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大豆混合盐碱胁迫应答基因GmDUF247-1的克隆及功能分析  PDF

  • 谷倩楠 ✉
  • 孔瑞文
  • 孙明哲
  • 李建伟 ✉
  • 孙晓丽 ✉
黑龙江八一农垦大学农学院，大庆 163319

最近更新：2024-06-07

DOI：10.13430/j.cnki.jpgr.20240127001

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摘要

我国盐碱地分布广、面积大，是重要的后备耕地资源、粮食增产的“潜在粮仓”。挖掘负调控大豆耐混合盐碱性的基因，通过基因敲除创制耐混合盐碱大豆新品种，是合理开发利用盐碱地，提高我国大豆产量的有效途径之一。课题组前期筛选到1个混合盐碱胁迫下调表达的基因Glyma.02g271000（GmDUF247-1）。其编码的GmDUF247-1蛋白包含1个DUF247结构域和1个跨膜结构域，利用烟草叶片瞬时表达发现GmDUF247-1-GFP融合蛋白定位在细胞膜上。荧光定量PCR显示，GmDUF247-1基因在大豆根中表达量最高，在混合盐碱处理下显著下调。为研究GmDUF247-1在大豆混合盐碱胁迫下的功能，利用大豆毛状根系统过表达GmDUF247-1基因，发现混合盐碱胁迫处理后，GmDUF247-1过表达大豆毛状根复合植株叶片萎蔫程度明显高于空载体对照，存活率、根长和株高显著低于对照。对GmDUF247-1基因在大豆自然群体中的单倍型分析发现，其启动子区有8个SNPs和4个InDels，可能导致与逆境应答和生长发育相关的转录因子识别元件序列发生改变；CDS区存在3种单倍型，GmDUF247-1H1基因型受到了明显的人工选择。本研究初步明确了GmDUF247-1基因负调控大豆混合耐盐碱性，为系统研究GmDUF247-1基因功能和育种利用奠定了研究基础。

盐碱土含有较多的水溶性盐或碱性物质，土壤板结，透水透气性差，影响土壤中功能微生物活性和组成，导致土壤养分利用率、有机质含量和肥力下降，阻碍农作物生长发育，最终影响产量［

1-2］。我国是世界第三大盐碱地国家，可开发利用的盐碱地约有5.5亿亩，是重要的后备耕地资源［3-4］。以松嫩平原为代表的东北苏打盐碱土盐分组成复杂［5］。混合盐碱胁迫较单一的盐和碱相比，对作物生长和产量的危害更为严重。因此，培育耐盐碱作物，合理开发利用盐碱地资源，对于保障国家粮食安全和农业可持续发展具有重要意义。

大豆（Glycine max）是植物蛋白、食用油和动物饲料的重要来源［

6-7］，然而我国大豆总产和单产均低于世界平均水平，自给率严重不足［8］。自2019年中央一号文件提出实施大豆振兴计划以来，文件连续4年聚焦大豆的种植推广。2023年中央一号文件进一步提出“稳步开发利用盐碱地种植大豆”。因此加强大豆耐盐碱性研究，培育耐盐碱品种，合理利用盐碱地资源迫在眉睫。

耐盐碱大豆新品种培育的关键是挖掘鉴定可供育种利用的耐盐碱基因资源。国内外研究人员通过正向遗传学，定位和克隆到多个调控大豆耐盐性的关键基因，如正调控大豆耐盐基因GmSALT3（Salt tolerance-associated gene on chromosome 3）［

9-10］、GmCHX1（Cation/H exchanger）［11］、GsERD15B（Early responsive to dehydration 15B）［12］、负调控大豆耐盐基因GmCDF1（Cation diffusion facilitator）［13］等。与中性盐胁迫（NaCl和Na2SO4）相比，碱性盐胁迫（NaHCO3和Na2CO3）的调控基因挖掘报道较少，耐混合盐碱胁迫的基因尚未报道。

随着基因编辑技术的迅速发展和应用，挖掘负调控大豆耐盐碱性的基因，直接通过基因敲除创制耐盐碱大豆新种质，是耐盐碱大豆新品种培育的有效途径。本研究基于前期大豆混合盐碱转录组测序，筛选到1个下调表达基因Glyma.02G271000，包含1个DUF247结构域，命名为GmDUF247-1。DUF（Domain of unknown function）是所有尚未研究清楚功能的结构域统称，DUF247结构域广泛分布在各种植物中［

14-15］。目前仅少数研究报道了DUF247基因表达响应盐胁迫［14， 16］，但其调控大豆盐碱胁迫的功能尚未有明确报道。本研究在对GmDUF247-1进行亚细胞定位、表达模式分析的基础上，通过大豆毛状根系统进行过表达，初步明确了GmDUF247-1负调控混合盐碱耐性，为系统研究GmDUF247-1调控大豆耐盐碱的功能及育种利用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

大豆品种东农50（DN50）、本氏烟草（Nicotiana benthamiana）、农杆菌菌株GV3101、载体K599、pGreen II-62-SK-GFP和pCAMBIA1300-3FLAG均由本实验室保存；大肠杆菌DH5α菌株购自唯地生物有限公司；限制性内切酶Spe I和EcoR I购自赛默飞世尔科技公司；在生工生物工程有限公司完成测序。

1.2 试验方法

1.2.1 GmDUF247-1基因生物信息学分析

在NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）检索并下载GmDUF247-1和已报道DUF247（拟南芥AtDUF247-1、黑麦草LpSDUF247、拟南芥DLE1、大麦HvSR1）的氨基酸序列。通过NCBI-CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）和SMART（http：//smart.embl.de/index2）网站分析蛋白结构域。利用Clustal X软件进行氨基酸序列比对。

1.2.2 GmDUF247-1基因克隆及亚细胞定位分析

挑选颗粒饱满、大小一致的大豆种子，以蛭石为基质培养至一节期，将根部洗净后液氮研磨成粉末， 利用TRIzol法［

17］提取总RNA。利用诺唯赞公司RT-PCR试剂盒（HiScript II One Step RT-PCR Kit）反转录合成cDNA，方法见说明书。利用基因特异引物GmDUF247-1-GFP-F和GmDUF247-1-GFP-R（表1），以cDNA为模板进行PCR扩增，PCR总反应体系15 μL：7.5 μL TransStart Top Green qPCR SuperMix （2×），0.3 μL上下游引物（10 μmol/L），4.9 μL ddH2O，2 μL cDNA。反应程序为：94℃预变性30 s；94℃变性5 s，60℃退火15 s，72℃延伸20 s，40个循环；72 ℃终延伸10 min。回收目的片段并测序。利用Cell-Ploc（http：//www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/Cell-PLoc-2/）和UniProt（https：//www.uniprot.org/）网站在线工具预测GmDUF247-1蛋白亚细胞定位。采用pGreen II-62-SK-GFP作为GmDUF247-1蛋白亚细胞定位载体，该载体含有绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein），以组成型启动子CaMV35s驱动GmDUF247-1基因表达。利用限制性内切酶Spe I和EcoR I对pGreenII-62-SK-GFP载体双酶切，与GmDUF247-1基因片段进行连接。将测序正确的重组质粒和细胞膜定位Marker（AtPIP1A-RFP）转化至GV3101农杆菌感受态，挑取阳性单菌落活化后收集菌体， 使用侵染液（10 mmol/L MES、150 mmol/L AS、10 mmol/L MgCl2）重悬至OD600=1.0。室温静置2 h后注射烟草叶片进行瞬时表达，3 d后通过激光共聚焦显微镜（FV3000）观察GFP和RFP荧光信号，分析GmDUF247-1蛋白的定位。

表1  本研究所用引物
Table 1  Primers used in this study

引物

Primer

引物序列（5′-3′）

Primer sequence （5′-3′）

用途

Application

GmDUF247-1-GFP-F GGCGGCCGCTCTAGAACTAGTATGGAAGAAACGAAGTGGGTGG 亚细胞定位载体构建
GmDUF247-1-GFP-R GCCCTTGCTCACCATGAATTCGGGACGAAACCAAGGTCTTGG
GmDUF247-1-qF AGAAACGAAGTGGGTGGTCC 实时荧光定量PCR
GmDUF247-1-qR GCCTTTTGGTTCAACGCAGT
SUB-qF GTGTAATGTTGGATGTGTTCCC 内参基因
SUB-qR ACACAATTGAGTTCAACACAAACCG
GmDUF247-1-F GGGGTACCATGGAAGAAACGAAGTG 过表达载体构建
GmDUF247-1-R GGACTAGTGGGACGAAACCAAGGTC
pCAMBIA1300-3FLAGR TCTAGATCTCAGGCGCC 载体通用引物

1.2.3 GmDUF247-1基因表达模式分析

利用SoyOmics网站（https：//ngdc.cncb.ac.cn/soyomics/index）调取GmDUF247-1在大豆不同组织中的表达数据。分别取大豆根（Root）、茎（Stem）、子叶（Cotyledon）、叶芽（Leaf bud）、三出复叶（Leaf 1-3）、2~4周（即分别在第2周、第3周、第4周取样）豆荚（Pod）和种子（seed）、3~10周种子（Seed）等组织，用于GmDUF247-1基因组织表达分析。将大豆种子以蛭石为基质催芽5 d，转移至含有1/4 Hoagland营养液的水培盒中继续培养至一节期，用60 mmol/L混合盐碱（NaCl、Na2CO3、NaHCO3和Na2SO4按摩尔比1∶1∶9∶9混合，pH=8.9）处理大豆幼苗，模拟大庆盐碱土成分［

5］。在处理0 h、1 h、6 h分别取根进行混合盐碱胁迫下GmDUF247-1基因表达分析。利用TRIzol法提取总RNA并反转录合成cDNA。利用GmDUF247-1基因qRT-PCR引物GmDUF247-1-qF和GmDUF247-1-qR（表1），以cDNA为模板进行荧光定量PCR检测，体系与程序同1.2.2。设置3次技术重复和3次生物学重复，以大豆SUB3（Soybean ubiquitin-3）作为内参基因［18］，利用公式2-∆∆Ct计算相对表达量［19］。

1.2.4 GmDUF247-1基因植物过表达载体构建

采用pCAMBIA1300-3FLAG作为GmDUF247-1植物超量表达载体，该载体含有潮霉素（Hygromycin）植物选择标记基因，以组成型启动子CaMV35s驱动GmDUF247-1基因表达。利用Primer 5.0设计含有酶切位点的基因特异性引物GmDUF247-1-F和GmDUF247-1-R（表1）。以pGreen II-GmDUF247-1-GFP质粒为模板进行PCR扩增，体系与程序同1.2.2，7.5 μL 2×Easy Taq PCR Super Mix，循环数为35；回收GmDUF247-1基因片段。对pCAMBIA1300-3FLAG载体双酶切，与GmDUF247-1基因片段进行连接，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。挑选经PCR鉴定阳性的单菌落，活化后提质粒送交测序，测序正确的质粒（pCAMBIA1300-GmDUF247-1-3FLAG）于-20℃保存。

1.2.5 GmDUF247-1-3FLAG蛋白表达检测

通过冻融转化法将重组质粒pCAMBIA1300-GmDUF247-1-3FLAG转入根癌农杆菌GV3101，注射烟草叶片后于第48 h、60 h和72 h取样，提取总蛋白，采用Anti-Flag抗体进行Western blot检测，丽春红染色用于蛋白浓度检测。

1.2.6 GmDUF247-1过表达大豆毛状根复合体耐盐碱性分析

通过冻融转化法将重组质粒pCAMBIA1300-GmDUF247-1-3FLAG和空载体质粒pCAMBIA1300-3FLAG分别转入发根农杆菌K599，挑取阳性单菌落活化后收集菌体，使用侵染液（10 mmol/L MgCl2、10 mmol/L MES和150 mmol/L AS）重悬至OD600=1.0。通过发根农杆菌介导的毛状根转化法获得转基因毛状根复合植株［

20-22］。将DN50大豆种子以蛭石为基质培养5 d后剪去主根，使用1 mL注射器吸取侵染液，在大豆幼苗下胚轴靠近子叶节处进行注射，将幼苗在侵染液中浸泡1 min后移至湿润的蛭石中覆膜培养，待伤口处出现愈伤组织后通氧。在高温高湿环境下培养3 周后，随机抽取10个植株，通过改良CTAB法［23］提取大豆毛状根DNA，利用基因上游特异引物GmDUF247-1-F和载体通用引物pCAMBIA1300-3FLAGR（表1）进行PCR鉴定。挑选毛状根数量5~8个、根长9~12 cm、株高14~16 cm的复合植株随机分成两组，移至1/4 Hoagland营养液中适应1 d，在0和60 mmol/L混合盐碱的营养液中培养，6 d后观察大豆毛状根复合植株的叶片受损伤情况，以植株顶端生长点失水萎蔫为标准统计大豆毛状根植株的存活情况。测量处理后的大豆毛状根株高和根长，计算根长和株高的相对生长量，根长相对生长量=（处理后根长-处理前根长）/处理前根长×100；株高相对生长量=（处理后株高-处理前株高）/处理前株高×100［24］。实验共设置3次生物学重复，每次重复中每个处理每个载体设12个样本。

1.2.7 GmDUF247-1基因在自然群体中的单倍型分析

利用SoyOmics（https：//ngdc.cncb.ac.cn/soyomics/ haplotype/）数据库在3000份大豆种质资源重测序数据中提取GmDUF247-1（SoyZH13_02G248900）基因的SNP/InDel变异数据和对应的品种编号［

25］。在PlantTFDB网站（http：//planttfdb.gao-lab.org/prediction.php）预测不同基因型启动子区（5′UTR前2000 bp）转录因子结合位点。提取非同义变异类型，分别统计野生大豆、地方大豆品种和栽培大豆品种的数量，对GmDUF247-1基因的单倍型进行分析。

1.2.8 数据处理

采用SPSS 22.0软件对数据进行统计分析，利用GraphPad Prism 8软件作图。

2 结果与分析

2.1 GmDUF247-1蛋白保守结构域分析

通过SMART和NCBI网站分析GmDUF247-1和已报道DUF247蛋白AtDUF247-1［

26］、LpSDUF247［27］、AtDLE1［28］和HvSR1［16］结构，均含有1个DUF247结构域。多重序列比对发现5个蛋白的DUF247结构域序列差异较大，仅30个位点的氨基酸一致。以GmDUF247-1蛋白序列为例，在第49~59位、第118~130位、第165~178位、第307~312位氨基酸序列相对保守，推测可能是主要发挥功能的位点。此外，这些DUF247蛋白的C端都含有1个由22个氨基酸组成的跨膜结构域，说明DUF247蛋白定位和功能可能与膜系统相关（图1）。

图1  GmDUF247-1和同源蛋白序列比对

Fig.1  Sequence alignment of GmDUF247-1 and homologous proteins

“*”、“· ”以及不同颜色表示氨基酸残基在不同序列中的保守性程度，其中“*”高度保守，“· ”保守性次之

' * '， '·' and ' different colors ' indicate the degree of conservation of amino acid residues in different sequences， among which ' * ' is highly conserved， followed by '·'

2.2 GmDUF247-1基因克隆与蛋白亚细胞定位分析

GmDUF247-1基因全长2814 bp，CDS全长1380 bp，编码460个氨基酸。将GmDUF247-1 CDS全长构建至pGreenII-62-SK-GFP融合表达载体。利用基因特异引物进行PCR扩增，在Marker条带1500 bp左右出现一条扩增条带，与预期目的片段长度1380 bp相符，说明克隆成功（图2A）。菌落PCR分析显示以连接产物作为阳性对照扩增出1380 bp左右条带，以单菌落为模板扩增条带与阳性对照相符，以H2O为阴性对照的泳道没有扩增条带（图2B），说明重组质粒构建成功。激光共聚焦显微镜观察结果显示（图2C），带有RFP标签的AtPIP2A蛋白在细胞膜上检测到荧光，GmDUF247-1-GFP荧光与RFP荧光高度重合，表明GmDUF247-1定位在细胞膜。

图2  GmDUF247-1基因克隆及GmDUF247-1-GFP与AtPIP2A-RFP蛋白共定位分析

Fig. 2  Cloning of GmDUF247-1 and co-localization analysis of GmDUF247-1-GFP with AtPIP2A-RFP

A：GmDUF247-1基因PCR扩增结果，M：DL2000 Marker；1~5：GmDUF247-1基因扩增产物；B：GmDUF247-1-GFP重组载体菌落PCR鉴定；-：阴性H2O对照；+：连接产物对照，1~5：GmDUF247-1-GFP单菌落；C：GmDUF247-1-GFP与AtPIP2A-RFP蛋白在烟草细胞中的共定位

A： PCR amplification of GmDUF247-1 gene； 1-5： GmDUF247-1 PCR amplification product； B： Colony PCR identification of GmDUF247-1-GFP recombinant vector； -： Negative H2O control； +： Ligation product control， 1-5： GmDUF247-1-GFP single colony； C： GmDUF247-1-GFP co-localizes with AtPIP2A-RFP in tobacco leaves； GFP： Green fluorescent protein； RFP： Red fluorescent protein； Bright： Bright field； Merged： Merged image

2.3 GmDUF247-1基因组织表达模式分析

在SoyOmics网站调取GmDUF247-1基因在大豆不同组织中的转录组数据，发现其在花中表达量最高，其次是萌发期的根（图3A）。利用qRT-PCR技术分析GmDUF247-1基因在大豆根、茎、叶、荚和种子中的表达情况，结果如图3B所示，以10周种子中的表达量为1，GmDUF247-1基因在萌发期的根中表达量显著高于其他组织，约是10 周种子的15.8倍。表达量较高的组织还有2 周荚和种子、3 周荚和种子以及3 周种子，分别为10 周种子表达量的7.7、8.1和8.12倍，均达显著差异水平。除在3 周的种子中表达量较高外，其余组织表达模式与转录组测序结果基本一致，由此推测GmDUF247-1基因可能主要在大豆萌发期的根组织中发挥功能。

图3  GmDUF247-1基因在大豆不同组织中的表达模式

Fig.3  Expression pattern of GmDUF247-1 in different tissues of soybean

A：转录组测序数据分析GmDUF247-1基因在大豆不同组织的表达；B：qRT-PCR验证GmDUF247-1基因的组织表达模式；图中不同字母表示差异显著（P<0.05）；下同

A： Expression pattern of GmDUF247-1 in different tissues of soybean based on RNA-seq data； B： qRT-PCR assays of the tissue expression pattern of GmDUF247-1 in different tissues of soybean；Different letters in the figure indicate significant differences （P<0.05）；The same as below

2.4 GmDUF247-1基因盐碱胁迫表达模式分析

本研究对GmDUF247-1基因在60 mmol/L混合盐碱（NaCl∶Na2SO4∶NaHCO3∶Na2CO3按摩尔比1∶9∶9∶1配制，pH=8.9）处理下的表达量进行分析。结果显示在混合盐碱处理1 h时，GmDUF247-1基因的表达量显著下降至未处理时的0.2倍，并且这种下调表达趋势一直持续到胁迫处理的6 h（图4）。由此可见，混合盐碱胁迫抑制了GmDUF247-1基因表达，推测GmDUF247-1基因在大豆盐碱胁迫应答中可能发挥负调控作用。

图4  GmDUF247-1基因在混合盐碱胁迫下的表达模式

Fig. 4  Expression pattern of GmDUF247-1 under mixed salt-alkaline treatment

2.5 GmDUF247-1-3FLAG植物过表达载体构建和表达检测

为验证GmDUF247-1基因在盐碱胁迫应答中的功能，以pGreenII-GmDUF247-1-GFP质粒为模板，克隆GmDUF247-1基因CDS区并构建到植物表达载体pCAMBIA1300-3FLAG（图5A~B）。采用农杆菌注射烟草叶片48 h、60 h和72 h后检测GmDUF247-1-3FLAG蛋白表达。采用Anti-Flag抗体进行Western blot分析，在50 kDa蛋白marker附近检测到清晰的蛋白条带，与GmDUF247-1-3FLAG预期大小59 kDa相符。丽春红染色结果显示，在总蛋白浓度基本一致的情况下，注射烟草叶片72 h时蛋白表达量较高，说明GmDUF247-1在植物细胞中能够成功表达（图5C）。

图5  GmDUF247-1基因过表达载体构建和表达检测

Fig. 5  Construction of GmDUF247-1 overexpression vector and detection of GmDUF247-1-3FLAG protein expression

A：GmDUF247-1-3FLAG载体菌落PCR鉴定；-：阴性H2O对照；+：pGreen II-GmDUF247-1-GFP质粒；2：GmDUF247-1-3FLAG单菌落；B：GmDUF247-1-3FLAG蛋白在烟草叶片中的表达检测，Anti-FLAG：采用Anti-FLAG抗体Western Blot检测GmDUF247-1蛋白表达；Rubisco：丽春红染色确认总蛋白含量；+：CHYR16-3FLAG蛋白；WT：未注射的烟草叶片总蛋白；48 h、60 h、72 h：注射不同时间点的烟草叶片总蛋白

A： Colony PCR identification of GmDUF247-1-3FLAG recombinant vector； -： Negative H2O control； +： pGreen II-GmDUF247-1-GFP； 2： GmDUF247-1-3FLAG single colony； B： Identification of GmDUF247-1 protein expressed in tobacco leaves， Anti-FLAG： Western Blot assays with the anti-FLAG antibody to detect GmDUF247-1-3FLAG protein； Rubisco： Ponceau S staining showing the total protein concentration of different samples； +： CHYR16-3FLAG protein is used as a positive control； WT： Total proteins from un-infiltrated tobacco leaves； 48 h， 60 h， 72 h： Total proteins from infiltrated tobacco leaves at indicated time points

2.6 GmDUF247-1过表达大豆毛状根复合植株耐盐碱性分析

为初步分析GmDUF247-1基因在调控大豆混合盐碱胁迫耐性中的作用，本研究通过根癌农杆菌将空载体（EV，empty vector）和GmDUF247-1-3FLAG侵染大豆子叶节获得大豆毛状根复合植株。由图6A可知，以GmDUF247-1-3FLAG质粒为阳性对照，经PCR检测后，10株大豆毛状根中有9株检测到1380 bp目的条带，而水对照和空载体大豆毛状根没有条带，说明大豆毛状根侵染效率高且空载体不存在污染，可以进行大豆毛状根耐盐碱表型实验。

图6  大豆毛状根复合体植株耐盐碱性分析

Fig.6  Salinity tolerance analysis of soybean hairy root composite plants

A：大豆毛状根复合体植株PCR检测，M：DL2000 marker；-：H2O对照；+：GmDUF247-1-3FLAG质粒；EV：空载体大豆毛状根植株；1~10：过表达GmDUF247-1大豆毛状根植株；B：大豆毛状根复合体植株盐碱处理前后叶片形态和根部形态，对照：0 mmol/L混合盐碱处理，处理：60 mmol/L混合盐碱处理；C、D、E：大豆毛状根60 mmol/L混合盐碱处理下6 d的根长、株高和存活率相对生长量；本实验共计3次生物学重复，每次重复每个处理每个载体设置12个样本，***表示差异极显著（P<0.001）

A： PCR identification of soybean hairy root composite plants， M： DL2000 marker； -： H2O control； +： GmDUF247-1-3FLAG plasmid； EV： Empty vector soybean hairy root plant； 1-10： GmDUF247-1 overexpression soybean hairy root plants； B： Leaf morphology and root morphology of soybean hairy root composite plants before and after saline-alkali treatment， Control： 0 mmol/L mixed salt-alkaline treatment， Treatment： 60 mmol/L mixed salt-alkaline treatment； C，D，E： The relative growth of root length， plant height and survival rate of soybean hairy root composite plants under 60 mmol/L mixed salt-alkaline treatment for 6 days； Three biological replicates were performed with 12 plants from each vector and each treatment. *** indicates significant difference（P<0.001）

将培养4周的大豆毛状根复合植株移至含有1/4 Hoagland营养液中适应1 d，进行0和60 mmol/L混合盐碱处理。如图6B所示，未进行混合盐碱处理的空载体和GmDUF247-1-3FLAG对照植株长势正常，地上部和根系未展示出明显差异。在60 mmol/L混合盐碱处理6 d后，植株叶片出现黄化和萎蔫，但空载体植株长势明显优于GmDUF247-1-3FLAG毛状根植株；植株根部颜色变为褐色，根生长受到抑制，但空载体植株根部长势明显优于GmDUF247-1-3FLAG毛状根植株。对比处理下的大豆毛状根复合植株的根长和株高相对生长量显示，空载体植株的根长相对生长量平均为6.99%，而GmDUF247-1-3FLAG植株则为3.44%，极显著低于空载体对照（图6C）。空载体植株的株高相对生长量平均为4.67%，而GmDUF247-1-3FLAG植株则为2.9%，极显著低于空载体对照（图6D）。对60 mmol/L混合盐碱处理6 d后的大豆毛状根复合体植株的存活率进行统计，发现空载体植株存活率为97%，而GmDUF247-1-3FLAG植株则为67%，极显著低于空载体对照（图6E）。以上数据表明GmDUF247-1负调控大豆毛状根植株对混合盐碱胁迫的耐性。

2.7 GmDUF247-1基因在大豆自然群体中的单倍型分析

在SoyOmics数据库检索3000份大豆种质中GmDUF247-1基因5′UTR前2000 bp启动子区和CDS区单倍型。发现GmDUF247-1启动子存在8个SNPs和4个InDels变异导致bHLH、NAC、CPP、MIKC-MADS等转录因子识别的元件序列发生改变（图7A）。bHLH、NAC转录因子被报道参与逆境胁迫应答，CPP、MIKC-MADS转录因子多参与生长发育调控，推测这些变异可能在大豆逆境胁迫和生长发育过程中发挥不同作用。从不同单倍型在大豆种质分布的饼状图分析可知，野生大豆种质中序列变异较大，栽培大豆中变异较小（图7B）。其中H1单倍型仅存在于野生大豆中，约占野生大豆种质的27.2%。在地方品种和选育品种中则主要为H4单倍型，占比分别为83.72%和83.51%。

图7  GmDUF247-1基因在大豆种质中单倍型分析

Fig.7  Haplotype analysis of GmDUF247-1 in soybean germplasms

A：GmDUF247-1启动子区单倍型分析，bHLH：碱性螺旋―环―螺旋转录因子，Dof：单锌指结构蛋白，MYB（v-mybavian myeloblastosis viral oncogene homolog），ERF：乙烯响应因子，TALE：转录激活因子类效应因子，CPP：富含半胱氨酸的多梳样蛋白，MIKC_MADS：MIKC型MADS盒转录因子，ARF：生长素响应因子；B：GmDUF247-1启动子单倍型分布；C：GmDUF247-1 CDS区单倍型分析；D：GmDUF247-1 CDS单倍型分布

A： GmDUF247-1 promoter region haplotype analysis， bHLH： basic helix-loop-helix， Dof： DNA binding with one finger， MYB： v-mybavian myeloblastosis viral oncogene homolog， ERF： Ethylene response factor， NAC： NAM， ATAF1/2， CUC1/2， TALE： Transcription activator-like effector， C2H2： C2H2-type zinc finger transcription factor， CPP： Cysteine-rich polycomb-like protein， MIKC_MADS： MIKC-type MADS box transcription factor， ARF： Auxin response factor； B： Haplotype distribution in the promoter region of GmDUF247-1； C： Analysis of haplotypes in the CDS region of GmDUF247-1； D： Haplotype distribution in the CDS region of GmDUF247-1

GmDUF247-1基因外显子处发生2个非同义突变，形成3种不同单倍型（图7C）。其中SNP1单碱基的改变导致编码氨基酸由缬氨酸（Val）变为甲硫氨酸（Met），SNP2单碱基的改变导致编码氨基酸由亮氨酸（Leu）变为甲硫氨酸（Met）。对不同单倍型在大豆种质中的分布分析发现，野生大豆材料中多为H2单倍型，地方品种和选育品种中则主要为H1单倍型（图7D），表明GmDUF247-1编码区H1单倍型在驯化过程中受到了强烈人工选择。

3 讨论

国内外研究人员已挖掘到多个负调控大豆耐盐性基因GmCDF1［

13］、GmMYB3a［29］、GmERF105［30］。目前对大豆耐盐碱基因的研究多以调控单盐［11-13， 31-32］和单碱［33-34］耐性为主，对调控混合盐碱胁迫耐性的研究较少［35］。在自然生长条件下，土壤盐化和碱化往往相伴发生，对大豆造成的危害相较单一的盐或碱胁迫更为严重［5］。随着基因编辑技术的迅速发展和应用，挖掘负调控大豆耐混合盐碱性的基因，利用基因编辑系统对目标基因进行敲除，对于加速大豆耐混合盐碱新品种培育和苏打盐碱地开发利用具有重要意义［36］。本研究发掘鉴定的负调控大豆耐盐碱基因GmDUF247-1，将是利用基因敲除改良大豆耐盐碱性的候选靶点。

研究发现含有DUF247结构域的大麦根部特异性基因HvSR1（Salt responsive gene 1）［

16］和中间锦鸡儿CiDUF247-1基因受中性盐胁迫诱导显著上调表达，可能在中性盐胁迫响应中发挥重要作用［14］。值得注意的是，本研究发现GmDUF247-1在混合盐碱处理时显著下调，其过表达降低了大豆毛状根复合体植株对混合盐碱胁迫（包括中性盐NaCl、Na2SO4和碱性盐Na2CO3、NaHCO3）的耐性。混合盐碱的盐分组成复杂，除含有过量Na+以外，还含有高浓度HCO3-/CO32-/SO42-。大豆不仅面临离子毒害、渗透胁迫和高pH毒害，还需面对HCO3-带来的危害。研究发现植物通过不同的途径响应盐胁迫和碱胁迫。例如同源异型亮氨酸拉链蛋白（homeodomain-leucine ZIPper）家族成员Gshdz4过表达可提高拟南芥对HCO3-胁迫的耐受性，而在高pH（OH-）胁迫下不发挥功能［37］。GmDUF247-1如何调控混合盐碱胁迫应答，是否参与盐碱胁迫下离子平衡、高pH调节等生理过程尚不明确。后续将对其在4种单盐处理下的表型、Na+/K+含量、抗氧化酶活性等指标进行分析，从生理水平上解析其在盐碱胁迫下的生理功能。此外，本研究通过亚细胞定位发现GmDUF247-1定位在细胞膜上，但其调控胁迫应答的分子机制还有待进一步解析。

基因序列的多态性导致物种遗传的多样性，是作物改良的关键，其中单碱基的改变是较为常见的遗传变异［

38］。野生大豆（Glycine soja）是栽培大豆的野生近缘种，耐盐碱性高于栽培大豆［6］。本研究发现GmDUF247-1启动子区存在8个SNPs和4个InDels变异，可能导致与逆境应答和生长发育相关转录因子识别的元件序列发生改变。研究发现，启动子区的序列变异通常影响基因表达水平，造成不同种质中基因功能的变异［12-13］。对不同单倍型在大豆种质中的分布进行分析，H1单倍型仅存在于野生大豆中，H4单倍型主要存在于栽培品种中，表明GmDUF247-1启动子H4受到了人工选择。未来研究中将深入探讨H4单倍型是否导致GmDUF247-1表达水平高于H1，是否与大豆耐盐碱性状相关。GmDUF247-1基因CDS区存在2个非同义突变，形成3种单倍型。野生大豆中多为H2单倍型，栽培大豆中为H1单倍型，表明GmDUF247-1H1受到了人工选择。本研究在栽培大豆DN50中克隆并初步验证GmDUF247-1H1负调控大豆毛状根植株耐盐碱性，但野生大豆中GmDUF247-1H2基因型在大豆盐碱应答中的功能还不明确，后续将对GmDUF247-1H2基因型耐盐碱功能做进一步研究。研究发现，作物生长发育和产量性状与非生物胁迫耐性常常存在权衡折衷trade-off效应［39-41］。因此推测GmDUF247-1H1虽然负调控大豆耐混合盐碱性，但可能与大豆的生长发育和产量性状有关。下一步本研究将采用基因编辑技术敲除大豆GmDUF247，调查基因敲除株系耐盐碱性、农艺和产量性状等，创制耐盐碱大豆新种质资源。

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