蒿叶猪毛菜<bold>GPAT</bold>基因家族成员鉴定及其在干旱胁迫下的表达模式分析

杜明阳; 马健芝; 多杰措; 罗天蓉; 熊辉岩; 陈亦婷; 段瑞君; DU Mingyang; MA Jianzhi; DUO Jiecuo; LUO Tianrong; XIONG Huiyan; CHEN Yiting; DUAN Ruijun

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蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员鉴定及其在干旱胁迫下的表达模式分析 PDF

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段瑞君 ^1,2
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1. 青海大学生态环境工程学院，西宁 810000； 2. 青海大学农牧学院，西宁810000

最近更新：2024-10-09

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240121003

目录contents

摘要

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT，glycerol-3-phosphate acyltransferase）是三酰甘油（TAG，triacylglycerol）生物合成的核心酶，在植物生长发育以及抗逆过程中发挥重要作用。本研究基于蒿叶猪毛菜（Salsola abrotanoides L.）转录组数据，利用生物信息学和qRT-PCR方法，对蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员进行鉴定分析并探究其表达模式。以BLASTP比对和HMM搜索2种方法共鉴定出35个GPAT成员；理化性质分析表明，大多数蛋白属于碱性蛋白；亚细胞定位预测表明，Sa_GPAT家族成员主要分布于内质网；空间结构预测显示，二级结构主要以α螺旋为主，三级结构较为稳定。系统发育树分析显示，该家族分为4个亚家族，其中组别4为特有亚家族，且与拟南芥GPAT家族不存在聚类关系。信号肽预测显示蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中未存在信号肽，且跨膜结构分析表明蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中约63%存在跨膜结构。表达模式分析表明，蒿叶猪毛菜GPATs呈现组织特异性表达，其中Sa_GPAT003在幼苗中高度表达，结合幼苗干旱胁迫转录组结果发现多数Sa_GPAT家族成员响应外界干旱胁迫，其中Sa_GPAT032在干旱胁迫后表达量极显著升高。由此推测，蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员可能在抵抗干旱胁迫方面起着重要作用。

关键词

蒿叶猪毛菜; GPAT基因家族; 生物信息学; 转录组

甘油-3-磷酸酰基转移酶（GPAT，glycerol-3-phosphate acyltransferase）是三酰甘油（TAG，triacylglycerol）生物合成的核心酶^［

1］，以不同脂肪族酰基及其衍生物为底物，催化酰基从酰基辅酶A（Acylcoenzyme A， acyl-CoA）或酰基载体蛋白（Acyl-carrierprotein，acyl-ACP）向甘油-3-磷酸（G3P，glycerin-3-phosphate）的sn-1或sn-2位点转移，生成溶血磷脂酸（LPA ，lysophosphatidic acid）^{［参考文献 2

百度学术}2］，而溶血磷脂酸则是膜脂、胞外聚酯、储存脂等甘油脂质的主要中间产物^{［参考文献 3

百度学术}3］。因此GPATs可分为两种类型，第一类是将酰基载体蛋白（acyl-ACP）或酰基从酰基辅酶A（acyl-CoA）向sn-1转移的sn-1型GPAT，第二类则是具有磷酸酶活性的sn-2型GPAT^{［参考文献 4

百度学术}4］。GPAT作为调控脂质生物合成代谢过程中的重要物质，在植物生长发育以及抵抗逆境胁迫过程中起到了重要作用^{［参考文献 5

百度学术}5］。

目前，已在多种植物中对GPAT基因家族进行了一系列的深入研究，包括拟南芥（Arabidopsis thaliana （L.） Heynh.）^［

6-7］、水稻（Oryza sativa L.）^{［参考文献 8

百度学术}8］、大麦（Hordeum vulgare L.）^{［参考文献 9

百度学术}9］、蒺藜苜蓿（Medicago truncatula Gaertn.）^{［参考文献 2

百度学术}2］、玉米（Zea mays L.）^{［参考文献 10

百度学术}10］，证实GPAT家族在植物中普遍存在。其中，在模式植物拟南芥中共鉴定10个AtGPATs，根据亚细胞定位可分为3类：质体ATS1^{［参考文献 11

百度学术}11］、线粒体AtGPAT1～AtGPAT3^{［参考文献 12

百度学术}12］和内质网AtGPAT4～AtGPAT9^{［参考文献 13

百度学术}13］，其中质体ATS1在叶绿体中起到合成甘油脂的重要作用^{［参考文献 14

百度学术}14］，通过调节脂类代谢进而影响植株的生长发育及逆境抗性^{［参考文献 15

百度学术}15］；线粒体AtGPAT1基因的突变会影响花粉粒细胞内膜的形成，从而导致雄性不育^{［参考文献 16

百度学术}16］。

植物在整个生长过程中会面临众多胁迫，大体分为生物胁迫和非生物胁迫，其中非生物胁迫给植物带来的影响更为明显。低温、干旱和高盐等逆境是最主要的逆境因子，它可通过改变细胞膜的流动性，干扰细胞膜的生理功能，引起细胞的生理功能异常，进而影响植株的生长发育^［

17］。前期研究表明，GPAT在逆境条件下可引起叶绿体类囊体膜中磷脂酰甘油不饱和度的变化，并通过调控脂质结构，增加顺式不饱和脂肪酸的含量，以保证细胞膜的流动性与完整性^{［参考文献 18

百度学术}18］。甘蓝型油菜在干旱胁迫下能够促进和诱导叶片中BnGPAT9的表达来抵抗干旱胁迫带来的影响^{［参考文献 19

百度学术}19］。花生中AhGPAT1、AhGPAT6、AhGPAT8以及AhATS1干旱胁迫后在根中的表达水平显著升高，以此增强抗旱能力^{［参考文献 20

百度学术}20］。

蒿叶猪毛菜（Salsola abrotanoides L.）属藜科猪毛菜属C₃植物，是一种超旱生多汁盐柴类半灌木，广泛分布于青藏高原的山坡、山麓洪积扇及多岩石河滩等地，是青藏高原地区荒漠地带的主要优势物种^［

21］。因其对恶劣环境有良好的适应能力^{［参考文献 22

百度学术}22］，主要生长于荒漠区及一些极端干旱区，是高原山地荒漠植被的建群种或主要伴生种之一，在抵抗风沙、维持高原荒漠生态平衡等方面发挥着重要的作用。在该植物的生态应用中，因其抗逆性强，在干旱荒漠地区的植被恢复与重建、水土流失治理方面具有重要的应用价值。目前对蒿叶猪毛菜的关注及相关研究甚少，主要集中在蒿叶猪毛菜植物的地理分布、形态结构特征^{［参考文献 23

百度学术}23］及生理生化特征^{［参考文献 24

百度学术}24］等研究，但缺乏蒿叶猪毛菜在干旱胁迫下抗旱机制的相关研究。因此，本研究基于蒿叶猪毛菜幼苗干旱胁迫下的转录组数据，通过已知的拟南芥GPAT基因家族，对蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员进行鉴定，并对其家族成员进行了理化性质、亚细胞定位预测、二级和三级结构预测、系统发育等分析以及非生物胁迫下的表达情况分析，以期解析出高原逆境胁迫下蒿叶猪毛菜耐受的分子机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2022年10月于青海省德令哈市阿力腾寺院（N 37°22′48″， E 97°21′36″）采摘蒿叶猪毛菜成熟叶片、茎以及新鲜种子，经室外晾晒干燥处理后获得试验所需种子，先用无菌水浸泡并置于4 ℃冰箱中春化24 h，然后使用5%次氯酸钠浸泡消毒10 min后，无菌水冲洗5~7次，最后接种到MS培养基中置于培养间培养，培养条件为：光照/黑暗18 h/6 h，光照强度为6000 Lx，温度22 ℃，相对湿度30%。萌发一周后，将幼苗转移到水培培养体系中，取一半幼苗于1/2霍格兰营养液中培养，以未添加PEG-6000的1/2霍格兰营养液处理的幼苗为对照组，其余一半幼苗移至用营养液配制的处理液（1.5% PEG-6000）中进行胁迫处理作为处理组。在处理3 d后进行取样，收集所有幼苗后快速放入液氮中进行速冻，-80℃冰箱保存待用。取对照组和处理组的幼苗用于干旱胁迫转录组测序，每组3次生物学重复。

1.2 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员鉴定

基于蒿叶猪毛菜的干旱胁迫转录组测序数据及其注释结果（未公布），以拟南芥GPAT基因家族成员的蛋白序列为对比序列，通过BLASTP比对和HMM搜索2种方法（E-value≤1×10^-5），初步鉴定获得蒿叶猪毛菜的GPAT基因家族候选成员。然后采用PFAM （https：//www.ebi.ac.uk/interpro/entry/pfam/）、NCBI CDD （https：//www.ncbi. nlm.nih.gov/cdd/）和 SMART （http：//smart.embl.de/）数据库对候选的GPAT蛋白序列进行保守结构域分析，确保每个GPAT家族候选成员都具有PlsC酰基转移酶结构域（PF01553）。

1.3 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员的信号肽、亚细胞定位、跨膜结构预测分析及理化性质

利用ExPAsy（https：//web.expasy.org/protparam/）分析蒿叶猪毛菜GPAT蛋白序列的氨基酸数目、分子量、等电点、不稳定指数和亲疏水性等理化性质；利用SignalP-6.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/SignalP-6.0/）进行信号肽预测；Plant-mPLoc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/）进行亚细胞定位预测；TMHMM-2.0（https：//services.healthtech.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）进行跨膜结构预测。

1.4 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员的二级结构、三级结构预测

分别利用Prabi（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.plpage=npsa_sopma.html）和SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）进行二级结构和三级结构预测，并整理蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员三级结构预测图。

1.5 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员的保守基序和系统发育分析

使用在线网站MEME 5.5.4（https：//meme-suite.org/meme/tools/meme）预测分析GPAT蛋白序列的保守基序，搜寻motif值设置为20，结构域宽度设定为最小6、最大100，其他参数设置为默认值，最后通过TBTools^［

25］软件绘制出保守基序图。通过MEGA 7^{［参考文献 26

百度学术}26］软件中的Clustal W程序将拟南芥、蒿叶猪毛菜GPAT蛋白序列进行多序列比对分析，并通过邻接法（NJ，neighbour-joining）构建系统发育树，bootstrap=1000以评价系统发育树的构建的可靠性。最后使用Evolvie（http：//www.omicsclass.com/article/963）在线软件对进化树进行美化。

1.6 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员表达水平分析

根据构建的系统发育树进行分类，从4个亚家族中随机选取7个蒿叶猪毛菜GPATs（Sa_GPAT003、Sa_GPAT007、Sa_GPAT016、Sa_GPAT023、Sa_GPAT032、Sa_GPAT034、Sa_GPAT035）且保证每个亚家族至少存在1个基因，进行qRT-PCR实验。使用TaKaRa公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒，从蒿叶猪毛菜正常幼苗、成年枝、成年叶以及干旱胁迫处理的幼苗中提取总RNA，并通过1%的琼脂凝胶电泳及Nanodrop测定其RNA完整性和浓度。然后按照FastKing gDNA Dispelling RT SuperMix试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行cDNA合成。使用Primer 5以及NCBI在线引物设计网站设计qRT-PCR引物，以NGDC数据库中近缘物种碱蓬（Suaeda glauca）的Tubulin为参考，选择蒿叶猪毛菜的SaTubulin作为内参基因（表1）。使用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）荧光定量预混试剂盒（天根生化科技有限公司，北京）进行qRT-PCR，反应体系为20 μL：cDNA模板1 μL、上下游引物各0.6 μL（10 μmol/L）、2×SuperReal Color PreMix 10 μL、ddH₂O 7.8 μL。实时荧光定量反应程序为三步法：95 ℃预变性15 min；95 ℃变性10 s、60 ℃退火20 s、72℃延伸32 s，共40个循环。采用2^-△△Ct法计算各基因在不同组织中的相对表达量，每个基因进行3个生物学重复，并对每次样本进行3次技术重复，用以检测目的基因的表达情况。最后使用软件GraphPad Prism 8进行分析并绘制基因表达柱状图。

表1 qRT-PCR引物列表

Table 1 Primer sequences for qRT-PCR

引物名称 Primer name	引物序列（5′- 3′） Primer sequence（5′- 3′）	引物用途 Primer function
SaTubulin-F	CAACTGGCTTCAAATGTGGTATCA	内参基因
SaTubulin -R	ATCTTCACGGGCTTCAGAAAACTC	内参基因
Sa_GPAT003-F	TCGCATCATTGCTCCCTCCA	qRT-PCR
Sa_GPAT003-R	GGACCCAACCGCCATTATTT
Sa_GPAT007-F	TGAGCTTGACTGCCCTGTTT
Sa_GPAT007-R	TCGGCAAATTGAATGGGGGT
Sa_GPAT016-F	CGGTAATAGGATGGTCAATG
Sa_GPAT016-R	AGTGCCCTCAACAAACAGAG
Sa_GPAT023-F	CACTGCCATAGTCGCCATCT
Sa_GPAT023-R	TCCAATCCCTCAAATTCCAC
Sa_GPAT032-F	TTTCTCCATCATACCCATCT
Sa_GPAT032-R	CCCTTATTACACTACCACCT
Sa_GPAT034-F	CCTGTGGCTGTGGATTGTCA
Sa_GPAT034-R	TATCTAGGGCGAGGGTTCAT
Sa_GPAT035-F	GCTTCATCCTAGCCATCTGC
Sa_GPAT035-R	TCCCACGTATCACGAGTTTT

2 结果与分析

2.1 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员的鉴定与理化性质分析

基于蒿叶猪毛菜转录组数据，以拟南芥GPAT蛋白序列为查询序列，开展BLASTP比对和HMM搜索，共获得45个GPAT候选基因，经过结构域验证，最终在蒿叶猪毛菜中共筛选鉴定出35个GPATs，分别命名为Sa_GPAT001~Sa_GPAT035。利用ExPAsy在线软件对蒿叶猪毛菜GPATs蛋白进行理化性质预测，预测结果见表2。蒿叶猪毛菜35个GPAT基因家族成员之间的氨基酸数量以及其他理化性质差异较大，在35条GPATs蛋白序列中，蛋白氨基酸数量为111（Sa_GPAT025）~1136（Sa_GPAT005）个，平均长度约为298个氨基酸残基；分子量在11423.07（Sa_GPAT024）~129590.95（Sa_GPAT005）Da 之间，平均分子量为33915.67；等电点在7.01（Sa_GPAT006）~10.27（Sa_GPAT011）之间，其中3个蛋白（Sa_GPAT002、Sa_GPAT006、Sa_GPAT033）的等电点分别为7.15、7.01、7.91，为酸性蛋白，但绝大多数蛋白（91.4%）的pI都大于8，说明大多数蒿叶猪毛菜GPATs蛋白富含碱性氨基酸，属于碱性蛋白。不稳定系数范围在23.46（Sa_GPAT021）~62.14（Sa_GPAT004）之间，13个蛋白（Sa_GPAT003、Sa_GPAT004、Sa_GPAT007、Sa_GPAT010、Sa_GPAT011、Sa_GPAT013、Sa_GPAT016、Sa_GPAT017、Sa_GPAT020、Sa_GPAT023、Sa_GPAT026、Sa_GPAT029、Sa_GPAT032）为不稳定蛋白（不稳定系数＞40），其余22个蛋白均为稳定蛋白。GPATs家族成员的脂溶性指数介于78.87（Sa_GPAT030）~116.86（Sa_GPAT013）之间，16个蛋白的亲水性平均系数小于0，为亲水性蛋白，其余蛋白为疏水性蛋白。

表2 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员理化性质、亚细胞定位、信号肽、二级和三级结构分析

Table 2 Physicochemical characteristics， subcellular localization， signal peptide， secondary and tertiary structure analysis of GPAT gene family members of Salsola abrotanoides

蛋白 Protein	氨基酸数量 Number of amino acids	分子量（Da）Molecular weight	等电点 pI	不稳定系数Instability index	亲脂系数Aliphatic index	亲水性平均系数GRAVY	亚细胞定位Subcellular location	跨膜结构Transmembrane structure	信号肽Signal peptide	α螺旋（%）Alpha helix	β折叠（%）Beta turn	无规则卷曲（%）Random coil	延长链（%）Extended strand	模型及序列同源性（%） Model and sequence homology
Sa_GPAT001	267	29419.72	10.18	37.00	106.63	0.251	细胞膜，线粒体	2	0	43.45	5.62	32.58	18.35	A0A0F7RXP5.1.A （83.15%）
Sa_GPAT002	233	26217.49	7.15	33.50	112.58	0.191	内质网	1	0.0004	32.19	9.01	30.90	27.90	B9SAC8.1.A （73.16%）
Sa_GPAT003	476	53538.22	9.52	49.21	87.23	-0.301	内质网	0	0	53.36	5.88	31.72	9.03	A0A0K9QUJ4.1.A （80.08%）
Sa_GPAT004	162	18159.21	8.48	62.14	114.88	0.132	线粒体	0	0.0010	38.27	9.88	31.48	20.37	A0A316UHQ7.1.A （79.63%）
Sa_GPAT005	1136	129590.95	8.95	36.08	98.90	-0.106	叶绿体	0	0	53.35	4.05	29.31	13.29	8e4y.1.A （27.06%）
Sa_GPAT006	130	15174.57	7.01	38.37	93.00	-0.028	线粒体	0	0	41.54	9.23	33.08	16.15	8e4y.1.A （38.58%）
Sa_GPAT007	381	44020.24	8.52	47.83	91.31	-0.069	内质网	3	0	45.93	3.94	35.17	14.96	R0GQV7.1.A （82.13%）
Sa_GPAT008	333	38805.47	9.60	36.19	98.32	-0.054	内质网	2	0	48.35	3.00	33.63	15.02	5kym.1.A （30.08%）
Sa_GPAT009	175	19481.80	9.92	32.72	96.97	0.014	内质网	0	0.0101	30.29	4.57	41.71	23.43	5kym.1.A （23.18%）
Sa_GPAT010	191	22476.86	9.45	43.19	116.44	0.329	内质网	2	0	40.84	2.62	36.65	19.90	C6T7V7.1.A （73.82%）
Sa_GPAT011	145	16686.48	10.27	41.86	86.00	-0.105	内质网	0	0.0059	31.03	5.52	41.38	22.07	7zkq.1.E （36.23%）
Sa_GPAT012	419	47641.07	9.23	33.31	94.25	-0.132	细胞膜，线粒体	1	0.0005	42.00	3.10	40.10	14.80	5kym.1.A （26.01%）
Sa_GPAT013	185	21634.80	9.41	43.26	116.86	0.365	内质网	2	0	49.19	3.24	29.73	17.84	A0A6A3A2Q3.1.A （76.76%）
Sa_GPAT014	254	28613.51	9.86	26.95	101.22	0.144	内质网	1	0	36.61	1.97	40.16	21.26	5kym.1.A （27.91%）
Sa_GPAT015	151	17295.18	9.42	30.76	91.13	-0.103	内质网	1	0	45.03	4.64	33.11	17.22	5kym.1.A （30.83%）
Sa_GPAT016	321	36515.91	9.48	42.95	99.00	0.108	内质网	1	0	47.04	4.36	30.84	17.76	I1JG72.1.A （83.01%）
Sa_GPAT017	286	32986.02	9.03	44.25	112.41	0.244	内质网	1	0	51.40	3.85	28.67	16.08	A0A2Z6MWG6.1.A （70.88%）
Sa_GPAT018	396	45340.54	9.43	27.05	91.57	-0.107	内质网	3	0	47.98	3.54	34.60	13.89	5kym.2.A （19.21%）
Sa_GPAT019	162	18227.07	8.86	30.47	87.16	0.078	内质网，高尔基体	0	0	30.25	3.09	39.51	27.16	5kym.2.A （24.24%）
Sa_GPAT020	348	41264.33	9.34	44.48	93.85	-0.064	内质网，高尔基体	2	0	51.15	3.16	31.90	13.79	8e4y.1.A （19.84%）
Sa_GPAT021	210	24418.25	9.84	23.46	100.24	0.200	内质网	1	0	51.43	6.67	27.14	14.76	5kym.1.A （28.81%）
Sa_GPAT022	145	16766.56	9.78	33.42	90.00	-0.234	内质网	1	0	33.10	4.14	35.17	27.59	5kym.1.A （19.09%）
Sa_GPAT023	259	29351.65	9.80	50.96	106.49	0.358	叶绿体	3	0	28.57	5.41	38.61	27.41	A0A0K9RBY9.1.A （74.89%）
Sa_GPAT024	103	11423.07	9.91	36.41	83.20	-0.335	内质网	0	0	15.53	8.74	45.63	30.10	5kym.1.A （30.30%）
Sa_GPAT025	111	12243.39	9.75	26.58	100.18	-0.017	内质网	0	0	44.14	5.41	33.33	17.12	5kym.1.A （24.21%）
Sa_GPAT026	224	25184.44	9.03	42.36	98.35	-0.013	内质网	0	0	34.82	5.36	42.86	16.96	A0A068UH70.1.A （74.16%）
Sa_GPAT027	203	22080.64	8.23	28.46	80.25	0.032	内质网	0	0	31.03	2.96	49.75	16.26	5kym.1.A （21.74%）
Sa_GPAT028	463	52203.22	9.12	30.10	95.51	0.162	内质网，线粒体	2	0.0095	38.88	5.62	34.34	21.17	A0A803KN11.1.A （72.53%）
Sa_GPAT029	272	31060.03	8.86	42.16	93.86	0.048	内质网	2	0	27.57	5.15	48.53	18.75	A0A4U5QZR5.1.A （71.95%）
Sa_GPAT030	142	16428.01	8.63	29.63	78.87	-0.258	线粒体	0	0	33.10	8.45	42.25	16.20	5kym.1.A （17.92%）
Sa_GPAT031	501	55652.08	9.27	34.79	98.98	0.155	内质网，线粒体	2	0	40.52	5.39	35.13	18.96	Q9CAY3.1.A （71.87%）
Sa_GPAT032	573	64950.10	9.25	44.81	94.19	0.031	线粒体	2	0.0010	38.22	5.93	38.05	17.80	A0A5J4ZZA4.1.A （70.40%）
Sa_GPAT033	124	13510.58	7.91	34.31	81.77	-0.181	线粒体	0	0	34.68	5.65	41.94	17.74	A0A066VZM6.1.A （72.73%）
Sa_GPAT034	532	60408.84	8.59	36.25	98.89	0.119	内质网，线粒体	2	0	38.53	4.32	38.72	18.42	A0A803LF07.1.A （80.99%）
Sa_GPAT035	428	48278.04	9.20	36.62	101.61	0.116	线粒体	2	0.0001	41.59	5.37	35.05	17.99	A0A803KZA9.1.A （85.65%）

GRAVY：Grand average of hydropathicity

2.2 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员系统发育分析

为深入解析蒿叶猪毛菜GPAT基因家族蛋白之间的进化关系，使用MEGA 7邻接法构建蒿叶猪毛菜（35个）与拟南芥（10个）GPAT蛋白的系统发育树。如图1所示，以模式植物拟南芥的蛋白家族为分类基准，将35个GPATs蛋白分为组别1（5个）、组别 2（8个）、组别 3（9个）、组别 4（13个），其中组别1对应拟南芥AtGPAT1 ~AtGPAT8，组别2 对应拟南芥的AtGPAT9，组别3对应拟南芥的ATS1。此外，组别 4中Sa_GPAT023和Sa_GPAT029各聚为一类，其余11个成员单独聚为一类，且组别4未与拟南芥GPAT家族成员存在聚类关系。

图 1 蒿叶猪毛菜与拟南芥GPAT基因家族成员的系统发育树

Fig. 1 Phylogenetic tree of GPAT gene family members of Salsola abrotanoides and Arabidopsis

2.3 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员亚细胞定位、跨膜结构及信号肽分析

跨膜结构预测显示13个蛋白（约占37%）不存在跨膜结构且大多属于组别3，其余22个蛋白（约占63%）均存在1~3个跨膜结构。家族成员信号肽指数皆小于0.5，且大部分为0，表明蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中不含有信号肽。亚细胞定位表明，GPATs家族成员主要分布于细胞膜、线粒体、内质网、叶绿体以及高尔基体上，其中2个蛋白定位于叶绿体，11个蛋白定位于线粒体上，其余定位于内质网、细胞膜、高尔基体上（表2）。

2.4 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员结构分析

利用 Prabi在线软件对蒿叶猪毛菜GPAT家族成员进行二级结构预测（表2），结果显示GPATs蛋白的二级结构均由α螺旋、β折叠、无规则卷曲、延长链组成，其所占比例平均值分别为39.74%、5.11%、36.36%、18.79%。且在所有GPATs蛋白中，除13个蛋白（Sa_GPAT009、Sa_GPAT011、Sa_GPAT014、Sa_GPAT019、Sa_GPAT022、Sa_GPAT023、Sa_GPAT024、Sa_GPAT026、Sa_GPAT027、Sa_GPAT029、Sa_GPAT030、Sa_GPAT033、Sa_GPAT034）外，α螺旋占比均大于无规则卷曲。使用SWISS-MODEL软件对蒿叶猪毛菜GPAT家族成员进行三级结构预测，表2和图2表明蒿叶猪毛菜GPAT家族35个蛋白共有22种三级结构模型，其中模型5kym.1.A占比最高（31.4%）；其中20个蛋白建模氨基酸比例均高于90%；序列同源性除Sa_GPAT016蛋白外均高于70%；并且主要以1-酰基-sn-甘油-3-磷酸酰基转移酶结构（54%）模型为主，如图2中Sa_GPAT008。此外，通过观察比对表2、图2发现这35个GPAT蛋白质都由较多的α螺旋和无规则卷曲构成，各GPAT亚家族均具有典型的PlsC结构且属于α型结构域，这与二级结构的预测结果一致，但各个蛋白质的三级结构的氨基端和羧基端部分却含有不同的磷酸化位点，如组别 1中氨基端和羧基端部分的主要磷酸位点为亮氨酸；组别 2中氨基端的磷酸位点主要为丝氨酸，羧基端的磷酸位点为甘氨酸；组别 3中氨基端的磷酸位点主要为异亮氨酸，羧基端的磷酸位点为甘氨酸；组别 4中氨基端的磷酸位点主要为脯氨酸，羧基端的磷酸位点为亮氨酸，氨基酸残基的不同，可能会引起蛋白三维空间结构的不同，故组别1～4的蛋白质空间结构相似性并不高，但因蛋白结构的差异使得不同的亚家族成员具有不同的功能。

图 2 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员三级结构预测

Fig. 2 The tertiary structure prediction of GPAT gene family members of Salsola abrotanoides

2.5 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员保守基序分析

使用MEME在线预测GPAT蛋白的保守基序构成（图3），结果表明蒿叶猪毛菜GPAT蛋白序列的基序组成数量为1（Sa_GPAT024）~9（Sa_GPAT032），甘油-3-磷酸酰基转移酶保守结构域主要由Motif 2组成。35个GPAT成员可大致分为4组（I、II、Ⅲ、IV），与聚类树分类基本一致。同一分组的大多数成员具有相似的Motif组成，其中最保守的基序是Motif 2，共有24个GPATs蛋白包含该基序，占比69%，组别4成员大多存在Motif 2，推测GPATs蛋白在功能上可能存在一定的相似性。同一类的大多数GPAT蛋白含有一些特有的Motif，比如 Motif 3、Motif 5为组别 3特有， Motif 1为组别4特有。同时同一分类成员的Motif组成相似，说明具有相似的生物学功能。

图3 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员的系统发育树（A）、蛋白质保守基序（B）及其序列预测图（C）

Fig. 3 The phylogenesis （A）， conserved motifs （B） and conserved motif sequence（C） analysis of GPAT gene family members of Salsola abrotanoides

图B中不同颜色区块表示不同的保守基序；图C中字母的相对大小表示其在序列中出现的频率，且字母越高，该位点的保守性越好

Different coloured blocks in figure B indicate different conserved motifs； The relative size of the letters in figure C indicates how often they appear in the sequence， and the higher the letters， the better the conservation of the locus

2.6 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员组织表达分析

为了分析蒿叶猪毛菜中各 GPAT 家族成员在不同组织的表达情况，基于系统发育树分析结果，从4个亚家族中随机挑选7个基因，且保证每个亚家族至少存在一个基因，进行qRT-PCR验证并计算各基因在不同组织中的相对表达量（图4）。组织表达结果分析显示，蒿叶猪毛菜GPAT成员在各个不同的组织部位都有其特异性的表达情况。首先与拟南芥ATS1同源的Sa_GPAT003在幼苗中的表达量最高，其次是未与拟南芥GPAT家族成员存在聚类关系的Sa_GPAT023在幼苗中表达量较高，意味着Sa_GPAT003、Sa_GPAT016 基因在蒿叶猪毛菜的早期发育中起着重要作用。而其他4条GPAT在不同组织的表达量较低甚至不表达，但不同组织间仍有较强的特异性。

图4 蒿叶猪毛菜GPATs基因在不同组织中的表达情况

Fig.4 Expression of GPATs genes in different tissues of Salsola abrotanoides

*和**分别代表不同处理组相较于对照组在P < 0.05和P < 0.01水平下存在显著性差异；下同

* and ** represent significant differences between different treatment groups at the levels of P < 0.05 and P < 0.01， respectively；The same as below

2.7 蒿叶猪毛菜GPAT基因家族成员在干旱胁迫下的表达模式分析

为进一步探究蒿叶猪毛菜在干旱胁迫条件下的生物学功能，对蒿叶猪毛菜35个GPATs在干旱胁迫下的表达情况进行了分析。差异基因的筛选条件为 |log₂Fold Change| ≥ 1，且错误发现率FDR< 0.05，结果如转录组热图（图５）所示，在干旱胁迫处理后，16个GPATs下调，19个GPATs上调，且均为差异表达基因，表明GPATs可能在蒿叶猪毛菜响应高原干旱胁迫方面起着重要作用。

图5 蒿叶猪毛菜GPATs基因在干旱胁迫下的表达模式

Fig.5 Expression patterns of GPATs genes under drought stress of Salsola abrotanoides

CK：Control；DS：Drought stress；The same as below

2.8 蒿叶猪毛菜Sa_GPATs基因qRT-PCR验证分析

本研究从蒿叶猪毛菜GPAT家族成员中随机挑选7个基因（Sa_GPAT003，Sa_GPAT007，Sa_GPAT016，Sa_GPAT023，Sa_GPAT032，Sa_GPAT034，Sa_GPAT035），通过qRT-PCR技术验证分析了干旱胁迫下这7个基因的差异表达变化。实验结果表明，对照组和处理组的7个基因在干旱胁迫处理下的表达量均具有一定的差异性。由图6可知，所选7个基因在干旱胁迫处理下均呈不同程度上调表达趋势，且与转录组数据结果一致。

图6 干旱胁迫处理下蒿叶猪毛菜7个Sa_GPATs基因的qRT-PCR分析

Fig.6 qRT-PCR analysis of 7 Sa_GPATs genes in Salsola abrotanoides under drought stress treatment

3 讨论

甘油-3-磷酸酰基转移酶是三酰甘油生物合成的限速酶，催化酰基从酰基辅酶A（acyl-CoA）或酰基载体蛋白（acyl-ACP）向甘油-3-磷酸（G3P）的sn-1或sn-2位点转移，生成溶血磷脂酸（LPA）^［

2］。已有研究表明，GPAT不仅是植物生长发育、脂质合成等过程的关键物质，还是植物体应答逆境胁迫的重要物质^{［参考文献 27

百度学术}27］。迄今为止已经在众多植物中发现GPATs，但在不同的植物体内其数量存在一定的差异性，如目前已在拟南芥中鉴定出10个GPAT基因家族成员^{［参考文献 19

百度学术}19］、毛竹中鉴定出16个GPAT基因家族成员^{［参考文献 28

百度学术}28］、椰子中鉴定出14个GPAT基因家族成员^{［参考文献 29

百度学术}29］、紫花苜蓿中鉴定出73个GPAT家族成员^{［参考文献 30

百度学术}30］。在本研究中基于蒿叶猪毛菜转录组数据，共鉴定出35个GPAT成员，数量较多，推测可能与蒿叶猪毛菜为多倍体有关。

系统发育树分析表明，以模式植物拟南芥的蛋白家族为分类基准，35个Sa_GPAT蛋白共划分为4个亚家族。其中组别1含有5个Sa_GPAT成员，对应拟南芥AtGPAT1~AtGPAT8。研究表明AtGPAT1-8可能会在拟南芥^［

31］、水稻^{［参考文献 8

百度学术}8］细胞外脂质如几丁质生物合成过程中起重要作用，由此推测组别1成员可能具有相似的生物学功能；组别2含有8个Sa_GPAT成员，对应拟南芥的AtGPAT9，其中Sa_GPAT007与AtGPAT9亲缘关系最近，由于AtGPAT9基因序列高度保守，推测其与蒿叶猪毛菜中三酰甘油含量以及脂肪酸合成有关^{［参考文献 32

百度学术}32］。组别3对应拟南芥的质体型ATS1，含有9个Sa_GPAT成员，其中Sa_GPAT025与ATS1进化距离较近，拟南芥ATS1酶以及椰子CnGPAT6酶都是可溶性质体GPAT酶，在其植物体的叶绿体膜脂的合成代谢过程中起着重要作用^{［参考文献 33

百度学术}33］，进而推测Sa_GPAT025也是质体型基因。另外，组别4中Sa_GPAT023、Sa_GPAT029各聚为一类，其余11个成员单独聚为一类，推测这可能与蒿叶猪毛菜物种特异性有关。

保守基序分析发现，蒿叶猪毛菜GPAT成员与聚类树分类基本一致，可大致分为4组（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ），且基于同一分组的大多数GPAT成员具有相似的Motif组成，有学者已经对拟南芥和玉米中GPAT蛋白进行序列保守基序分析，发现ZmGPAT13蛋白与部分GPAT家族蛋白均含有排序相同的保守Motif，由此可推测出GPAT家族成员不仅在序列进化上具有很强的保守性，还在功能上可能存在一定的相似性^［

34］。

已有学者发现大豆GmGPAT9-2基因在其叶中显著表达，且在油脂积累过程中起主要作用^［

35］，在拟南芥中过表达AhGPAT9，发现其在抽薹期的茎、茎生叶以及成熟胚中表达，推测其在花生种子发育、植株生长过程中发挥重要作用^{［参考文献 36

百度学术}36］。在本研究中，不同组织的表达模式分析显示，拟南芥ATS1同源的Sa_GPAT003在幼苗中的表达量最高，其次是未与拟南芥GPAT家族成员存在聚类关系的Sa_GPAT023，这表明Sa_GPAT003、Sa_GPAT016在蒿叶猪毛菜的早期发育中起着重要作用。

已有研究提出，植物体内GPAT家族成员在各种抗逆过程中起着关键作用，椰子CnGPAT4在胚愈伤组织中高度表达，在组织损伤修复过程起重要作用^［

29］；油葵HaGPAT1不仅参与花器官的发育还在耐旱、耐盐过程中发挥重要作用^{［参考文献 37

百度学术}37］；玉米ZmGPAT13在干旱胁迫前后存在显著的表达差异，推测其在耐旱过程中发挥作用^{［参考文献 38

百度学术}38］。本研究通过干旱胁迫表达分析发现，与ATS1进化距离较近的Sa_GPAT025在干旱胁迫后表达量上调，由此可推测 Sa_GPAT025可能是蒿叶猪毛菜响应干旱胁迫的特异基因，而拟南芥AtATS1在烟草幼苗中过表达可提高其对冷胁迫的耐受性^{［参考文献 39

百度学术}39］，这表明植物的质体型GPAT在多种逆境胁迫下均发挥作用。

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