jap组（单倍型Hap1）及qCTS-9^Ind组（1535 bp A→G， Asn→Ser；单倍型Hap2 ~ Hap6）。在116份栽培稻材料中，qCTS-9^Jap组的平均黄叶率（21.46%）显著小于qCTS-9^Ind组（65.58%），栽培稻qCTS-9^Jap组表现为更耐冷，因此推测SNP¹⁵³⁵可能是qCTS-9基因的关键变异位点。该变异位点也将野生稻分为包含15份样本的qCTS-9^Jap组和包含22份样本的qCTS-9^Ind组，其中15份qCTS-9^Jap组样本全部来源于中国，22份qCTS-9^Ind组样本则广泛分布于印度、印度尼西亚、马来西亚、老挝、尼泊尔、斯里兰卡以及越南等东南亚国家，表明该关键变异位点最有可能源于中国的野生稻品种。

2.3 qCTS-9基因启动子区核苷酸多样性与顺式作用元件分析

顺式作用元件包括脱水响应元件核心基序DRE core^［

21］、ABA响应元件ABRE^{［参考文献 22

百度学术}22］、MYB识别位点^{［参考文献 23

百度学术}23］、MYBHv1结合位点（CCAAT-box ）^{［参考文献 24

百度学术}24］以及G-box元件^{［参考文献 25

百度学术}25］等，在低温胁迫下诱导耐冷相关基因表达，从而提高植物的耐冷性。对116份栽培稻qCTS-9基因启动子区的核苷酸多样性和顺式作用元件进行分析，共获得68个SNPs和5个InDels，其中11个SNPs和1个InDel位于低温反应元件中（图3）。本研究中粳稻材料特有的耐冷单倍型Hap1与参考基因型日本晴序列一致，在变异位点-1990 bp和-1107 bp处未发生变异，拥有完整的顺式作用元件DRE core、MYB识别位点及MYBHv1结合位点，而籼稻特有的冷敏感单倍型Hap4所有样本在这两个位点处发生变异，缺失完整顺式作用元件。因此，推测DRE core元件、MYB识别位点及MYBHv1结合位点的存在可能与水稻耐冷性有关。37份野生稻样本在变异位点-1990 bp处未产生G→C变异，在-1107 bp位点也未产生G→A变异；仅籼稻特有的Hap4单倍型在-1107 bp位点存在变异A，表明此处MYB识别位点及MYBHv1结合位点的缺失可能与qCTS-9籼稻单倍型群体的冷敏感性相关。

图3 qCTS-9基因启动子低温响应顺式作用元件

Fig. 3 The low-temperature responsive cis-acting elements analysis of qCTS-9 gene promoter

标尺代表序列长度

The ruler represents the sequence length

3 讨论

3.1 qCTS-9基因在野生稻和栽培稻中的遗传变异

种群间的遗传变异是育种中有用突变的最终来源^［

26］。对116份栽培稻及37份野生稻材料的qCTS-9基因序列进行分析，发现野生稻编码区变异包含栽培稻编码区14个变异位点中的11个，未发现野生稻特有的变异位点；在水稻驯化过程中，栽培稻qCTS-9基因产生了新的自然变异，但编码区中鉴定出的自然变异未能引起氨基酸变化。Zhao等^{［参考文献 15

百度学术}15］利用耐冷粳稻品种LTH和冷敏感籼稻品种SHZ-2构建的遗传群体克隆了qCTS-9基因，该基因的编码区序列在这两个品种间无差异，启动子中存在5个SNPs和1个InDel的序列差异，单因素方差分析表明该InDel与苗期耐冷性显著相关。由于样本数量的增加，本研究在qCTS-9基因的编码区发现14个SNPs，启动子区获得68个SNPs和5个InDels，与Zhao等^{［参考文献 15

百度学术}15］发现的序列差异不同，且变异位点数量明显增多。MYB 家族转录因子是植物中最大的一类转录因子家族，在调控植物非生物胁迫过程中扮演重要作用^{［参考文献 27

百度学术}27］。拟南芥MYB15蛋白能够与下游耐冷基因CBF启动子中的MYB元件结合，抑制CBF基因的表达，从而降低耐冷性^{［参考文献 23

百度学术}23］。在栽培稻驯化过程中，籼稻和粳稻的HAN1基因^{［参考文献 10

百度学术}10］因自然变异发生了分化，来自温带粳稻的一个特定等位基因在HAN1启动子中获得了一个MYB顺式作用元件，该等位基因在粳稻向北扩展过程中提供了对高纬度低温环境的适应优势。通过分析qCTS-9基因启动子区的顺式作用元件，发现有一新的自然变异位于-1107 bp （G→A）所处的MYB识别位点及MYBHv1结合位点中，导致籼稻单倍型Hap4缺失该顺式作用元件而粳稻单倍型Hap1拥有完整的顺式作用元件，这可能与籼粳之间的耐冷性差异相关。

3.2 qCTS-9基因编码区单倍型分析

在栽培稻驯化过程中，低温适应能力逐渐分化，以适应不断变化的生态环境^［

28］。根据qCTS-9基因编码区的变异，将116份栽培稻测序材料分组为8个单倍型，共14个SNPs变异位点，其中包含4个非同义SNPs（变异样本数≥3），综合这4个功能SNPs获得3种功能单倍型。功能单倍型FHap1耐冷表现最佳，该单倍型可用于辅助筛选及培育耐冷优良水稻品种；FHap1中的龙粳14、宁粳23黄叶率都＜5%且低温处理前后SPAD值皆＞30，是耐冷表现优良的水稻品种。此外，根据位于第1535 bp处的SNP将所有单倍型分为qCTS-9^Jap组和qCTS-9^Ind组，qCTS-9^Jap组表现更耐冷。水稻驯化过程与有利等位基因或突变的固定和扩展有关，这些等位基因或突变增强了水稻在年气温较低地区的耐冷性^{［参考文献 23

百度学术}23］。如COLD1^{［参考文献 8

百度学术}8］的关键SNP 源于中国普通野生稻，在粳稻驯化过程中受到强烈的人工选择，这是其适应寒冷环境的基础。bZIP73^{［参考文献 11

百度学术}11］在粳稻和籼稻两个亚种之间只有一个功能SNP（+511 G→A），水稻驯化早期，bZIP73^Jap（+511 G）在野生稻O. rufipogon III中被选择，后在粳稻中进一步被选择，这可能促进了粳稻适应寒冷气候。COLD11基因^{［参考文献 12

百度学术}12］第一外显子GCG重复数影响低温胁迫下编码蛋白修复DNA损伤的生化活性，大多数籼稻品种携带3个GCG重复序列，温带粳稻品种含有2个（TCG + 3个GCG）的重复序列，GCG重复序列的数量增多在水稻北扩过程中被选择并固定下来，使粳稻品种更耐低温。本研究结果发现，qCTS-9^Jap（1535 bp A）起源于野生稻，后在粳稻育种过程中被选择，且该变异位点最有可能源于中国的野生稻品种，在籼稻和热带地区来源的野生稻中都没有发现该等位变异，但该SNP是否为qCTS-9基因的关键变异位点还有待于下一步的实验验证。

参考文献

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