甘薯储藏期低温胁迫的转录组分析和关键基因挖掘

肖世卓; 张毅; 戴习彬; 周志林; 孙健; 曹清河; Xiao Shizhuo; Zhang Yi; Dai Xibin; Zhou Zhilin; Sun Jian; Cao Qinghe

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江苏徐淮地区徐州农业科学研究所/农业农村部甘薯生物学与遗传育种重点实验室，徐州 221131

最近更新：2024-07-04

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240104002

摘要

甘薯在储藏过程中受到低温冷害会大大降低甘薯的商品价值，因此研究甘薯耐低温储藏的分子机制，减少低温在甘薯储藏过程中的影响具有重要意义。本研究选取了较耐低温储藏、不耐低温储藏以及表现居中的3个甘薯品种商薯19（S19）、烟薯25（Y25）和苏薯16（S16），分别在9℃和6℃储藏35 d。提取上述处理的薯块总RNA进行转录组测序和比较分析，发现与对照相比，S19在低温储藏后的差异表达基因较少，而Y25则相反，S16居中。差异表达基因KEGG和GO分析发现，甘薯块根在低温胁迫下蛋白酶体相关基因的表达水平较高。最终，通过比较不同品种不同温度下的转录组数据，得到响应储藏期低温胁迫的候选基因Ibat.Brg.02F_G010830，该基因注释为冷胁迫响应类受体蛋白激酶。qRT-PCR验证该基因的表达与转录组数据相一致。进一步分析了该基因及其等位基因和同源基因的进化关系，并分析了该基因在不同品种中的变异。本研究将为甘薯低温储藏响应机制解析以及耐低温储藏品种的选育提供支撑。

关键词

甘薯; 储藏; 低温胁迫; 转录组; 类受体蛋白激酶

甘薯［Ipomoea batatas （L.） Lam.］是旋花科番薯属多年生双子叶草本植物，是重要的粮食、饲料和能源作物，广泛种植于世界上100多个国家或地区，据统计，2022年甘薯总产量居所有粮食作物中的第七位^［

1］。中国是世界上最大的甘薯生产国，种植面积达220.61万公顷，占全球的29.76%，鲜薯年产量达到了4682.88万吨，占世界总产量的一半以上，在世界甘薯生产中的地位举足轻重^{［参考文献 1

百度学术}1］。甘薯皮薄、肉嫩，水分含量高达65%～75%，营养丰富，采后极易出现失水萎缩、发芽劣变、腐烂变质等现象^{［参考文献 2

百度学术}2］。提高甘薯的耐储藏性、延长储藏时间可以保证甘薯的周年供应，大大提高种植利润。甘薯对储藏温度较为敏感，当储藏温度达到15℃以上，薯块呼吸旺盛，容易发芽；当储藏温度低于9℃则易受冷害，水溶性软果胶变为不溶性硬果胶，蒸煮时硬心^{［参考文献 3

百度学术}3］。除此之外，甘薯块根遭遇冷害后还会引起软腐病和由块根细胞壁破坏引起的普遍软化，导致经济损失率高达30%以上^{［参考文献 4

百度学术}4］。而北方甘薯收获之后，越冬保存时的室外温度常低于9℃。因此，研究甘薯低温储藏下的生理生化变化和分子机制，对耐低温储藏品种的选育和提高甘薯的耐低温储藏能力具有重要意义。

作物调节低温适应能力的基因众多，主要包括与细胞膜系统、抗氧化酶、碳水化合物代谢和激素代谢等相关基因^［

5］。甘薯是基因组杂合的六倍体作物，基因组较为复杂，分子遗传学的研究较为迟缓^{［参考文献 6

百度学术}6］。关于甘薯耐冷分子机制的研究主要集中于转录组学，包括地上部分和地下部的耐冷相关研究。例如，周桦楠等^{［参考文献 7

百度学术}7］以耐冷品种‘辽薯36’为试验材料，在低温处理不同的时间段取样对地上部进行转录组测序，通过比较分析，获得283个共有基因在低温处理不同的时间段均上调表达，26个基因下调表达，差异表达基因被大量富集到蛋白激酶活性、过氧化物酶活性、氧化还原酶活性等生物学通路中。Xie等^{［参考文献 8

百度学术}8］通过比较4℃和14℃下甘薯品种‘徐薯18’的转录组数据，发现差异基因主要集中于细胞膜系统、抗氧化酶、碳代谢和激素代谢通路。Ji等^{［参考文献 9

百度学术}9］对低温胁迫以及胁迫恢复后的甘薯叶片进行转录组分析，鉴定到甘薯中的COR基因并非类似于拟南芥中的上调表达，表明甘薯可能存在独特的低温胁迫应答机制。Lee等^{［参考文献 10

百度学术}10］克隆得到了甘薯中的过氧化物酶基因IbLfp，在甘薯中过表达该基因能提高甘薯对低温的耐受性，这种耐受性是通过增强过氧化物酶（POD，peroxidase）的活性，提高活性氧（ROS，reactive oxygen species）的清除能力来实现的。microRNA也参与到了植物生长发育的各个阶段，Xie等^{［参考文献 11

百度学术}11］通过对冷胁迫下甘薯薯块转录组的深度测序，共鉴定到26个差异表达的miRNA，进一步分析显示miRNA介导的SA、ABA和ROS途径参与甘薯块根在储藏期间对低温胁迫的反应。

类受体蛋白激酶（RLKs，receptor-like protein kinases）是植物中较大的基因家族之一，其主要作用是通过胞外结构域感知外界刺激，激活胞内结构域从而将信号传导至细胞内，该过程对植物的抗逆、抗病以及信号转导等重要生理过程有重要意义^［

12］。冷胁迫也属于逆境胁迫，同样需要蛋白激酶的感知和传导，但是关于这方面的内容研究还较少，主要集中在模式植物中^{［参考文献 13

百度学术}13］。例如水稻钙依赖蛋白激酶OsCPK24可能通过谷氧还蛋白途径调节谷胱甘肽积累，进而参与抵御冷胁迫引起的氧化刺激^{［参考文献 14

百度学术}14］。CTB4a是一种定位在叶绿体的富含亮氨酸的重复受体激酶，CTB4a通过与ATP合酶的β亚基AtpB互作，通过调节冷胁迫下ATP含量来调控水稻应对低温胁迫的能力^{［参考文献 15

百度学术}15］。OsSAPK8是水稻低温信号转导途径中的关键蛋白激酶，可以与环核苷酸门控离子通道OsCNGC9互作，通过将OsCNGC9磷酸化从而改变其通道活性，进而促进低温胁迫诱导的胞外钙离子内流、胞内钙离子浓度上升和低温胁迫相关的基因表达^{［参考文献 16

百度学术}16］。

总体来讲，甘薯储藏期间对低温胁迫响应的分子机制研究并不清晰，尤其缺乏对甘薯耐低温基因的挖掘。本研究前期在低温地区筛选到对低温储藏表现差异的不同品种，通过对不同温度下储藏后3个品种的转录组数据进行分析，获得差异表达基因（DEGs，differentially expressed genes），进一步挖掘到影响甘薯储藏期响应低温胁迫的候选基因。本研究旨在探索甘薯耐低温储藏的分子机制，为甘薯的低温储藏提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本研究所选用的试验材料为较耐低温储藏的甘薯品种‘商薯19号’（S19）、不耐低温储藏的品种烟薯25号（Y25）以及耐低温表现居中的品种苏薯16号（S16）^［

17］，材料来源于江苏徐淮地区徐州农业科学研究所。2022年3个品种各20株种植于江苏徐州试验基地，株距35 cm，行距70 cm，起垄栽培，常规田间管理。薯块收获洗去泥土之后，各品种分别选取外观匀称均一的3个薯块储藏于9℃（样本命名为-9）和6℃（样本命名为-6）的恒温柜中，湿度保持在40%。储藏35 d之后，将薯块取出，去皮后取薯块中间部分薯肉，置于液氮中迅速冷冻，-80℃条件下保存。3个品种刚收获的薯块取相同的组织部位视为对照样品（CK）。每个处理设置3个重复。

1.2 cDNA文库构建和测序

使用TIANGEN RNAprep pure Plant Kit试剂盒（天根生化科技有限公司，中国北京）分别提取上述共27份样品的总RNA。使用NanoDrop 1000（NanoDrop公司，美国威明顿）检测RNA的浓度和纯度，使用Agilent Bioanalyzer 2100的RNA Nano 6000 分析试剂盒（安捷伦科技公司，美国帕洛阿托）评估RNA完整性。使用Illumina HiSeq 2000平台构建cDNA文库并测序，建库和测序由广州基迪奥生物科技有限公司完成。

1.3 数据比对和表达量统计

利用fastp^［

18］对测序得到的原始数据（Raw reads）进行质控，过滤低质量数据，得到有效数据（Clean reads），使用HISAT2软件^{［参考文献 19

百度学术}19］将有效数据比对至甘薯参考基因组‘Beauregard’（http：//sweetpotato.uga.edu/）。根据比对结果，利用Stringtie^{［参考文献 20

百度学术}20］重构转录本，并使用RSEM^{［参考文献 21

百度学术}21］计算每个样本中所有基因的表达量。

1.4 差异表达基因分析

基因差异表达分析的输入数据为基因表达水平分析中得到的Reads count数据，使用DESeq2^［

22］软件分析，对Read count进行标准化，根据模型进行假设检验概率（p value）的计算，最后进行多重假设检验校正，得到错误发现率（FDR，false discovery rate）。基于差异分析结果，筛选差异显著基因，差异筛选条件如下：错误发现率<0.05，|log₂FC|>log₂（2）。差异表达基因基于GO（Gene Ontology）数据库和KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）数据库进行功能注释。数据统计和可视化在https：//www.omicsmart.com/云平台进行。

1.5 qRT-PCR分析

使用MonScript RTIII All-in-One Mix with dsDNase试剂盒（莫纳生物科技有限公司）将构建文库的所有RNA反转录成cDNA，使用SYBR^® Green Realtime PCR Master Mix（TOTOBO生物科技有限公司）进行qRT-PCR分析。以Actin作为内参，引物序列见表1。反应体系为20 μL，其中包含上述Mix 10 μL，正反向引物各1 μL（10 μM），DNA样品2 μL（50 ng/μL），ddH₂O 6 μL。反应条件为95 ℃ 60 s；95 ℃ 15 s，60 ℃ 15 s，72 ℃ 45 s，40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。采用2^‒ΔΔCt法计算基因的相对表达量，将Y25的其中一组对照表达量设置为1，对其他数据进行标准化。

表1 qRT-PCR引物及序列

Table 1 Primers and sequences for qRT-PCR

目的基因

Target genes

正向引物序列（5′-3′）

Forward primer sequence（5′-3′）

反向引物序列（5′-3′）

Reverse primer sequence（5′-3′）

Actin

CCAGACTCCTCATACTCCCCT

TGGTGGCTCTACAATGTTCCC

Ibat.Brg.02F_G010830

ACTGTGTTCTGCGACTGGAG

ACTCCTTCACCCCCTGTCTT

1.6 候选基因分析

使用DeepTMHMM^［

23］在线预测蛋白质的跨膜结构域，使用ProtComp 9.0在线预测蛋白质的亚细胞定位。在参考基因组中寻找与候选基因注释相同的基因，视为同源基因，下载上述基因的氨基酸序列，有可变剪切的基因以最长的序列为准。使用MEGA X^{［参考文献 24

百度学术}24］的ClastalW方法进行比对，获得比对结果后以最大似然法，选择默认参数构建进化树。进化树的图形化由FigTree完成。

从Zenodo数据库中（DOI：10.5281/zenodo. 7184909）下载314份甘薯种质资源的SNP和InDel数据集^［

25］，找到候选基因在上述数据集中的位置并通过bcftools提取候选基因中的变异进行分析，包含候选基因起始密码子上游2 kb和下游1 kb的序列。

2 结果与分析

2.1 转录组测序和数据比对

本研究供试的27个样本测序获得原始数据量分布于6.87 Gb~8.86 Gb，过滤之后得到的有效数据量为6.80 Gb~8.79 Gb，有效数据的质量≥Q30的占比最低为92.11%。有效序列比对至参考基因组的比例为93.23%~94.43%，比对到基因组上的平均比例为93.77%。通过对比对区域进行统计发现，86.04%~89.28%的序列比对至外显子区域，6.27%~8.37%的序列比对至内含子区域，4.41%~5.83%的序列比对至基因间区域（表2）。

表2 转录组测序数据统计

Table 2 The statistics of RNA-seq data

样品名称 Sample name	原始数据（Gb）Raw data	有效数据（Gb）Clean data	高质量（≥Q30）数据占比（%）Ratio of high-quality （≥Q30） data	有效读长比对率（%）Mapping rate of clean data	比对至外显子的读长占比（%）Ratio of reads on exon	比对至内含子的读长占比（%）Ratio of reads on intron	比对至基因间隔的读长占比（%）Ratio of reads on intergenic
S16-CK-1	8.0816562	8.005650870	92.37	93.33	86.90	7.42	5.69
S16-CK-2	8.4178035	8.341887030	92.59	93.46	86.99	7.39	5.62
S16-CK-3	7.3566081	7.293900650	92.54	93.48	87.06	7.34	5.60
S16-6-1	7.9799151	7.912614000	92.45	93.71	89.10	6.29	4.61
S16-6-2	7.7710350	7.703952757	92.59	93.62	89.00	6.32	4.68
S16-6-3	8.8648614	8.786821388	93.17	93.99	89.10	6.27	4.62
S16-9-1	7.3616382	7.278328632	93.30	94.31	88.56	6.56	4.88
S16-9-2	7.2715296	7.187873533	93.10	93.90	88.19	6.81	5.00
S16-9-3	7.9199019	7.830058385	92.11	93.23	88.73	6.44	4.84
S19-CK-1	7.9176966	7.844781889	93.54	93.37	85.80	8.37	5.83
S19-CK-2	7.2216567	7.145712651	93.60	93.30	86.04	8.16	5.80
S19-CK-3	7.5867468	7.522070461	93.47	93.57	86.49	7.87	5.64
S19-6-1	7.6128828	7.549274699	93.54	94.14	89.22	6.33	4.45
S19-6-2	8.2413606	8.170225299	94.04	94.22	89.12	6.40	4.48
S19-6-3	6.9817263	6.905972235	93.08	93.29	89.28	6.32	4.41
S19-9-1	7.1775672	7.100079816	93.75	93.77	88.63	6.71	4.66
S19-9-2	8.0454645	7.959873431	92.86	93.46	88.57	6.76	4.67
S19-9-3	6.8735613	6.803186045	92.59	93.58	88.68	6.70	4.62
Y25-CK-1	7.7430738	7.652786670	92.52	93.52	86.76	7.54	5.70
Y25-CK-2	7.3654053	7.287397894	93.75	94.16	86.89	7.48	5.63
Y25-CK-3	7.8008352	7.710995114	93.50	93.87	86.84	7.52	5.63
Y25-6-1	6.9148086	6.848221023	93.56	94.23	88.71	6.43	4.86
Y25-6-2	7.2133281	7.137973979	94.17	94.43	88.65	6.43	4.91
Y25-6-3	7.6484625	7.581351090	93.05	93.96	88.56	6.52	4.93
Y25-9-1	7.2547428	7.197959963	93.17	93.96	89.02	6.27	4.71
Y25-9-2	7.2039702	7.139341628	94.27	94.18	88.81	6.41	4.78
Y25-9-3	7.4085021	7.334954029	93.37	93.88	88.99	6.29	4.72

S16-CK为收获后未储藏的S16样品，S16-9为收获后9 ℃储藏35天的S16样品，S16-6为收获后6 ℃储藏35天的S16样品。S19和Y25以此类推。-1、-2和-3为3次重复；下同

S16-CK means the S16 that was not stored after harvest， S16-9 means the S16 stored at 9 ℃ for 35 days after harvest， and S16-6 means the S16 stored at 6 ℃ for 35 days after harvest. And so on for S19 and Y25. -1， -2， and -3 mean three replicates；The same as below

2.2 基因注释和表达量分析

根据转录组注释，所有样本共获得已知基因156714个，占参考基因组基因总数的75.52%。利用Stringtie重构转录本后，寻找出本次测序结果中被发现，但未被参考基因组收录的新基因共5210个，其中有功能注释的基因3418个。

以基因的FPKM值来统计基因的表达量，取任意两个样品中的表达量，计算每两个样品之间的皮尔逊（Pearson）相关系数。结果显示同一处理下的不同重复之间样品的相关系数较高，均大于0.99，说明样品之间的重复性较好（图1）。同一品种不同处理之间的相关性则呈现出明显的品种差异性，较耐低温储藏的品种S19，无论是9℃还是6℃储藏35天后，基因的表达量与对照之间仍存在较高的相关性，相关系数均高于0.84，说明S19储藏较长时间之后，块根内的基因表达较为稳定；而在6 ℃和9 ℃条件下储藏的样本之间相关系数均高于0.94，说明S19对储藏期低温并不敏感。而不耐低温储藏的品种Y25，在9℃保存35天时，基因的表达量与对照相比仍有较高相关性，相关系数高于0.84，而当在6 ℃保存35天后，内部基因的表达则呈现出剧烈的变化，相关系数最低甚至跌至0.12，说明Y25的对储藏期间的低温较为敏感。S16的表现则居中（图1）。

图1 样本相关性热图

Fig.1 Heat map of samples correlation

2.3 差异表达基因数量分析

进一步分析不同样本间的差异表达基因数量，相比对照（CK）而言，在6℃条件下储藏，差异表达基因数量最多的品种是Y25，达到35723个（22564个上调表达和13159个下调表达基因）（图2）；S16次之，共25763个差异表达基因（16495个上调表达和9268个下调表达基因）；S19的差异表达基因最少，为19712个（10219个上调表达和9493个下调表达基因）。如果比较同一品种不同温度（6 ℃和9 ℃）储藏条件下的差异表达基因，Y25最多，为19809个（9730个上调表达和10079个下调表达基因），S16次之，为13962个（6912个上调表达和7050个下调表达基因），S19最少，为8895个（4662个上调表达和4233个下调表达基因）。上述结果进一步印证了Y25在低温储藏条件下块根内的基因表达发生了较大变化，表现出对低温储藏敏感的特性，而S19对低温储藏较不敏感，S16表现居中。

图2 差异表达基因数量

Fig.2 The number of differentially expressed genes

2.4 差异表达基因的GO和KEGG分析

为了进一步明确不同品种在低温下的分子响应，分别对不同品种在低温储藏（6℃）条件下与对照相比的差异表达基因进行GO富集分析。从细胞组分分析发现，对低温储藏较敏感的Y25，排名前三的差异表达基因富集于蛋白酶体复合体（GO：0000502）、内肽酶复合物（GO：1905369）和肽酶复合物（GO：1905368）通路；同样条件下S16的差异表达基因排名前三的同样是这三个通路；而对低温储藏不敏感的品种S19排名前三的差异表达基因则是MCM复合体（GO：0042555）、蛋白酶体复合体和蛋白酶体核心复合体（GO：0005839）（图3A）。除了蛋白酶体相关通路基因富集，MCM复合体的富集可能是S19更耐低温储藏的原因之一。从分子功能角度分析，6℃下储藏的Y25与对照相比，排名前三的差异表达基因富集于苏氨酸型肽酶活性（GO：0070003）、苏氨酸型内肽酶活性（GO：0004298）和核苷三磷酸酶活性（GO：0017111）；S16的差异表达基因富集也主要集中于蛋白酶活性通路；S19则是富集于小分子结合（GO：0036094）、核苷磷酸盐结合（GO：1901265）以及核苷酸结合（GO：0000166）。从生物进程角度分析，6℃下储藏的Y25与对照相比，排名前三的差异表达基因富集于糖原代谢过程（GO：0005977）、糖原生物合成过程（GO：0005978）和细胞碳水化合物代谢过程（GO：0044262）；S16的差异表达基因也是主要富集于糖和淀粉的合成和代谢过程；S19则富集于有机化合物氧化的能量释放（GO：0015980）、小分子代谢过程（GO：0044281）和有机酸代谢过程（GO：0006082）（图3A）。

图3 差异表达基因的GO（A）和KEGG（B）富集图

Fig.3 GO（A） and KEGG（B） enrichment diagrams of differentially expressed genes

圈图表示不同的比较组，最外层标尺用于描述通路中差异基因的数量；第I圈表示通路ID，不同颜色代表不同的通路；第II圈表示背景基因集中富集到该通路的基因数目；第III圈表示差异基因集中富集到通路的基因数目，不同颜色表示上调和下调表达；第IV圈表示第三圈数值与第二圈数值的比值

Different circles represent different comparison groups， the outermost scale is used to describe the number of DEGs in the pathway； Circle I represents the pathway ID， different colors represent different pathways； Circle II represents the number of genes enriched in the background gene set；Circle III represents the number of DEGs enriched in the pathway， and different colors represent up-regulated and down-regulated expression； Circle IV represents the values ratio of the third and second circle

KEGG富集分析发现，与对照相比6℃储藏条件下Y25的差异表达基因主要富集于蛋白酶体（ko03050）、淀粉和糖代谢（ko00500）以及氨基糖和核苷酸糖的代谢（ko00520）；S16则主要富集于蛋白酶体、氨基糖和核苷酸糖的代谢以及精氨酸和脯氨酸代谢（ko00330），而S19则主要富集于次级代谢产物的生物合成（ko01110）、DNA复制（ko03030）以及蛋白酶体（图3B）。

2.5 候选基因的选择

通过分析3个品种中CK vs 9℃ 和9℃ vs 6℃表达都是上升或者下降的基因，最终共获得53个上调表达基因和40个下调表达的基因（图4）。排除等位基因之后，剩余42个上调表达基因和35个下调表达的基因，将其作为最终影响甘薯储藏期响应低温胁迫的候选基因集，其中上调基因中包含9个与线粒体能量代谢相关基因、8个蛋白激酶基因、5个与质膜稳定或渗透调节有关的基因、6个转录因子基因、6个与物质代谢相关的酶基因和2个抗氧化酶基因。说明甘薯在储藏过程中受到低温胁迫首先会通过相应激酶的表达迅速响应，然后提高能量的供给抵御低温，同时调节代谢来保证质膜系统的稳定，以及通过增强抗氧化酶的表达来清除胁迫产生的过氧化物和超氧阴离子。35个下调的基因中，包含10个与物质代谢相关的基因、5个抗病相关基因、3个能量代谢相关基因、3个细胞信号转导相关基因、2个与激素相关的基因。说明薯块在储藏过程中受到低温胁迫会主动减少非必须的生理过程（如抗病等），有限的能量更倾向于分配给最基本的生理活动。

图4 差异表达基因韦恩图

Fig.4 Venn diagrams of DEGs

A：上调表达基因；B：下调表达基因；椭圆中数字表示各比较组所独有的差异表达基因，中心圆形数字表示所有比较组所共有的差异表达基因

A： Up-regulated genes； B： Down-regulated genes；Numbers in ovals indicate DEGs unique to each comparison group，and the numbers in central circular indicate the DEGs shared by all comparison groups

2.6 候选基因分析

在候选基因集中，Ibat.Brg.02F_G010830基因功能注释为冷胁迫响应蛋白激酶（CRPK1，cold-responsive protein kinase 1-like），是候选基因集中仅有的注明与冷胁迫相关的基因。该基因属于类受体蛋白激酶基因家族，有可能参与甘薯块根在储藏过程中的低温胁迫响应，故将该基因作为候选基因进行进一步的分析。根据转录组测序得到的序列设计扩增Ibat.Brg.02F_G010830基因的引物，通过qRT-PCR验证转录组数据的可靠性，结果显示，在所有样本中目的基因的表达量变化趋势与转录组数据相一致（图5A）。结果进一步证明了转录组数据以及候选基因选择的可靠性。

图5 Ibat.Brg.02F_G010830基因分析

Fig.5 Analysis of Ibat.Brg.02F_G010830 gene

A：Ibat.Brg.02F_G010830基因的表达分析，实线为转录组测序获得的转录本丰度，虚线表示qRT-PCR获得的相对表达量，数据显示为平均值±SD；B：Ibat.Brg.02F_G010830基因编码蛋白质跨膜结构预测；C：Ibat.Brg.02F_G010830及其同源基因的进化树分析；红色字体为候选基因

A： Expression analysis of the Ibat.Brg.02F_G010830 gene；The solid line is the transcript abundance obtained by transcriptome sequencing， the dashed line represents the relative expression obtained by qRT-PCR， and the data are shown as the mean ±SD；B： Ibat.Brg.02F_G010830 gene encoding protein transmembrane structure prediction；C： Ibat.Brg.02F_G010830 and phylogenetic tree analysis of its orthologs；Candidate genes are shown in red font

通过在线工具预测该基因编码蛋白质的跨膜区，发现该基因编码的蛋白不存在跨膜结构（图5B）。亚细胞定位在线预测结果显示Ibat.Brg.02F_G010830基因编码蛋白可能定位于质膜（表3），这与跨膜预测结果不一致。甘薯Ibat.Brg.02F_G010830蛋白的亚细胞定位有待进一步的实验验证。

表3 Ibat.Brg.02F_G010830蛋白质的亚细胞定位预测

Table 3 Prediction of subcellular localization of Ibat.Brg.02F_G010830

位置权重 Location weights	潜在位置分值LocDB	潜在位点分值PotLocDB	神经网络分值NeuralNets	五聚体分值Pentamers	积分值 Integral
细胞核 Nucleus	0	0	0	0	0.03
质膜 Plasma membrane	10	1.2	1	1.08	8.07
细胞外 Extracellular	0	0	1	0	0
细胞质 Cytoplasmic	0	0.9	0	0.79	0.60
线粒体 Mitochondrial	0	0	0	2.41	0.09
内质网 Endoplasmic reticulum	0	0	0	1.11	0.51
过氧化物酶体 Peroxisomal	0	0	1	0	0
高尔基体 Golgi	0	0	0	0.13	0
叶绿体 Chloroplast	0	0.9	0	0.41	0.61
液泡 Vacuolar	0	0	0	0	0.10

通过进一步的分析发现，甘薯基因组中共有85个基因与Ibat.Brg.02F_G010830基因有着相同的功能注释，使用这些基因构建进化树，其中与Ibat.Brg.02F_G010830基因亲缘关系最近的4个基因分别分布于4条不同的同源染色体，可以将他们视为该基因的等位基因，位于Ibat.Brg.02C染色体上的等位基因可能丢失（图5C）。其中，位于Ibat.Brg.02A染色体上的基因Ibat.Brg.02A_G010050与其差异最小。除了等位基因，位于6号染色体上的5个同源基因（其中Ibat.Brg.06C染色体上存在2个拷贝）与其亲缘关系最近。

从数据库中下载314份甘薯的重测序数据，分析候选基因在不同品种中的变异情况。通过同源比对检索到了Ibat.Brg.02F_G010830基因在重测序数据参考基因组（‘徐薯18’）中对应的基因Iba_chr03aCG14160。该基因在不同的甘薯品种间存在131个SNP和14个InDel，其中5′上游存在29个SNP和4个InDel，外显子存在36个SNP，包含5个非同义突变，内含子存在24个SNP和5个InDel，3′下游存在42个SNP和5个InDel（表4）。

表4 位于Ibat.Brg.02F_G010830基因的变异统计

Table 4 The statistics of variations on Ibat.Brg.02F_G010830

候选基因

Candidate gene

‘徐薯18’中的对应基因Corresponding gene in 'Xushu18'

5´上游

5´ up-stream

外显子Exon

非同义变异

Non-synonymous

内含子Intron

3´下游

3´ down-stream

总变异数Total

Ibat.Brg.02F_G010830

Iba_chr03aCG14160

29/4

36/0

5/0

24/5

42/5

131/14

‘/ ’前后分别代表的是SNP和InDel的数量

The number before and after the symbol ‘/ ’ represent the SNPs and InDels， respectively

3 讨论

提高甘薯在储藏过程中的耐低温能力不仅可以节约储藏成本，又能延长储藏时间，有利于提高甘薯的经济价值，但是甘薯响应低温储藏的分子机制仍不清晰。不同的甘薯品种对低温储藏的耐受性不同，本研究选取了对低温储藏耐受性表现不同的3个主栽甘薯品种，在不同的温度下进行储藏，并获取其转录组信息进行比较，来探寻甘薯耐低温储藏的分子机制。研究发现，储藏过程中较耐低温的甘薯品种S19在低温胁迫下体内基因的表达变化明显少于不耐低温的品种Y25，表现出了明显的低温不敏感特征。不同的甘薯品种在低温储藏下蛋白酶体相关基因的表达都显著上升，说明低温胁迫导致薯块体内蛋白质的降解。从KEGG以及GO的多个角度分析，Y25在低温储藏条件下与对照相比的差异表达基因主要集中于蛋白质降解、淀粉降解等，而S19则是集中于核苷酸结合、DNA复制和次级代谢物合成等，说明S19在低温胁迫下具备更强的调控、修复和抗氧化能力。

通过比较不同品种在低温储藏条件下处于一直上调或者下调的基因，取交集来寻找调控甘薯储藏期响应低温的基因，总共获得了42个上调表达基因和35个下调表达的基因。上调基因主要是与线粒体能量代谢、蛋白激酶以及质膜稳定有关，下调基因主要与物质代谢、抗病、细胞信号转导等相关。

从上调基因中选取注释为冷响应蛋白的基因Ibat.Brg.02F_G010830作为候选基因做进一步的研究。该基因属于类受体蛋白激酶，蛋白激酶是一类催化蛋白质磷酸化反应的酶，可以将磷酸基团从一个供体转移到基质蛋白受体。植物类受体蛋白激酶的工作机理主要是通过胞外信号分子与其胞外区结构域特异结合，结合后激活胞内激酶域而完成跨膜信号的转导。低温对于植物是一种逆境刺激，感受低温刺激的受体非常重要，但是这方面的研究较少。研究人员通过筛选拟南芥T-DNA突变体库，发现了1个类受体激酶CRPK1负调控植物抗冻性，进一步研究发现低温激活CRPK1活性，并磷酸化14-3-3蛋白，磷酸化的14-3-3蛋白从细胞质进入细胞核后与转录因子CBF1/3蛋白相互作用并促使其降解，避免过度冷响应造成的生长抑制，从而使植物更好地平衡生长发育和抵抗逆境间的关系^［

26］。这对甘薯Ibat.Brg.02F_G010830基因响应低温应答的分子机制研究具有重要的借鉴意义。前人研究表明，拟南芥类受体蛋白激酶CRPK1没有明显的跨膜结构，但是激光共聚焦显微镜观察其特异地定位于原生质体的细胞质膜，并且低温并不影响其定位^{［参考文献 26

百度学术}26］。它是如何定位到细胞膜上的仍不清楚。而结构预测显示Ibat.Brg.02F_G010830也没有跨膜结构域，但是亚细胞定位预测其可能定位于质膜。这说明Ibat.Brg.02F_G010830可能与拟南芥CRPK1有着类似的工作模式，即在冷胁迫的信号传导过程中发挥作用，但是该蛋白是否真正定位于细胞膜以及通过什么方式定位到细胞膜，需要进一步的实验来验证。关于甘薯类受体蛋白激酶与低温胁迫的研究较少，但是甘薯中其他蛋白激酶的研究对本研究也有借鉴之处。研究人员在甘薯中过表达丝裂原活化蛋白激酶基因（MAPK），转基因植株在低温条件下仍能保持高光效和较低的细胞膜损伤，进一步研究发现转基因植株中的过氧化物酶表达水平较高，导致过氧化物积累水平较低，从而保证转基因植株表现出对低温的耐受性增强^{［参考文献 27

百度学术}27］。进一步对该转基因植株进行转录组测序，获得了与野生型之间的差异基因集，并通过酵母双杂交筛选到了与IbPAMK3互作的蛋白^{［参考文献 28

百度学术}28］。Ibat.Brg.02F_G010830基因在甘薯中有85个同源基因，其中包含5个不同的等位基因，位于Ibat.Brg.02C染色体上的等位基因可能在进化的过程中丢失。该基因在甘薯的种质资源中含有145个变异（SNP和InDel），其中5个是非同义的突变，这些变异可能造成了该基因不同等位基因的分化表达以及不同品种中表达和功能上的差异。

综上所述，本研究通过对3个不同的甘薯品种在不同温度储藏下的薯块进行转录组测序，获得了甘薯储藏期应对低温胁迫的转录组图谱，通过差异比较，得到了甘薯储藏过程中响应低温胁迫的基因，并对其中一个候选基因Ibat.Brg.02F_G010830进行了深入分析，上述结果将为甘薯低温储藏响应机制的研究以及耐低温储藏品种的选育提供支撑。

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